程陳凱，楊 威，李 想，楊 婕，王俊東，張建海

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801）

氟在自然界中分布廣泛，主要應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域［1］。過(guò)量攝入氟不僅會(huì)導(dǎo)致氟斑牙和氟骨癥，還會(huì)損害肝臟、腎臟、腸道等軟組織［2-5］。腎臟是機(jī)體主要的排泄器官，氟主要通過(guò)尿液排出體外，易加重對(duì)腎臟的損傷。核黃素（riboflavin）是黃素腺嘌呤二核苷酸的中心成分，其在細(xì)胞功能、生長(zhǎng)發(fā)育和能量代謝中起著關(guān)鍵作用［6-7］。王國(guó)光等［8］發(fā)現(xiàn)，核黃素可以通過(guò)抗氧化作用來(lái)實(shí)現(xiàn)延緩鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病的發(fā)展進(jìn)程。白細(xì)胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）是一類(lèi)促炎細(xì)胞因子，主要參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用［9］。實(shí)驗(yàn)室前期的研究證實(shí)，IL-17A在氟中毒所致的小鼠肝臟、睪丸和腸道等組織損傷中起重要作用［4，10］。因此，本試驗(yàn)構(gòu)建了核黃素干預(yù)IL-17A-/-氟中毒小鼠的模型，通過(guò)蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色、馬松（Masson）染色，以及血清腎臟功能指標(biāo)肌酐（creatinine，Cr）、尿酸（uric acid，UA）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的檢測(cè)，探究核黃素在正常和IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟纖維化中的影響，為氟中毒的診斷和干預(yù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

氟化鈉、苯胺藍(lán)、酸性品紅、麗春紅、磷鉬酸購(gòu)自天津市化學(xué)試劑三廠(chǎng)；核黃素磷酸鈉購(gòu)自北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HE試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Cr、UA、BUN試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司。冰醋酸、無(wú)水乙醇等均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取體重相近的6周齡的野生型（wild type，WT）和IL-17A-/-C57BL/6J雄性小鼠（Mus musculus），各32只，分別分成4組，每組8只小鼠：1）對(duì)照組（Ctrl，0.9% NaCl）；2）氟化鈉組（NaF，24 mg/kg NaF）；3）核黃素組（Ribo，5 mg/kg 核黃素磷酸鈉）；4）氟化鈉+核黃素組（NaF+Ribo，24 mg/kg NaF+ 5 mg/kg核黃素磷酸鈉）。每組小鼠進(jìn)行連續(xù)灌胃90 d。

1.3 樣本采集和前處理

采集血液，離心取上清液保存于-80℃冰箱，用于 Cr、UA、BUN的檢測(cè)。每組取3只小鼠的左腎固定于4%多聚甲醛溶液，用于組織形態(tài)學(xué)和纖維化的檢測(cè)。

1.4 腎臟臟器指數(shù)測(cè)定

稱(chēng)取小鼠的體重和腎臟的質(zhì)量，計(jì)算腎臟臟器指數(shù)：臟器指數(shù)=臟器濕重（g）/體重（g）×100%。

1.5 HE染色

腎臟組織包埋切片后，蘇木精染液染色1 min，鹽酸酒精分化1 min，伊紅染液染色3 min，梯度酒精脫水，利用二甲苯使之透明后封片，在光學(xué)顯微鏡下鏡檢觀察腎臟形態(tài)學(xué)變化。

1.6 Masson染色

腎臟組織包埋切片后，用Weigert鐵蘇木素染液染色7 min，充分水洗分化，麗春紅酸性品紅復(fù)合液染色1 min，磷鉬酸分化7 min，苯胺藍(lán)染液倒進(jìn)倒出，1%冰醋酸分化1 min，梯度酒精脫水，利用二甲苯使之透明后封片，在光學(xué)顯微鏡下鏡檢觀察腎臟纖維化狀況。

1.7 血清腎臟功能指標(biāo)檢測(cè)

使用試劑盒對(duì)小鼠血清中的腎臟功能指標(biāo)（Cr、UA、BUN）含量進(jìn)行測(cè)定，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。差異顯著性利用one-way analysis of variance（ANOVA）進(jìn)行分析，*P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 核黃素對(duì)IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟臟器指數(shù)的影響

各組小鼠腎臟臟器指數(shù)如圖1所示，在核黃素干預(yù)氟中毒90 d之后，無(wú)論是WT小鼠，還是IL-17A-/-小鼠，各組之間的腎臟臟器系數(shù)均沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）。

圖1 核黃素對(duì)IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟臟器指數(shù)的影響（n=8）Fig. 1 Effects of riboflavin on kidney coefficient of IL-17A-/- mice induced by fluoride (n=8)

2.2 核黃素對(duì)IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響

各組小鼠腎臟組織形態(tài)變化如圖2如示，在WT小鼠中，Ctrl組腎小球的結(jié)構(gòu)清晰完整，腎小管排列較為整齊，基底膜完整和突出，管腔間隙正常，沒(méi)有明顯的組織病變發(fā)生。NaF組中腎小球結(jié)構(gòu)變大且變得模糊，腎小管上皮細(xì)胞排列紊亂、管腔變窄。Ribo組腎小球結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列緊湊且有規(guī)律。NaF+Ribo組中的腎小球結(jié)構(gòu)變得清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列變得規(guī)則，管腔增寬。而在IL-17A-/-小鼠中，與Ctrl組相比，NaF組腎小球變大，腎小管排列變得紊亂，Ribo組無(wú)明顯變化，與NaF組比較，NaF+Ribo組的腎臟結(jié)構(gòu)明顯變得清晰，腎小球變小，腎小管排列整齊，腎臟形態(tài)病變得到改善。

圖2 核黃素對(duì)IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響Fig. 2 Effects of riboflavin on renal histomorphology in IL-17A-/- mice induced by fluoride

2.3 核黃素對(duì)IL-17A-/-氟中毒小鼠血清Cr、UA 和BUN的影響

如圖3a所示：在WT小鼠中，與Ctrl組相比，各處理組的血清Cr水平明顯上升（P＜0.05）；在IL-17A-/-小鼠中，與Ctrl組相比，各組之間的血清Cr水平?jīng)]有明顯變化（P＞0.05）。如圖3b和3c所示：與WT小鼠Ctrl組相比，NaF組的血清UA和BUN水平均顯著升高（P＜0.05）；而在IL-17A-/-小鼠中，各組之間的UA和BUN水平均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖3 核黃素對(duì)IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟功能的影響（n=6）Fig. 3 Effects of riboflavin on renal function of IL-17A-/- mice induced by fluoride (n=6)

2.4 核黃素對(duì)IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟纖維化的影響

Masson染色可以直觀反映出小鼠腎臟纖維化的程度，膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維和胞質(zhì)呈紅色。由圖4可知，在WT小鼠中，Ctrl組小鼠腎臟組織腎小球、基底膜結(jié)構(gòu)完整，纖維化程度低。與Ctrl組相比，NaF組出現(xiàn)大面積的藍(lán)染，膠原纖維沉積較多，呈現(xiàn)纖維化，而Ribo組以及NaF+Ribo組未出現(xiàn)大面積藍(lán)染明顯的膠原沉積現(xiàn)象，纖維化程度較輕。在IL-17A-/-小鼠中，與Ctrl組相比，NaF組的藍(lán)色膠原纖維沉積較多、纖維化程度加重，Ribo組無(wú)明顯變化，與NaF組相比，NaF+Ribo組中的藍(lán)色膠原沉積減少，纖維化程度減輕。與WT小鼠相比，IL-17A-/-小鼠各組的膠原纖維沉積減少，腎臟纖維化程度降低。

圖4 核黃素對(duì)IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟組織纖維化的影響Fig. 4 Effects of riboflavin on renal fibrosis in IL-17A-/- mice induced by fluoride

3 討論

腎臟纖維化是腎臟功能逐漸損傷到喪失的一個(gè)過(guò)程。氟可以引起機(jī)體氧化應(yīng)激，導(dǎo)致腎臟纖維化［11］。作為一種廣泛存在的維生素，核黃素具有強(qiáng)的抗氧化作用，而IL-17A在腎臟纖維化過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用［6,12］。我們構(gòu)建核黃素干預(yù)IL-17A-/-氟中毒小鼠模型，探究核黃素在氟致腎臟結(jié)構(gòu)功能損傷及纖維化中的潛在保護(hù)作用。

腎臟的臟器指數(shù)是反映腎臟生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，氟、核黃素以及IL-17A-/-均未對(duì)腎臟生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。長(zhǎng)期氟暴露會(huì)損壞腎臟的組織結(jié)構(gòu)［3］。本試驗(yàn)中，氟暴露同樣引起了小鼠腎臟腎小管排列紊亂和管腔變小等形態(tài)學(xué)病變。添加核黃素之后，腎小管排列變得整齊，管腔增大，而IL-17A敲除以后，各組的腎臟組織的形態(tài)損傷得到緩解，表明核黃素在氟導(dǎo)致小鼠腎臟組織形態(tài)損傷中起著重要的緩解作用，且核黃素在IL-17A-/-小鼠中的緩解效果更明顯。

血清中Cr、UA和BUN是臨床上檢驗(yàn)?zāi)I臟功能的常用指標(biāo)，當(dāng)腎臟功能受損時(shí)，這三個(gè)指標(biāo)含量都會(huì)上升［13-14］。研究表明，氟暴露會(huì)引起ICR雄鼠Cr、UA、BUN的含量明顯上升［15］。在本試驗(yàn)中，氟同樣引起了小鼠血清Cr、UA、BUN的上升，而單獨(dú)補(bǔ)充核黃素以及氟和核黃素共處理后，也引起了Cr的上升，但是對(duì)UA和BUN沒(méi)有影響。 Mehrotra等［16］發(fā)現(xiàn)IL-17A的活化會(huì)加速腎臟的損傷進(jìn)程。本試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在敲除IL-17A后，各組小鼠血清之間的Cr、UA和BUN含量均無(wú)明顯變化，進(jìn)一步證明了核黃素在IL-17A-/-小鼠氟中毒引起的腎臟功能損傷中未起到明顯的緩解效果。

Kido等［11］發(fā)現(xiàn)SD大鼠（Rattus norregicus）飲用150 mg/L NaF 14 d，可加重單側(cè)輸尿管梗阻引起的腎臟纖維化程度。在本試驗(yàn)中，氟同樣會(huì)引起正常小鼠膠原纖維的沉積，誘導(dǎo)腎臟纖維化，這與前人的結(jié)果一致。添加核黃素后，膠原纖維沉積減少，纖維化程度降低，表明核黃素能夠減輕氟引起的腎臟纖維化。據(jù)報(bào)道，IL-17A可以調(diào)節(jié)各種纖維化信號(hào)通路，促進(jìn)腎臟纖維化的進(jìn)程［17-19］。本試驗(yàn)中，敲除IL-17A之后，和WT小鼠相比，各組腎臟纖維化程度減輕，表明核黃素可以緩解氟致IL-17A-/-小鼠的腎臟纖維化程度，且緩解效果要好于野生型的小鼠。

綜上所述，核黃素對(duì)氟中毒引起的IL-17A-/-小鼠腎臟組織形態(tài)損傷和纖維化程度有著積極的緩解作用，且緩解效果要優(yōu)于野生型的小鼠，其具體的分子機(jī)制值得我們深入研究。