謝國(guó)旺，滕明剛，游 輝，劉家芳，柴慧芳

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

0 引言

羧酸酯酶(carboxylesterase，CES)屬于α/β水解酶超家族，是一種重要的藥物代謝酶，包括蛋白酶、脂肪酶和膽堿酯酶[1]，普遍存在于不同種屬的哺乳動(dòng)物體內(nèi)。CES有6個(gè)亞型，其中在人體中最主要有人羧酸酯酶1(hCE1)和人羧酸酯酶2(hCE2)[2，3]。此外，CES能將酯類或酰胺催化水解成醇或酚，并且由于CES廣泛的底物特異性，其通常被稱為非特異性酯酶，這歸功于它擁有一個(gè)龐大的整合活性位點(diǎn)，因此它能與結(jié)構(gòu)多樣性的底物結(jié)合[4]，包括一些外源性藥物如卡培他濱、哌替啶和伊立替康(CPT-11)等[5]。CES的亞型CES 2作為CPT-11的關(guān)鍵代謝酶，不僅已成為CPT-11治療結(jié)直腸癌和神經(jīng)鞘瘤的指標(biāo)，而且其表達(dá)和活性還被認(rèn)為是胰腺導(dǎo)管腺癌患者CPT-11治療敏感性的主要因素[6]。另外，CES還負(fù)責(zé)代謝各種內(nèi)源性酯底物，例如膽固醇酯、乙酰輔酶A等。因此，檢測(cè)羧酸酯酶對(duì)研究其生物學(xué)功能有重要意義。

目前用于檢測(cè)人體內(nèi)的酶的方法包括蛋白免疫印跡、 PCR和蛋白質(zhì)組學(xué)等[7-9]。但是，上述檢測(cè)酶的方法存在操作較為復(fù)雜、設(shè)備昂貴且時(shí)間成本較高等缺點(diǎn)，而熒光探針因具有靈敏度高，準(zhǔn)確性好，特異性強(qiáng)及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于熒光傳感、光學(xué)成像、細(xì)胞及組織成像等方面。熒光探針通常由三個(gè)部分構(gòu)成：熒光報(bào)告器基團(tuán)、接收器基團(tuán)與連接器部分，其通過(guò)與底物特異性結(jié)合后引起熒光基團(tuán)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其反應(yīng)前后熒光光譜發(fā)生變化。熒光探針用羧酸酯酶(CES)處理后，其熒光性質(zhì)發(fā)生變化。其熒光變化一般分為以下三種：開啟(turn-on)、關(guān)閉(turn-off)和比率計(jì)(ratiometric)[10-13]。這些類型的探針各有優(yōu)勢(shì)。開啟(turn-on)的探針幾乎沒有熒光，其被羧酸酯酶(CES)水解后，該分子熒光強(qiáng)度顯著增加；而關(guān)閉(turn-off)探針功能則正好相反，其與羧酸酯酶(CES)反應(yīng)前有熒光，反應(yīng)后熒光淬滅；但是比率計(jì)熒光探針在羧酸酯酶(CES)水解前后都具有熒光，能夠根據(jù)探針?biāo)鉅顟B(tài)來(lái)顯示不同的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)[14]。近年來(lái)使用熒光探針檢測(cè)羧酸酯酶(CES)的方法被相繼報(bào)道，如葛廣波[15，16]等，設(shè)計(jì)了分別對(duì)hCE1和hCE2具有高選擇性及高敏感性的探針NMHN和TCFB，且還證明了這些探針可分別用于檢測(cè)復(fù)雜生物系統(tǒng)樣品中的hCE1和hCE2活性。因此，本文擬基于咔唑環(huán)為母核設(shè)計(jì)并合成一種用于檢測(cè)羧酸酯酶的熒光探針，實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確且低成本的酶檢測(cè)。

本文以咔唑?yàn)樵显O(shè)計(jì)并合成一種用于檢測(cè)羧酸酯酶的turn-off熒光探針TX-01(見圖1)，以咔唑(1)為起始原料，經(jīng)甲基化反應(yīng)得9-N甲基咔唑(2)，(2)上醛基得到3-醛基-9-N甲基咔唑(3)，(3)通過(guò)溴化得到3-醛基-6-溴-9-N甲基咔唑(4)，通過(guò)(4)合成得到3-醛基6-羥基-9N甲基咔唑(5)，(5)經(jīng)過(guò)縮合得到(6)，最后酯化得到目標(biāo)分子(7)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：DF DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；78-1磁力攪拌器(金壇市易晨?jī)x器制造有限公司)；OSB-2200油浴鍋(上海愛郎儀器有限公司)；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；N1200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會(huì)社)；FA22204B電子天平(上海天美天平儀器有限公司)；Bruker 400 MHz型核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；TU-1810型紫外分光光度計(jì)(北京普析)；F-98型熒光分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)。

試劑：咔唑；氫化鈉、碘甲烷、氫氧化鋰一水合物(LiOH ·H2O)、乙酰丙酮酸銅(Cu(acac)2)、BHMPO，均購(gòu)自安耐吉公司；溴代丁酰亞胺(NBS)、三氯氧磷(POCl3)購(gòu)自九鼎化學(xué)；吡啶、哌啶、DMF、乙醇，DMSO均購(gòu)自天津科密歐公司；4-氟苯甲酰氯(購(gòu)自阿拉丁)、羧酸酯酶(E3019-3.5KU)購(gòu)自西格瑪奧德里奇。

圖1 熒光探針的合成路線

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 9-N甲基咔唑(2)的制備

取1L圓底燒瓶，將咔唑(50 g，0.3 mol)溶于300 mLDMF中，在冰浴條件下緩慢加入鈉氫(18 g，0.75 mol)并攪拌，反應(yīng)30 min后，往反應(yīng)液中滴加碘甲烷(42.67 g，0.3 mol)。室溫反應(yīng)2 h后監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全，將反應(yīng)液邊攪拌邊倒入1L水中，待有白色固體析出，過(guò)濾后得白色固體，減壓干燥的產(chǎn)物9-N咔唑(化合物2)51.49 g，產(chǎn)率95%。1H-NMR(400 MHz，DMSO)δ 8.15(d，J=7.6 Hz，2H)，7.59(d，J=8.1 Hz，2H)，7.47(t，J=7.5 Hz，2H)，7.21(t，J=7.3 Hz，2H)，3.87(s，3H)。

1.2.2 3-醛基-9-N甲基咔唑(3)的制備

取1L圓底燒瓶，將9-N甲基咔唑(50 g，0.28 mol)溶于DMF(200 mL)中，將三氯氧磷(77.37 mL，0.83 mol)在冰浴條件下滴加入反應(yīng)瓶，滴加完后將反應(yīng)瓶轉(zhuǎn)移至油浴鍋中加熱至90 ℃下反應(yīng)，30 min后反應(yīng)完全，減壓回收三氯氧磷后，在攪拌下將反應(yīng)液慢慢倒入冰水中淬滅反應(yīng)，用4M的氫氧化鈉水溶液將pH值調(diào)至9，再用乙酸乙酯(3x100 mL)萃取3次后，合并有機(jī)相。有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌三次后用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并減壓回收溶劑后獲得化合物(3)的粗品，然后通過(guò)柱層析(洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)分離純化得白色固體即3-醛基-9-N甲基咔唑49.09 g，產(chǎn)率85%。1H-NMR(400 MHz，DMSO)δ10.07(s，1H)，8.75(d，J=1.3Hz，1H)，8.29(d，J=7.8Hz，1H)，8.01(d，J=10.1 Hz，1H)，7.97(s，3H)，7.75(d，J=8.6 Hz，1H)，7.68(d，J=8.3 Hz，1H)，7.60-7.52(m，1H)，7.32(t，J=7.9 Hz，1H)，3.94(s，3H)。

1.2.3 3-醛基-6-溴-9-N甲基咔唑(4)的制備

取500 mL圓底燒瓶，在水浴下將3-醛基-9-N甲基咔唑(40，0.19 mol)溶于DMF(200 mL)，在攪拌下加入NBS(34 g，0.19 mol)，室溫下反應(yīng)30 min后反應(yīng)完全，而后將反應(yīng)液倒入水中攪拌，過(guò)濾得粗產(chǎn)物。乙醇重結(jié)晶后得白色晶體即3-醛基6-溴-9N甲基咔唑(4)50.61 g，產(chǎn)率92%。1H-NMR(400 MHz，DMSO)δ 10.05(s，1H)，8.81(s，1H)，8.55(s，1H)，8.03(d，J=8.6 Hz，1H)，7.78(d，J=8.6Hz，1H)，7.67(s，2H)，3.94(s，3H)。

1.2.4 3-醛基-6-羥基-9-N甲基咔唑(5)的制備

取500 mL圓底燒瓶，將(4)(30 g，0.104 mol)放入燒瓶中，溶于DMSO∶H2O=4∶1 100 mL，攪拌狀態(tài)下分別加入LiOH·H2O(9.17g，0.218 mol)、BHMPO(0.68 g，0.002 mol)和Cu(acac)2(0.45 g，0.002 mol)，加氮?dú)庵脫Q三次后80 ℃反應(yīng)3 h，反應(yīng)液過(guò)濾后倒入水中攪拌，后有黃色固體析出，旋干固體，甲醇打漿的黃色固體15.26 g，產(chǎn)率60%。1H NMR(400 MHz，DMSO)δ 10.02(s，1H)，8.63(s，1H)，7.94(d，J=8.6 Hz，1H)，7.66(d，J=8.6 Hz，1H)，7.60(d，J=2.2 Hz，1H)，7.49(d，J=8.7 Hz，1H)，7.06(dd，J=8.7，2.3 Hz，1H)，3.87(s，3H)。

1.2.5 化合物(6)制備

取500 mL圓底燒瓶，將化合物(5)(22.7 g，0.101 mol)，加入100 mL無(wú)水乙醇，加入4-甲基吡啶季銨鹽(24.97 g，0.106 mol)，加入哌啶(4.54 mL，0.046 mol)，50 ℃回流反應(yīng)5h。旋干乙醇得紅色固體，經(jīng)硅膠柱層析(DCM∶MeOH 10∶1)純化得紅色固體38.22 g，產(chǎn)率85.7%。1H-NMR(400 MHz，DMSO)δ 8.84(s，1H)，8.63(s，1H)，8.23-8.14(m，4H)，7.97(d，J=8.6 Hz 1H)，7.93(d，J=8.6 Hz 1H)，7.73(d，J=2.2 Hz 1H)，7.67(d，J=8.7 Hz 1H)，7.53(s，1H)，7.29(dd，J=8.7，2.3 Hz 1H)，4.25(s.3H)，3.90(s，3H)。

1.2.6 探針分子(7)即TX-01合成

取500 mL圓底燒瓶，將化合物(6)(5 g，0.012 mol)用15 mLDCM溶化，加入三乙胺(4.7 mL，0.034 mol)冰浴攪拌狀態(tài)下加入4-氟苯甲酰氯(3.4g，0.022 mol)，加完后升溫至50 ℃。反應(yīng)2 h后，旋掉三乙胺用DCM萃取三次(3×15 mL)。有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓回收溶劑后得紅色固體粉末，之后用DCM∶MeOH=20∶1過(guò)柱，過(guò)完柱后用乙醇打漿得深紅色粉末2.8 g，產(chǎn)率42.9%。1H-NMR(400 MHz，DMSO)δ 8.80(d，J=6.4 Hz)，8.60(s)，8.30(dd，J=21.8，13.8 Hz)，8.17(dd，J=13.2，6.3 Hz)，7.95(d，J=8.6 Hz)，7.82-7.69(m)，7.56-7.40(m)，4.23(s)，3.97(s)。

1.3 光譜實(shí)驗(yàn)

稱取一定量的探針分子溶于DMSO配成濃度為10 mM的溶液，用PBS緩沖溶液(PH=7.4)稀釋至2 mM，利用紫外分光光度計(jì)掃描最大吸收波長(zhǎng)，再用PBS緩沖溶液將探針溶液稀釋至10μM，通過(guò)熒光分光光度計(jì)測(cè)量最大發(fā)射波長(zhǎng)。

用PBS緩沖溶液稀釋一定量的酶配成0.3 mg/mL的酶溶液，將1 mL探針溶液與酶溶液在37 ℃ 1200 rpm的條件下孵育30 min后加入1 mL乙腈淬滅反應(yīng)。反應(yīng)液用離心機(jī)2000轉(zhuǎn)離心10 min后取其上清液，測(cè)量最大吸收波長(zhǎng)，同時(shí)以該最大吸收波長(zhǎng)掃描最大發(fā)射波長(zhǎng)，并記錄酶反應(yīng)前后熒光強(qiáng)度，最后用高分辨質(zhì)譜檢測(cè)探針分子與酶反應(yīng)后的清液。

2 結(jié)果與討論

合成的探針分子TX-01氘代DMSO溶解確定氫譜(圖2)后，在365 nm紫外下檢測(cè)該Turn-off型探針分子TX-01，其本身呈現(xiàn)出強(qiáng)橙黃色熒光，在其與酶反應(yīng)后熒光淬滅(圖3)，經(jīng)過(guò)全波長(zhǎng)紫外掃描得到探針分子最大激發(fā)波長(zhǎng)為423 nm，經(jīng)酶處理后最大激發(fā)波長(zhǎng)為422 nm。在423 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，TX-01最大發(fā)射波長(zhǎng)為580 nm，經(jīng)酶處理后熒光發(fā)生淬滅，經(jīng)計(jì)算探針分子斯托克斯位移為157 nm，同時(shí)對(duì)該探針分子進(jìn)行三維熒光掃描(圖4)。TX-01經(jīng)酶反應(yīng)前后熒光強(qiáng)度發(fā)生顯著變化(圖5)。最后用高分辨質(zhì)譜檢測(cè)探針分子與酶反應(yīng)后上清液，其中有m/z為315.1517的峰(圖6)，證明羧酸酯酶水解了該Turn-off型熒光探針TX-01的酯鍵，使其熒光淬滅。

圖2 探針分子(7)TX-011H-NMR(400 MHz，DMSO)

圖3 探針TX-01與酶反應(yīng)前后熒光現(xiàn)象

圖4 探針TX-01的三維掃描圖

圖5 經(jīng)酶反應(yīng)前后熒光強(qiáng)度變化

圖6 探針TX-01與羧酸酯酶反應(yīng)后的高分辨質(zhì)譜圖