劉 嬌 梁 瀟 胡 濤 阮婧華 錢海兵*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州省中醫(yī)藥方證藥理研究特色重點實驗室，貴州 貴陽 5500253.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001

駑藥液是貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科實驗室依據(jù)多年的臨床實踐經(jīng)驗，選用大血藤、飛龍掌血、透骨香、白屈菜、黑骨藤5味天然草藥組成，在臨床上尤其是苗族地區(qū)被廣泛用于治療膝骨性關(guān)節(jié)炎等疾病，效果良好，副作用較小[1]。現(xiàn)代研究[2-5]證明，駑藥液中大血藤水提物、乙酸乙酯部位及多糖對膠原性炎癥、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等炎癥有治療作用，醇提物中綠原酸被認(rèn)為是大血藤發(fā)揮抗炎作用的指標(biāo)性成分。飛龍掌血中有14個生物堿類成分被認(rèn)為是其發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵活性成分，其中弗林德堿、白屈菜紅堿被報道具有顯著抗炎作用，對佐劑性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及心肌缺血性炎癥有治療作用[6-10]。透骨香醇提部位和水提部位及揮發(fā)油對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和膠原型關(guān)節(jié)炎有抑制作用，其中水楊酸甲酯和兒茶素是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵活性成分[11-14]。白屈菜中生物堿類成分有一定的抗炎作用，對軟組織損傷、潰瘍性腸炎有一定的治療作用[15-17]；黑骨藤醇提物中咖啡?；鼘幩犷惢衔锞哂幸种迫祟愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞(MH7A細胞)增殖的作用，甾類、萜類、黃酮類，包含杠柳毒甙、蘿藦苷元、熊果酸、胡蘿卜甙等10種活性成分被預(yù)測為是治療RA的活性成分[18-19]。

根據(jù)前期研究，實驗旨在進一步運用二甲苯致小鼠耳腫脹和角叉菜膠致大鼠足腫脹方法驗證由大血藤、透骨香、白屈菜、飛龍掌血和黑骨藤組成的駑藥液的抗炎作用，以期為開發(fā)運用于臨床治療炎癥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 Wistar大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量為180～220 g；KM小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量為18～22 g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物合格證號為 SCXK(湘)2019-0014，許可證號為 No.430726210100136331。所有動物均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物及試劑 駑藥液(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗室自制，批號： 20210525)；二甲苯(重慶川東化工有限公司 AR)；角叉菜膠(阿拉丁)；腫瘤壞死因子- α (TNF- α)、前列腺素E2(PGE2)、白細胞介素- 6(IL- 6)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒均購自武漢伊萊瑞特科技股份有限公司。

1.3 儀器 游標(biāo)卡尺；酶標(biāo)儀；精密分析天平(常熟市雙杰測試儀器廠 JJ224BF)；XK-400高速離心機(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)；8mm打孔器；烘箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 GZX-9240MBE)。

2 方法

2.1 駑藥液的制備 由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗室自制。以原藥液作為高劑量，加0.9%生理鹽水稀釋2倍和4倍分別作為中劑量組和低劑量組。

2.2 動物模型建立、分組及給藥

2.2.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗 選取實驗室飼養(yǎng)1周的KM小鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組，每組各10只，分別為模型組、對照組和駑藥液高、中、低劑量組。實驗前對小鼠腹部進行備皮，備皮區(qū)域為2 cm×2 cm，每日涂抹藥液2次(早晚各1次)，連續(xù)給藥7 d，模型組涂抹等體積蒸餾水。末次給藥1 h后，于小鼠右耳兩面均勻涂二甲苯 0.05 mL/只致炎，左耳不涂為正常耳。致炎1 h后頸椎脫臼處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，用8 mm打孔器在兩耳對稱取耳片，于分析天平上稱重，以左右耳片質(zhì)量差值表示炎癥腫脹度，計算抑制率。

腫脹度(mg)=右耳片重量-左耳片重量

抑制率(%)=(模型組腫脹度-給藥組腫脹度)/模型組腫脹度×100%

2.2.2 角叉菜膠致大鼠足腫脹實驗 選取實驗室飼養(yǎng)1周的Wistar大鼠30只， 雌雄各半，隨機分為5組，每組各6只，分別為空白組、模型對照組和駑藥液高、中、低劑量組。實驗前對大鼠腹部進行備皮，備皮區(qū)域為2 cm×2 cm，每日涂抹藥2次(早晚各1次)，連續(xù)給藥7 d，空白組和模型組涂抹等體積蒸餾水。末次給藥后1 h，游標(biāo)卡尺測量小鼠正常足掌厚度，作為實驗前足腫脹度，每只小鼠右后肢足爪皮下注射0.1%角叉菜膠0.1 mL/只致炎。并于注射后第1小時、2小時、4小時、6小時分別測量1次，記錄結(jié)果，計算腫脹度。

腫脹度(mm)=致炎后足腫脹度-致炎前足腫脹度

2.3 大鼠血清中TNF- α、PGE2、IL- 6水平測定 腫脹度測量結(jié)束后，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)進行麻醉。實驗大鼠在麻醉狀態(tài)下進行腹主動脈取血，室溫靜置 30 min 使血液分層。6000 r/min 下離心 10 min，分裝血清，按試劑盒說明書操作檢測血清中炎癥因子 TNF-α、PGE2、IL-6 含量。在 550 nm 的波長下測量各孔 OD 值即吸光度，繪制酶標(biāo)曲線，計算樣本濃度。

3 結(jié)果

3.1 駑藥液對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 二甲苯致炎后各組小鼠右耳隨即出現(xiàn)高度紅腫現(xiàn)象。與模型組比較，駑藥液高劑量組、駑藥液中劑量組和駑藥液低劑量組對二甲苯致小鼠耳廓腫脹均有抑制作用，抑制率分別為33.00%、29.00%、23.00%(P<0.05)。腫脹抑制率隨駑藥液給藥劑量的增加逐漸升高(見表1)，說明駑藥液的抗炎作用具有一定的量效關(guān)系。

表1 駑藥液對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

3.2 駑藥液對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響 與空白組相比，模型組大鼠在注射角叉菜膠1 h、2 h、4 h、6 h后，1～6 h內(nèi)足腫脹度明顯，在4 h時到達最大值，有顯著性差異(P<0.05)，模型建立成功；與模型組相比，在0～1 h、2～6 h 內(nèi)，駑藥液高、中、低劑量組對均能顯著的抑制大鼠足腫脹(P<0.05)，效果不持續(xù)(見表2)。

表2 駑藥液對腳叉菜膠致大鼠足腫脹的影響

3.3 駑藥液對角叉菜膠致大鼠足腫脹血清TNF- α、PGE2、IL- 6水平的影響 與空白組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、PGE2、IL-6水平含量明顯升高，有顯著性差異(P<0.05)；與模型組比較，駑藥液高劑量、駑藥液中劑量及駑藥液低劑量對大鼠血清中IL-6水平有明顯的抑制作用，有顯著性差異(P<0.05)；駑藥液高劑量和駑藥液低劑量對大鼠血清中PGE2水平有明顯的抑制作用，有顯著性差異(P<0.05)，駑藥液中劑量對大鼠血清中PGE2水平無影響。駑藥液高劑量、駑藥液中劑量和駑藥液低劑量對大鼠血清中TNF-α水平無影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 駑藥液對角叉菜膠致足腫脹大鼠血清中IL-6、TNF-α、PGE2 含量的影響

4 討論

苗醫(yī)藥講究將藥物分為： 領(lǐng)頭藥(主藥： 針對主要癥狀發(fā)揮主要作用)、鋪底藥(配藥： 針對次要病癥和次要癥狀，加強主藥作用)、監(jiān)護藥(引藥： 促進領(lǐng)頭藥和監(jiān)護藥的藥性，到達病變部位)，與中藥組方配伍中“ 君、臣、佐、使”有異曲同工之妙。駑藥液由大血藤、飛龍掌血、透骨香、白屈菜、黑骨藤五味苗藥組成，臨床上常用于治療膝骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，駑藥液中領(lǐng)頭藥當(dāng)數(shù)黑骨藤，以舒筋活血，祛風(fēng)除濕；其中鋪底藥為大血藤、黑骨藤、透骨香等，加強領(lǐng)頭藥的祛風(fēng)除濕的功效，兼?zhèn)浠钛猍20]。現(xiàn)代研究顯示，駑藥液中大血藤醇提物，飛龍掌血、白屈菜的生物堿，透骨香、黑骨藤醇提物等具有良好的抗炎作用[5-6,21-23]。本實驗主要從駑藥液的抗炎作用方面進行探究，采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠致大鼠足腫脹實驗?zāi)Ｐ蛠沓醪教接戱w藥液的抗炎作用。

二甲苯致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠致大鼠足腫脹實驗結(jié)果表明，與模型組比較，駑藥液能降低小鼠耳廓腫脹程度與大鼠足腫脹的程度。PGE2屬于花生四烯酸代謝產(chǎn)物，由炎癥反應(yīng)刺激后產(chǎn)生，可導(dǎo)致發(fā)熱、疼痛、血管擴張、通透性升高等炎癥反應(yīng)；細胞因子IL-6可引起急性炎癥的發(fā)熱，實驗結(jié)果表明，駑藥液對大鼠血清中IL-6和PGE2產(chǎn)生有抑制作用，對TNF-α無影響。二甲苯和角叉菜膠能通過化學(xué)刺激，引起局部血管擴張、通透性增加，進而引起局部滲出、水腫，屬急性和亞急性炎癥反應(yīng)，駑藥液發(fā)揮抗炎作用的機制可能與抑制促炎因子IL-6和PGE2表達有關(guān)。

綜上，駑藥液對急性或亞急性炎癥有良好的作用，為其臨床主要應(yīng)用于膝骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療提供了一定的藥理學(xué)研究基礎(chǔ)。