帶狀皰疹 (herpes zoster, HZ) 是由潛伏在背根神經節(jié)、半月神經節(jié)或自主神經節(jié)中的水痘-帶狀皰疹病毒 (varicella zoster virus, VZV) 在機體疲勞、精神壓力過大、全身性疾病、創(chuàng)傷等危險因素刺激下重新激活導致感覺神經受損，并伴有神經性疼痛的感染性皮膚病

。據報道，世界上有15%～30%的人一生中至少會患一次帶狀皰疹

，13.3%～42.2%的帶狀皰疹病人會出現帶狀皰疹后神經痛 (postherpetic neuralgia, PHN)，表現為典型的神經病理性疼痛，且疼痛持續(xù)時間長，可從數月到數年，平均持續(xù)時間為3.3 年

。PHN 作為HZ 最常見和最嚴重的合并癥

，往往由于長期的疼痛和伴隨的焦慮、抑郁心理問題，嚴重降低病人的生活質量。雖然近些年對PHN 的分子機制研究有了較深的研究，其可能涉及背根神經節(jié)炎癥、神經炎癥、感覺神經根軸突和髓鞘缺失、纖維化和中樞敏化、外周敏化、神經去傳導，但其具體發(fā)病機制尚未完全闡明，致使臨床上有效或徹底根治PHN 的治療方法較少。因此，探究帶狀皰疹神經痛發(fā)生發(fā)展的分子機制，將有利于我們對疾病本身的認識，同時給臨床診治提供指導。

基因測序和生物信息學分析已經被廣泛應用于疾病的分子機制研究。微小RNA (microRNA,miRNA)作為一種內源性、低分子量、單鏈結構的非編碼RNA，在人體液中含量豐富，通過結合轉錄mRNA 的特異性靶點而影響下游基因的表達，參與帕金森病、癌癥、炎癥性腸病、心血管疾病、糖尿病等多種疾病的病理生理過程和發(fā)病機制，并在其預防和治療方面有著重要臨床意義

。有研究表明

，miRNA 在神經系統(tǒng)的感覺器官中高度表達，如背根神經節(jié)和脊髓背角，且通過調節(jié)炎癥因子、離子通道和調控免疫平衡參與神經病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展，特別是水痘-帶狀皰疹病毒 (varicella zoster virus, VZV) 編碼的多種miRNA 可能參與調節(jié)宿主細胞的感染，并與PHN 的發(fā)生過程密切相關。目前的研究大多關注于個別miRNA 對mRNA的調節(jié)作用，且大多數miRNA 與mRNA 之間的相互作用關系仍不清楚，特別是miRNAs 介導的帶狀皰疹神經痛miRNA-mRNA 調控網絡的構建尚未見有研究報道。因此，有必要構建帶狀皰疹神經痛miRNA-mRNA 調控網絡，探討miRNA 與mRNA之間在帶狀皰疹神經痛方面的相互作用關系。本研究以miRNAs 為基礎，利用生物信息學方法構建miRNA-mRNA 調控網絡，篩選關鍵的miRNA-mRNA調控關系對，探討miRNA 與其靶基因在帶狀皰疹相關神經痛分子調控機制中的作用，為靶向治療帶狀皰疹相關神經痛提供理論參考和科學依據。

方 法

1.材料

采用美國國立生物技術信息中心(NCBI)的基因表達綜合數據庫（GEO 數據庫https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取VZV 感染的人神經母細胞瘤細胞 (SH-SY5Y) 轉錄組測序數據(GSE141932)。其包含3 例未感染VZV 樣本和6 例感染VZV 樣本的mRNA 表達數據，其中3 例未感染VZV 樣本納入對照組，6 例感染VZV 樣本納入實驗組，對兩組測序數據通過平臺文件轉換為標準基因名稱，構建mRNA 表達矩陣和歸一化整理。

本文提出基于LabVIEW的模擬調制系統(tǒng)設計。用LabVIEW實現模擬調制并將各系統(tǒng)進行程序管理，生成適合用戶使用的界面。由于LabVIEW可以用來創(chuàng)建通用的程序，在測試、測量和自動化領域具有更大的優(yōu)勢，它提供了大量的工具與函數用于數據采集、分析、顯示和存儲。虛擬儀器與傳統(tǒng)儀器相比，可以在數分鐘內完成一套完整的從儀器連接、數據采集到分析、顯示和存儲的自動化測試測量系統(tǒng)。

當馬老師給我描述李之恒家里多窮，他是多么努力，多么有出息的時候，我走神了。如果現在叫我去努力回憶李之恒是個什么樣的人，我眼前浮現的形象卻是我大學一個室友的模樣。

2.差異基因的篩選

根據《環(huán)境空氣質量標準（AQI）》（GB3095—2012）（環(huán)境保護部，2012）和相關研究（顧康康等，2018），將 PM2.5日平均濃度<35 μg·m-3、35~75μg·m-3和>75 μg·m-3分別定義為輕度、中度和重度污染濃度水平。同時，將O3-8 h-max（O3最大8 h平均濃度值）按照濃度水平進行分級，也分為輕度、中度和重度3個等級，分別對應100~160 μg·m-3、160~200 μg·m-3和>200 μg·m-3（楊書申等，2016）。污染程度劃分等級后，可用于計算不同級別 PM2.5和O3各占季節(jié)總日數的比例，其公式為：

在雁北和呂梁山區(qū)，人們賦予吃莜面栲栳栳以“牢靠”“和睦”等美好象征。每逢老人壽誕、小孩滿月或逢節(jié)待客，多以此進餐。山區(qū)有些人家婚配嫁娶時，新郎新娘也要吃，意謂夫妻白頭到老。年終歲末時更要吃，以祈全家和睦、人運亨通。栲栳栳的制作方法并不復雜，但入口卻筋道爽口，有一股濃濃的莜面清香，可沾醬料食用，也可以與其它蔬菜肉類同炒，風味獨特。

3. miRNA-mRNA 網絡構建

通過miRNet 在線數據庫，共篩選出46 個miRNAs。預測miRNAs 下游靶基因，并與DEGs取交集得到123 個靶基因，構建miRNA-mRNA 可視化調控網絡（見圖3）。其中，miRNA-34c 和miRNA-320a 參與IL6R、FOSL1、ALDOA、PAX5、STX1A、LDHA、PLK3、NPAS2等靶基因的表達上調，miR-107、miR-183、miR-98、mir-182、mir-27b 參與PARM1、MAPK4、PBX1、SLIT2、SCHIP1、HOXA5、ACTRT3 等靶基因的表達下調。

4. miRNA 上游轉錄因子預測和GO 分析

FunRich 軟件提供轉錄因子、途徑、生物過程、細胞成分、分子功能和蛋白質相互作用等注釋，利用該軟件對miRNA-mRNA 網絡中的miRNAs 進行上游轉錄因子(transcription factor, TF)預測和GO 注釋分析，閾值

＜ 0.05。

利用R 軟件limma_3.46.0 包對構建的mRNA表達矩陣整理分析，得到差異表達基因 (differentially expressed genes, DEGs)，繪制火山圖并使用pheatmap_1.0.12 包繪制DEGs 熱圖。DEGs 篩選條件：①取mRNA 差異表達變化倍數 (fold change, FC)，|log

FC| ＞ 1；②adjusted

＜ 0.05。

5.靶基因功能富集分析

對構建miRNA-mRNA 網絡的靶基因ID 轉換后，通過clusterProfiler 包和pathview 包進行GO 和KEGG 通路富集分析，閾值

＜ 0.05。

6.蛋白質互作網絡建立與分析

雖然MicroRNA 已經被證實與PHN 的發(fā)生機制及預后密切相關，并在PHN 病人的皮膚病變組織和血清中發(fā)現了幾種異常表達的miRNAs

，但目前大多數miRNAs 與mRNA 的相互作用關系尚未完全闡明，特別是帶狀皰疹神經痛相關的miRNA-mRNA調控網絡的構建未見有研究報道，構建帶狀皰疹相關神經痛miRNA-mRNA 調控網絡可為深入研究其分子發(fā)病機制提供重要的理論參考和科學依據。

結 果

1.差異基因的篩選

共篩選到差異表達基因 (differentially expressed genes, DEGs) 1250 個，其中719 個基因表達上調，531個基因表達下調，繪制火山圖和DEGs的熱圖（見圖1、2），可見對照組和實驗組之間有明顯差異。

2. miRNA-mRNA 網絡構建

miRNet 數據庫是一個高質量的數據預測平臺(https://www.mirnet.ca)，它同時收錄miRTarBase、TarBase、miRanda 等多個數據庫信息

。本研究通過miRNet 在線數據庫篩選神經病理性疼痛、帶狀皰疹后神經痛、疼痛、慢性疼痛、慢性炎性疼痛、神經炎癥相關的miRNAs。通過FunRich_3.1.3軟件進行miRNAs 下游靶基因預測。預測得到的miRNAs 下游靶基因與DEGs 取交集，獲得miRNA-mRNA 關系對，并利用Cytoscape_3.8.1 軟件構建miRNA-mRNA 可視化調控網絡。

3. miRNA 上游轉錄因子預測和GO 分析

共得到195 個上游轉錄因子，其中前9 個最具有分析意義（見圖4），包括EGR1、ARID3A、NKX2-1、SP1、POU2F1、MEF2A、GATA1、SP4、GFI1。對195個上游轉錄因子GO分析發(fā)現（見圖5），其主要富集在核苷酸代謝調節(jié)、信號傳導、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性、泛素特異性蛋白酶活性、信號轉導復合體活性、GTP 酶活性、鳥苷酸交換因子活性等生物功能和分子功能。

4.靶基因GO 功能注釋和KEGG 分析

靶基因GO 功能分析發(fā)現（見圖6、7），在生物過程方面，主要富集在負趨化作用、嗅球發(fā)育、軸突生成、嗅球中間神經元分化、中樞神經系統(tǒng)神經元發(fā)育、視網膜神經節(jié)細胞軸突引導等。在細胞組成方面，主要富集在跨膜轉運蛋白復合體、軸突起始部、突觸前膜的組成、神經元映射末端、離子通道復合體、電壓門控鈉通道復合物等。在分子功能方面，主要富集在細胞外基質結構組成、熱休克蛋白結合、電壓門控鈉通道活性、轉移酶活性、離子通道結合、轉錄輔助因子結合等。KEGG 分析發(fā)現（見圖8），靶基因主要參與軸突引導、晝夜節(jié)律、神經活性配體-受體相互作用等信號通路。本研究發(fā)現，靶基因SLIT2、ROBO2、ROBO1 共同參與軸突引導信號通路，其中ROBO2、ROBO1 與miR-183，SLIT2 與miR-27b、miR-429、miR-200c關系密切。靶基因PER2、NPAS2 共同參與晝夜節(jié)律信號通路，其中PER2 與miR-34c，NPAS2 與miR-320a關系密切。靶基因F2RL2、GRID2、ADRB2、S1PR1、PTGER4 共同參與神經活性配體-受體相互作用信號通路，其中F2RL2 與miR-34c，GRID2 與miR-96 和miR-183，ADRB2 與miR-98，S1PR1 與miR-93 和miR-155，PTGER4 與miR-23b 關系密切。

對于選擇終止妊娠的HIV感染孕婦，應給予安全的人工終止妊娠服務，應盡早手術，以減少并發(fā)癥的發(fā)生。對于選擇繼續(xù)妊娠的孕婦，應給予優(yōu)質的孕期保健、產后母乳喂養(yǎng)等問題的咨詢，并采取相應的干預措施。

5. PPI 網絡建立與分析

本研究利用生物信息學分析方法，對從GEO 數據庫獲取的VZV 感染神經母細胞瘤細胞 (SH-SY5Y)轉錄組測序數據成功構建了miRNA-mRNA 可視化調控網絡。對該網絡進一步分析發(fā)現，hsa-mir-34c參與上調靶基因較多，hsa-mir-98、hsa-mir-221、hsa-mir-93、hsa-mir-183、hsa-mir-107、hsa-mir-182、hsa-mir-27b 參與下調靶基因較多。

hsa-mir-34c 已被發(fā)現與癌癥、炎癥性腸病等疾病的發(fā)病機制有關，且有研究表明，miR-34c 在大腦中的表達下調可能參與帕金森氏病的發(fā)病機制

。與急性期帶狀皰疹病人相比，帶狀皰疹后神經痛病人血清中miR-34c-5p、miR-107 表達水平明顯升高，特別是miR-107 在調節(jié)分化神經元，維持特定miRNA 穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，且miRNA 可能參與神經性疼痛有關的免疫應答

。有研究表明

，miR-183-5p 和miR-221-3p 可以通過外泌體輸送調節(jié)靶基因，促進血管生成。miR-183 的過表達可引起電壓門控鈉通道Na

1.3 和腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的下調，進而減輕脊神經結扎(spinal nerve ligation, SNL)誘導的機械性痛覺過敏

。miR-98 可靶向作用于caspase-3，抑制內皮細胞凋亡，調節(jié)Aβ 的產生，進而治療阿爾茨海默病。同時，其可通過抑制Fas和caspase-3，抑制心肌梗死相關的細胞凋亡

。miR-98 過 表 達 通 過 減 少IL-6、IL-1β、TNF-α 和COX-2 產生，抑制神經炎癥反應，調節(jié)HMGA2和STAT3 表達而減輕坐骨神經慢性壓迫損傷模型(chronic constriction injury, CCI)大鼠的神經病理性疼痛

。miR-182 與SORT1 共同調控體內外血管平滑肌細胞的鈣化，參與肺動脈高壓血管的重塑，miR-27b 通過調節(jié)血管內皮生長因子 C (VEGF-C)的表達促進血管生成和皮膚修復

。綜上所述，miR-34c、miR-107、miR-183、miR-98、mir-182、mir-27b 在神經病理性疼痛方面的部分研究結果與本研究的分析結果一致。因此，我們推測調控網絡中的mir-221、mir-93 等其他miRNAs 在帶狀皰疹相關神經痛的發(fā)病機制中可能同樣起著重要作用，特別是miR-183、mir-221、miR-182 和miR-27b 可能與帶狀皰疹神經痛相關的血管病變機制關系密切。

討 論

PHN 是帶狀皰疹病人最常見的并發(fā)癥之一，不少病人要經受多年的劇烈疼痛，嚴重的慢性疼痛給社會和個人帶來沉重的負擔，包括經濟、社交、日?；顒雍蜕钯|量下降，并逐漸成為一個公共衛(wèi)生問題。雖然有研究認為PHN 的發(fā)生與外周敏化、中樞敏化、炎癥和傷害性感受器的異位放電有關

，但其具體發(fā)病機制尚不清楚，致使臨床上有效或徹底根治這個疾病的治療方法較少?；蚝偷鞍妆磉_的改變被不少學者認為是神經病理性疼痛發(fā)展和維持的重要特征

，同時，認識到miRNAs 在基因表達調控中起著關鍵作用，可通過抑制疼痛同源靶基因的表達而參與神經病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展

，且miRNAs 已被作為研究多種疾病預后的潛在標志物。

為了更好地了解靶基因所表達蛋白質之間的關系，使用String (https://string-db.org/) 數據庫，在綜合得分≥0.4 條件下建立靶基因蛋白質互作網絡，并利用Cytoscape_3.8.1 軟件對蛋白質互作網絡圖進一步調整，同時利用 “Cytohubba” 插件，通過最大團中心性MCC 算法篩選出前10 位的Hub 基因。

將靶基因通過String 數據庫導出，并經Cytoscape 軟件處理得到蛋白質互作網絡（見圖9），同時使用Cytohubba 插件，通過最大團中心性MCC算法篩選出前 10 位的Hub 基因，包括HSPA8、PRRT2、SLIT2、ROBO2、SCN2A、PAX5、PBX1、ROBO1、ALDOA、ADAMTS5。

研修班主要特色：主承辦單位高度重視，組織落實到位；以行業(yè)需求為導向，完善課程體系；不斷創(chuàng)新研修機制，優(yōu)化研修環(huán)境；提升研修水平，培育領軍人才。主要成效：聚集創(chuàng)新資源，推廣科研新成果；強化責任意識，激發(fā)組織新活力；發(fā)揮輻射作用，提升品牌新高度。中國BIM高級研修班多期的成功舉辦促進了行業(yè)知識型、技術型、創(chuàng)新型高素質人才隊伍建設，為產業(yè)持續(xù)創(chuàng)新發(fā)展提供了重要人才支撐，對探索有效的行業(yè)人才培養(yǎng)機制和模式、引領開創(chuàng)人才教育培訓新格局起到積極的示范效果。

miRNA 的表達受轉錄因子調控，miRNA 亦可反過來影響轉錄因子的功能，兩者共同參與mRNA轉錄和翻譯，是細胞代謝的重要組成部分

。在本研究中，通過FunRich 軟件預測miRNA-mRNA網絡中的miRNA 上游轉錄因子，得到調控miRNA有顯著意義的轉錄因子EGR-1、SP1、SP4、MEF2A等。EGR-1 參與細胞生長、突觸傳遞和認知活動等不同類型的神經元反應，背根神經節(jié)和脊髓背角中的EGR-1 參與神經損傷誘導的神經病理性疼痛過程，同時，EGR-1 表達受miR-124-3p 調控

。轉錄因子SP4 主要在神經元中表達，參與信號傳導和能量產生相關的生物過程，SP1 參與調控神經性疼痛鈣通道α2δ-1 亞基的表達，誘導機械性痛覺過敏

。轉錄因子EGR-1、SP1、SP4、MEF2A可能通過干擾細胞生長、突觸傳遞、細胞凋亡及鈣通道等途徑參與帶狀皰疹相關神經痛的病理生理過程，同時這些轉錄因子也可能成為PHN 的潛在治療靶點。

靶基因GO 和KEGG 富集分析發(fā)現，這些靶基因主要富集于軸突生成、中樞神經系統(tǒng)神經元發(fā)育、熱休克蛋白結合、轉移酶活性、電壓門控通道活性、轉錄輔助因子結合等生物過程和分子功能，并參與軸突引導、晝夜節(jié)律、神經活性配體-受體相互作用等信號通路。Slit2 作為一種分泌蛋白，與其受體 Robo1 結合，可激活細胞自噬，調節(jié)細胞分化，參與炎癥過程

。有證據表明，miRNA 可能參與神經病理性疼痛相關生物鐘基因的轉錄后調控，miR-183/96/182 在感覺神經系統(tǒng)中有重要作用，且miR-182 和miR-96 的表達水平具有明顯的晝夜節(jié)律

。各種慢性疾病伴隨的疼痛都存在晝夜節(jié)律，且神經病理性疼痛的晝夜變化節(jié)律有多種機制參與，如μ 阿片受體、β-內啡肽和納洛酮之間的日常變化、與疼痛有關的鈣通道及炎癥調節(jié)因子

。

本研究構建的調控網絡表明，靶基因SLIT2、ROBO2、ROBO1 共同參與軸突引導，PER2、NPAS2共同參與晝夜節(jié)律，F2RL2、GRID2、ADRB2、S1PR1、PTGER4 共同參與神經活性配體-受體相互作用信號通路。鑒于篩選的多種基因參與多種疾病的發(fā)生機制，因此，我們推測這些靶基因可能參與帶狀皰疹相關神經痛有關的軸突引導、晝夜節(jié)律、神經活性配體-受體相互作用信號通路的調控，特別是篩選得到的Hub 基因SLIT2、ROBO2、ROBO1，它們可能在帶狀皰疹相關神經痛的軸突引導信號通路機制中有重要作用。

盡管該研究成功構建了帶狀皰疹神經痛miRNA-mRNA 調控網絡，篩選得到一些關鍵基因，并發(fā)現了miRNA 和mRNA 是通過多途徑、多靶點參與調控帶狀皰疹相關神經痛的發(fā)病機制，但該研究尚有許多不足之處，如缺乏適當的實驗來進一步支持該研究的結果，我們將在今后的研究中進行有針對性的實驗驗證，以更好地解釋其作用機制。

綜上所述，該研究構建的帶狀皰疹神經痛miRNA-mRNA 調控網絡對闡明帶狀皰疹相關神經痛的分子發(fā)病機制提供了理論支持，為未來構建更有意義的帶狀皰疹相關神經痛臨床預測模型，研發(fā)帶狀皰疹相關神經痛的基因靶向藥物提供了新的生物學標識和重要參考。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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