崔 熙,張小玲,李 旭,趙 靜,趙 樂

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安 710061；3.西安大興醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710002；4.西安市人民醫(yī)院/西安市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安 710004)

卵巢癌的死亡率居婦科惡性腫瘤之首[1]。卵巢癌的危險因素包括高脂飲食、肥胖、終生未育、子宮內(nèi)膜異位癥、遺傳因素等[2-4]。卵巢癌的治療方法主要為手術(shù)輔以化療及維持治療[5]。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，卵巢癌的治療方案中也引入了靶向治療藥物，但患者的5年生存率未有顯著改善[6-7]。開發(fā)新的卵巢癌治療藥物是改善卵巢癌患者預(yù)后的一個有效途徑。

中草藥是中華民族幾千年智慧的結(jié)晶，越來越多的臨床實例證實中草藥在保健益壽方面發(fā)揮著重要作用，其中人參自古以來就被用作許多疾病的營養(yǎng)強化劑和治療藥物。人參皂苷Rg3是提取自人參的活性單體，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抑制皮膚瘢痕增生和血管生成等特性[8-13]。體內(nèi)外實驗結(jié)果表明，人參皂苷Rg3能抑制卵巢癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[14-20]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)借助于生物信息學(xué)、分子生物學(xué)主要數(shù)據(jù)庫信息，綜合考慮機體內(nèi)靶標(biāo)分子、生物效應(yīng)分子的多種相互作用關(guān)系，通過與疾病相關(guān)的基因進行聯(lián)合分析，構(gòu)建“藥物-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)，從而促進新靶向藥物的研發(fā)，提高靶向藥物篩選的成功率[21-22]。為探索人參皂苷Rg3抑制卵巢癌的作用機理，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法鑒定人參皂苷Rg3的分子靶點，以便為卵巢癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 研究資料與方法

1.1 研究資料

1.1.1 確定人參皂苷Rg3的作用靶點

借助整合了化學(xué)物質(zhì)、基因、功能表型和疾病之間相互作用的比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(Comparative Toxicogenomics Database，CTD)(http://ctd.mdibl.org)，檢索識別人參皂苷Rg3的潛在靶點。

1.1.2 篩選卵巢癌的靶點分子

對卵巢癌的靶點通過藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(Therapeutic Target Database，TTD)(http://db.idrblab.org/ttd/)和基因卡(GeneCards)網(wǎng)站(https://www.genecards.org/)輸入關(guān)鍵詞“ovarian cancer”進行篩查，整合信息、去除重復(fù)項，得到卵巢癌的靶點。

1.1.3 構(gòu)建人參皂苷Rg3抗卵巢癌靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

使用在線韋恩圖(Venny 2.1.0)獲取1.1.1和1.1.2中檢索到的靶點交集，將共有靶點輸入STRING蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)，于Organism欄中選擇Homo sapiens、限定物種為人源，構(gòu)建靶點的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，用Cytoscape 3.7.1軟件進一步構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，在輸出欄(Exports)中選擇下載TSV格式文件，然后將文件中的node1、node2、combined score信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化處理，通過Cytoscape內(nèi)置的“Network Analyzer”對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓?fù)鋵W(xué)分析，獲得各靶點的節(jié)點連接度(Degree值)、節(jié)點緊密度(Closeness值)和節(jié)點介度(Betweenness值)等信息。

1.1.4 人參皂苷Rg3作用于卵巢癌靶點的富集分析和京都基因與基因組百科全書通路分析

首先用R包(3.7.0)將4個共有交集靶點的基因symbol轉(zhuǎn)換為id，然后通過R包(3.7.0)中的Cluster profiler模塊對其進行基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路富集分析。GO富集分析基于超幾何分布檢驗，P<0.05達到顯著水平，認(rèn)為這群基因在該GO術(shù)語(term)富集。KEGG信號通路富集分析P<0.05說明其富集顯著性強、富集程度高。將所得到的結(jié)果使用R包(3.7.0)進行可視化處理。圖片中不同的顏色代表不同P值，從藍(lán)色到紅色表示P值從大到小，富集程度越來越顯著。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco-BRL，美國)在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞系3AO、A2780和SKOV3，培養(yǎng)箱條件設(shè)定為濕度100%、溫度37℃、二氧化碳含量5%。取對數(shù)生長期細(xì)胞進行藥物處理。

1.2.2 藥物和抗體

20(S)-Rg3購自天士力制藥集團股份有限公司(天津)。將20(S)-Rg3以4mg/mL的濃度溶解于二甲亞砜(DMSO)中作為原液，并在-20℃下保存。使用的抗體有：小鼠抗人β-actin單克隆抗體，兔抗人表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)單克隆抗體(Cell Signaling Technology，美國)；HRP-羊抗兔/鼠二抗(Pierce，美國)。

1.2.3 蛋白免疫印跡實驗

將對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞以(3×105)個細(xì)胞/孔的密度種于6孔板，種板24小時后，一孔加終濃度80μg/mL的20(S)-Rg3作為處理組，另一孔加等濃度DMSO作為陰性對照，處理72小時后用含蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀法緩沖液(radio-immunoprecipitation assay buffer，RIPA)提取細(xì)胞總蛋白，二辛可寧酸含量測定法(bicinchoninic acid assay，BCA)定量，加入蛋白體積1/4的5×上樣緩沖液，混勻后煮沸變性，按照每孔30μg蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，0.32A轉(zhuǎn)印90分鐘至硝酸纖維素(NC)膜，10%脫脂奶室溫封閉3小時，抗人EGFR或β-actin抗體4℃過夜孵育，二抗室溫孵育2小時，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影拍照。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg3對卵巢癌作用靶點的篩選

利用CTD數(shù)據(jù)庫獲得人參皂苷Rg3的潛在作用靶點65個；以“ovarian cancer”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫和TTD數(shù)據(jù)庫中搜尋相應(yīng)靶點，共得到8 412個卵巢癌潛在疾病作用靶點；將人參皂苷Rg3的所有靶點與卵巢癌的所有靶點進行比對，通過Venny 2.1.0軟件共獲取4個交集靶點，包括EGFR、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose) polymerase 1，PARP1]、含桿狀病毒IAP重復(fù)序列蛋白5(Baculoviral IAP repeat containing 5，BIRC5)和凸素1(prominin 1，PROM1)，見圖1。

2.2 人參皂苷Rg3和卵巢癌靶點的互作網(wǎng)絡(luò)

人參皂苷Rg3與卵巢癌的共同靶點被認(rèn)為可能是人參皂苷Rg3治療卵巢癌的作用靶點。將其交集分析獲得的4個人參皂苷Rg3抗卵巢癌靶點導(dǎo)入基因/蛋白相互作用檢索搜查工具(search tool for the retrieval of interacting genes/proteins，STRING)在線數(shù)據(jù)庫，分析獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

借助Cytoscape 3.7.1軟件獲得PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果，展示了所有靶點的節(jié)點連接度(Degree值)、節(jié)點緊密度(Closeness值)和節(jié)點介度(Betweenness值)，EGFR的節(jié)點最大，見圖3。節(jié)點越大、顏色越深，則度值越大，因此將EGFR確定為后續(xù)實驗驗證的靶點。

2.3 人參皂苷Rg3對基因功能及信號通路的影響

為深入了解各交集靶點的生物學(xué)功能，對這些靶點進行了GO富集分析與KEGG信號通路富集分析。GO富集分析得到P<0.05的條目共計433個，包括生物過程(biological process，BP)條目357個、細(xì)胞組成(cell composition，CC)條目33個、分子功能(molecular function，MF)條目43個，各類別排名前10位的條目見圖4。這些靶點所涉及的生物過程主要為解剖結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)(anatomical structure homeostasis)、DNA修復(fù)的正向調(diào)控(positive regulation of DNA repair)及對DNA損傷刺激反應(yīng)的正調(diào)控(positive regulation of response to DNA damage stimulus)。這些靶點的細(xì)胞組成主要分布于染色體區(qū)域(chromosomal region)、頂端質(zhì)膜(apical plasma membrane)、細(xì)胞頂端部分(apical part of cell)、核膜(nuclear envelope)等。這些靶點所涉及的分子功能主要有鈣粘蛋白的結(jié)合(cadherin binding)、蛋白ADP-核糖酶活性(protein ADP-ribosylase activity)及半胱氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑參與的細(xì)胞凋亡過程(cysteine-type endopeptidase inhibitor activity involved in apoptotic process)等。

KEGG信號通路富集分析得到P<0.05的通路共計23條，均與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，見圖5。富集的主要通路包括結(jié)直腸癌(colorectal cancer)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)、膀胱癌(bladder cancer)、子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer)等。

2.4 20(S)-Rg3下調(diào)卵巢癌細(xì)胞的EGFR表達情況

為驗證上述分析結(jié)果，采用人參皂苷Rg3的主要成分20(S)-Rg3處理了卵巢癌細(xì)胞3AO、A2780和SKOV3，采用蛋白免疫印跡法檢測20(S)-Rg3對EGFR表達的影響，結(jié)果顯示，經(jīng)20(S)-Rg3處理后，3株細(xì)胞的EGFR蛋白表達水平顯著下調(diào)，見圖6。

3 討論

3.1 人參皂苷Rg3介導(dǎo)下卵巢癌細(xì)胞中EGFR的表達意義

關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常是促進腫瘤進展的重要因素。EGFR的突變、擴增是推動腫瘤進展的重要因素，癌細(xì)胞中EGFR信號通路的激活參與了細(xì)胞增殖、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等功能。EGFR過表達或激活與腫瘤患者預(yù)后不良相關(guān)[23]。有70%以上的卵巢癌患者EGFR通路被激活。EGFR突變或擴增也與化療耐藥密切相關(guān)。因此，EGFR被認(rèn)為是晚期卵巢癌治療的關(guān)鍵分子靶點。目前發(fā)現(xiàn)EGFR下游的信號通路主要包括大鼠肉瘤癌基因/絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶/絲裂原活化蛋白激酶激酶/絲裂原活化蛋白激酶(Ras/Raf/MEK/ERK)和大鼠肉瘤癌基因/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(Ras/PI3K/AKT/mTOR)通路，以EGFR、Raf和AKT為靶點的藥物已獲準(zhǔn)用于臨床，但多項研究報道，在單用或者聯(lián)合使用的情況下，它們對卵巢癌的治療有效率均較低[24]。

EGFR是本次人參皂苷Rg3網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中富集度最高的靶基因，實驗初步證實了人參皂苷Rg3的主要組分20(S)-Rg3處理卵巢癌細(xì)胞的EGFR表達顯著降低，這為人參皂苷Rg3作用機制的研究提供了實驗依據(jù)。

3.2 20(S)-Rg3對卵巢癌臨床治療的潛在應(yīng)用價值

課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3的主要組分20(S)-Rg3通過多種途徑抑制了卵巢癌的細(xì)胞惡性表型。有研究揭示了20(S)-Rg3在卵巢癌細(xì)胞和裸鼠皮下荷瘤模型中均能促使缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF-1α)降解，阻斷缺氧驅(qū)動的癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，有效地抑制了卵巢癌的遷移和腹腔內(nèi)擴散[14]。有研究從DNA甲基化調(diào)控機制入手，發(fā)現(xiàn)20(S)-Rg3通過降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A的表達水平而抑制其介導(dǎo)的抑癌基因VHL的啟動子甲基化，使得卵巢癌細(xì)胞中的VHL上調(diào)[25]。20(S)-Rg3還可以通過下調(diào)DNMT3A介導(dǎo)的microRNA啟動子甲基化而促進對有氧糖酵解關(guān)鍵酶HK2和PKM2的直接抑制，進而拮抗有氧糖酵解，發(fā)揮抑制卵巢癌的作用[17-18]。這些研究結(jié)果證實了20(S)-Rg3的作用途徑較為豐富，但其抗卵巢癌的直接靶點有待鑒定。

在實驗證實20(S)-Rg3具有抗卵巢癌活性的基礎(chǔ)上，本研究進行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，以期發(fā)現(xiàn)潛在的藥物作用直接靶點。通過對藥物與疾病共同作用靶點的交集分析，借助PPI、GO和KEGG等分析工具，篩選獲得靶標(biāo)，并進行實驗驗證，本研究證實20(S)-Rg3能夠抑制EGFR。

遺憾的是，由于人參皂苷Rg3的生物利用度較低，水溶性和生物膜通透性較差，胃腸道作用不穩(wěn)定，體內(nèi)代謝率高，因此臨床應(yīng)用有限。未來可以通過開發(fā)有效的給藥系統(tǒng)或給藥途徑來提高人參皂苷Rg3的生物利用度，使其快速高效地應(yīng)用于臨床治療，這也為后續(xù)研究提出了更多的要求[26]。

綜上，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，快速構(gòu)建出人參皂苷Rg3-靶點-卵巢癌的網(wǎng)絡(luò)模型，有利于預(yù)測和分析人參皂苷Rg3對卵巢癌的作用途徑和藥理機制，為人參皂苷Rg3成為卵巢癌臨床治療候選藥物提供了理論依據(jù)。