潘仕達，蘇 楠，左焱玫，王福生，孟繁平

原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis,PBC）是一種自身免疫介導的慢性炎癥性、膽汁淤積性肝臟疾病[1]，目前發(fā)病機制不明[2]。膽管上皮細胞損傷及碳酸氫鹽傘受損在PBC的發(fā)病過程中較為關(guān)鍵[3]。臨床上主要以生物化學指標升高、抗線粒體抗體陽性或肝臟組織病理學改變作為該病的診斷標準。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一種長度為19～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，可通過與靶基因結(jié)合干擾mRNA翻譯[4]，且其異常表達與包括腫瘤、自身免疫病及感染性疾病在內(nèi)的多種疾病密切相關(guān)[5-11]。據(jù)報道，miRNA在PBC患者的肝組織和血清中有顯著變化[12-15]，通過下游因子介導膽道損傷和免疫失調(diào)。其中，miRNA可介導膽管功能障礙，抑制膽管細胞增殖，造成肝臟纖維化。此外，miRNA也可影響機體自身抗體分泌，通過抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細胞（regulatory T cell,Treg）、誘導輔助性T淋巴細胞（T helper cell, Th）增加、促進CD4+T細胞活化、調(diào)節(jié)外泌體介導免疫反應等方式參與PBC發(fā)病機制。不同miRNA表達差異也在PBC的診斷和病情評估中發(fā)揮作用[16]。本文將綜述miRNA在PBC機制調(diào)控、診斷和治療中的研究進展，為PBC相關(guān)miRNA研究提供思路。

1 miRNA與PBC發(fā)病機制

PBC的主要發(fā)病機制為免疫細胞被過度活化而特異性攻擊小膽管細胞，導致膽管細胞功能障礙和膽道損傷。在PBC患者中有＞200個miRNA表達存在異常，miRNA與PBC患者的免疫失調(diào)和膽道損傷具有重要的聯(lián)系[12，16]。詳見表1。

表1 參與PBC發(fā)病機制的miRNAsTable 1 miRNAs involved in PBC pathogenesis

1.1 miRNA介導PBC的膽管細胞功能障礙及膽道損傷 PBC患者中不同miRNA表達差異可介導靶基因促進膽道炎癥、細胞凋亡和氧化應激[12]，如 miR-506、miR-26a、miR-34、miR-125b、miR-139-5p等。其中，miR-506是參與PBC發(fā)病最重要的miRNA之一。膽管細胞頂膜的Cl-/HCO-3陰離子交換蛋白2（anion exchanger 2, AE2）能使細胞內(nèi)HCO3-進入膽道，維持膽管上皮細胞（biliary epithelial cell, BEC）的碳酸氫鹽傘，保護BEC免受有害膽汁酸影響[34-35]。而PBC患者膽管細胞中過表達的miR-506可與AE2結(jié)合，抑制其表達和轉(zhuǎn)染，損傷膽管細胞，使其分泌功能受損[16]。IL-8、IL-12和TNF-a等促炎因子可促進miR-506表達，增強細胞應激和對膽汁酸的敏感性，并誘導膽管細胞產(chǎn)生PBC樣特性，促進免疫激活[19]。miR-506參與III型肌醇1, 4, 5-三磷酸受體（type Ⅲ isoform of the inositol 1, 4,5-trisphosphate receptor, InsP3R3）對膽汁碳酸氫鹽分泌的調(diào)節(jié)過程[18-19，35]。InsP3R3表達下調(diào)可導致胞內(nèi)Ca2+信號傳導和碳酸氫鹽分泌障礙[36]，而miR-506可特異性結(jié)合InsP3R3導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放減少，引發(fā)膽汁淤積[16，18]。

此外，PBC中上調(diào)的miR-26a可降低多梳家族蛋白EZH2表達，抑制Bmi1對膽管細胞的增 殖[26，37]。 上 調(diào)的 miR-34a，miR-132 可 能 導致Nrf2/Keap1軸異常，影響正常氧化應激[23]，而miR-34a還通過轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor, TGF）-β1/smad通路靶向轉(zhuǎn)化生長因子β同源誘導因子-2（transforming growth factor-beta-induced factor homeobox 2, TGIF2）促進PBC中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和肝纖維化[31]。同樣介導 TGF-β1 的 miR-125b則通過TGF-β1/TGF-β1R/血管內(nèi)皮生長因子-A通路影響膽道衰老與肝纖維化[17]。高表達的 miR-139-5p通過 c-FOS/NF-κB信號通路介導TNF-α水平升高，加重PBC炎性反應[27]。然而也有研究報道稱通過JNK-FOXO3通路上調(diào)miR-34b/c可防止肝纖維化[33]。

miR-191-3p、miR-21、miR-210等 miRNAs的異常表達可影響膽汁代謝。在PBC患者中，miR-191-3p下調(diào)促進肢體表達 1樣蛋白表達，促進膽汁淤積性肝損傷，而過表達miR-191-3p可負性調(diào)控其靶基因肝受體同源物-1表達，抑制Cyp7a1和Cyp8b1表達，降低膽汁酸水平，減輕肝損傷[32]。此外，miR-21、miR-210也與壞死性凋亡和膽汁淤積有關(guān)，它們通過周期依賴性激酶2相關(guān)蛋白1或法尼酯X受體轉(zhuǎn)錄共激活因子—混合型白血病組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶4促進肝細胞壞死變性和膽汁淤積[21，38-40]。其中，miR-21還與PBC中的免疫細胞活化有關(guān)，參與CD8+T細胞活化，高表達的miR-21增加了細胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-17表達，并靶向程序性細胞死亡因子4，阻止細胞凋亡，促進 PBC 發(fā)病[20，35]。

1.2 miRNA介導PBC的免疫失調(diào) PBC的具體發(fā)病機制尚不明，但可在病程進展中觀察到免疫耐受失調(diào)[3]。miRNA異常表達可能與促進CD4+T細胞活化、抑制Treg免疫功能、誘導Th增加、持續(xù)激活B淋巴細胞影響自身抗體分泌、調(diào)節(jié)外泌體介導抗原特異性免疫反應有關(guān)。

研究證實，miR-425、miR-181a、miR-92a、miR-155、miR-146a等可通過特定信號通路促進CD4+T細胞活化。其中，下調(diào)的miR-425通過T細胞抗原受體（T cell receptor, TCR）信號通路上調(diào)N-Ras，促進CD4+T細胞活化，誘導IL-2、IFN-γ等促炎因子過度產(chǎn)生[25，41]。而miR-181a可通過下調(diào)靶基因bcl-2介導促炎Th17增加和抑炎Treg減少[42]。在PBC患者中下調(diào)的miR-92a也可增加促炎Th17活化，增加IL-17表達介導組織炎癥發(fā)生[43]，然而miR-92a的下調(diào)對Treg無明顯影響[24]。上述研究表明，miR-181a和miR-92a在PBC中的下調(diào)以不同方式作用于促炎Th17，增加IL-17表達介導組織炎癥發(fā)生。而miR-155和miR-146a參與對Treg的調(diào)控。高表達的miR-155與細胞因子信號抑制因子-1（suppressor of cytokine signaling, SOCS-1）和Treg標志物FoxP3表達水平呈負相關(guān)[44]，而SOCS-1可增強Treg的免疫抑制功能[45]。作為Toll樣受體（Toll-like receptor, TLR）的負調(diào)節(jié)因子，miR-146a可減少炎癥介質(zhì)響應TLR刺激[46-47]，并靶向信號傳導轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator transcription-1, Stat1）控制Treg介導IFN-γ調(diào)節(jié)[48]。在PBC患者中，miR-155和miR-146a的表達顯著增加[30]，通過負調(diào)節(jié)SOCS-1/Stat1和TLR介導免疫反應破壞機體Th1和Th2動態(tài)平衡抑制Treg免疫功能，加重PBC炎性反應。

除參與T細胞調(diào)控外，miRNA也參與B淋巴細胞激活和相關(guān)抗體分泌。Zhang等[28]觀察到在miR-223-3p、miR-21-5p下調(diào)的PBC患者中，線粒體抗丙酮酸脫氫酶復合體E2亞基（pyruvate dehydrogenase complex E2, PDC-E2）特異性B淋巴細胞被持續(xù)激活，抗核抗體（gp210、sp100）水平顯著升高。miR-223-3p，miR-21-5p的潛在靶基因（TGFBR2、MEF2C、FOXP1和RBPJ）參與細胞分化、遷移、細胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導等途徑，提示miR-223-3p，miR-21-5p可能與B細胞分化和激活、分泌及PDC-E2抗體相關(guān)[49]。

血清外泌體的miRNA可能在免疫調(diào)控中發(fā)揮作用，如miR-451a、miR-642a-3p等。miR-451a已被證明可調(diào)節(jié)樹突狀細胞（dendritic cell, DC）細胞因子[50]，miRNA-642a可調(diào)節(jié)單核細胞TLR4翻譯[51]。而PBC患者外泌體miR-451a和miR-642a-3p含量升高[29]，提示miRNA可能參與適應性免疫反應，協(xié)調(diào)抗原遞呈細胞，參與對DC的激活并上調(diào)表面標志物的表達。上述研究結(jié)果證實miRNA通過不同的信號通路參與PBC的發(fā)病，這也為PBC及膽汁淤積性肝病提供了潛在的治療靶點。

2 miRNA在PBC中的診斷和治療潛力

作為潛在的生物標志物，miRNA具有蛋白標志物無法比擬的優(yōu)勢，其能夠穩(wěn)定存在于循環(huán)中且與多種人類疾病密切相關(guān)。PBC患者miRNA的異常表達在診斷和評估治療效果方面可能具有價值，詳見表2。

表2 PBC潛在生物標志物的miRNATable 2 miRNA as potential biomarkers for PBC

續(xù)表2

2.1 miRNA作為輔助早期診斷和鑒別診斷的生物標志物 PBC的臨床診斷主要基于抗線粒體M2型（Anti-mitochondrial antibody subtype M2,AMA-M2）抗體、血清ALP、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（glutamyl transpeptidase, GGT）等生物化學指標以及組織病理學的改變。研究證實miRNA可輔助PBC診斷及與其他肝病的鑒別。

最早的研究報道稱，在PBC患者肝組織中miR-122a，miR-26表達下調(diào)，而miR-328，miR-299-5p表達上調(diào)[12]。在PBC外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）中也發(fā)現(xiàn)了miRNA的表達異常，miR-15a-5p、miR-20a-5p、miR-140-3p、miR-106b-5p表達升高，而miR-3645、miR-181a-5p表達降低[13]。另有報道稱在PBMCs中miR-155，miR-146a表達也顯著增加[30]。最近研究報告了一組miRNA組合（miR-122-5p、miR-141-3p及 miR-26b-5p） 對 PBC 具有較高診斷準確性（AUC為0.905，95% CI：0.857～0.953，敏感度80.5%，特異度88.3%），該miRNA組合的診斷準確度高于ALP（AUC為0.537，95% CI：0.195～ 0.434，P ＜ 0.001）、抗核抗體（antinuclear antibody, ANA）（AUC為0.739，95% CI：0.012 ～ 0.213，P=0.0282），但低于AMA-M2抗體（AUC為0.982，95% CI：0.0618～0.198，P=0.0002）。對PBC不同臨床階段（臨床前、無癥狀、有癥狀和肝功能不全）患者分析后（AUC分別為0.835、0.879、0.867和0.901）得出，該組合診斷性能與疾病狀態(tài)無關(guān)[53]。

在鑒別方面，下調(diào)的miR-505-3p，miR-139-5p，miR-197-3p可能作為PBC患者臨床診斷和與病毒性肝炎鑒別診斷的重要標記分子[54]，而miR-26a，miR-299-5p，miR-328，miR-let-7a在 PBC患者中的上調(diào)可能在鑒別自身免疫性肝炎與PBC中發(fā)揮重要作用[30]。在另一項研究中，AMA-M2陰性PBC患者血清miR-21，miR-150水平明顯高于健康對照及AMA-M2陽性PBC患者，且與AMA-M2抗體滴度呈負相關(guān)（miR-21：r=0.4，P=0.001； miR-150：r=0.3，P=0.016）；相比于肝硬化或肝纖維化患者，非肝硬化PBC患者miR-21表達顯著增加（P＜0.05）[55]。該結(jié)果也為AMA-M2陰性且無明顯肝硬化的早期PBC診斷提供潛在檢測指標。除miR-21外，miR-214在患有嚴重肝纖維化（F3～F4）膽道閉鎖患者肝組織中表達顯著上調(diào)，ROC分析顯示，預測嚴重肝纖維化miR-214截點水平為0.805（P=0.0046）[56]。因此，miR-21，miR-214可能作為肝纖維化的非侵入性預測因子。

2.2 miRNA早期分期評估輔助預測PBC疾病進展 在PBC不同分期和亞型中，miRNA存在表達差異。研究顯示，19個miRNAs在緩慢進展型PBC患者與肝功能衰竭和門靜脈高壓患者之間存在表達差異，而晚期PBC患者血清中miR-139-5p的表達明顯低于早期PBC患者和健康對照，這也提示其在預測疾病進展方面具有潛在價值[27]。另一項研究報道了中重度膽管炎（2～3級）PBC患者的miR-299-5p表達水平顯著高于輕度膽管炎（0～1級）[57]。相比之下，活動性肝炎的嚴重程度與miR-299-5p表達水平無相關(guān)性[30]。與上述研究結(jié)果相似的是，miR-223-3p和miR-21-5p從PBC I期到III期顯示出一致的下調(diào)和表達抑制[49]。而在T細胞中，miR-let-7b的表達水平與Mayo風險評分、IL-18、ALP水平呈負相關(guān)，并隨著PBC嚴重程度的增加而表達降低（I＞II/III＞IV期）[52]。上述miRNAs有可能成為預測疾病進展的關(guān)鍵生物標志物。

2.3 miRNA在PBC中作為療效評價靶點的潛力 熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid, UDCA）是治療PBC的一線藥物，但仍有40%的PBC患者應用UDCA治療效果不佳。目前采用的療效評價存在耗時較長，檢測指標多等問題。在研究難治性PBC相關(guān)miRNA時發(fā)現(xiàn)，血清DBIL、AST、ALT、GGT水平升高與miR-122、miR-378f表達上調(diào)有關(guān)，miR-4311表達降低與AST和ALT水平下降有關(guān)，miR-4714-3p水平與TBIL、LDH水平呈負相關(guān)。研究者指出miR-125b，miR-let-7b，miR-520a-5p等miRNAs可能成為難治性PBC的潛在生物標志物[15]。研究顯示，對UDCA耐藥的PBC患者PBMC中的miR-299-5p的表達增加，miR-299-5p表達與ALP、GGT和IgM水平正相關(guān)[30]，提示通過miR-299-5p靶向蛋白與PBC的疾病活動和狀況相關(guān)。另一項研究也表明UDCA的治療反應與膽管減少癥的關(guān)系更密切[58]。上述研究初步地對耐藥PBC患者與健康人的miRNA表達差異進行討論，后續(xù)仍需要在耐藥組和敏感組PBC患者中進行進一步的對比和驗證，同時注意UDCA治療對PBC患者miRNA表達水平變化的影響。

2.4 基于miRNA作為靶點治療PBC的進展 在dnTGF-βRII小鼠中，研究者利用依諾沙星上調(diào)miR-346-5p、miR-326-3p、miR-181a、miR-145a-5p等miRNAs的表達，從而下調(diào)關(guān)鍵效應T細胞轉(zhuǎn)錄因子的表達，來介導IFN-γ和穿孔素的CD8+T細胞效應功能下調(diào)，有效地阻止自身免疫性膽道疾病的進展[59]。部分miRNA抑制劑（反義寡核苷酸）和miRNA類似物如miR-375抑制劑、antagomiR-155和miR-24類似物等已應用于某些疾病的治療。但目前僅有miR-125a納米顆粒和miR-103-3p外泌體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡和誘導肝星狀細胞活化中應用的報道[60-61]。miRNA在體內(nèi)不能保持有效抑制所需的高劑量，使得miRNA靶向藥物在臨床應用中受到限制[62]，病毒介導的miRNA轉(zhuǎn)染相關(guān)免疫反應的不良反應也未得到有效解決。

3 總結(jié)及展望

miRNA在PBC發(fā)病及進展的過程中具有關(guān)鍵作用，其機制研究將有利于探索PBC新的治療靶點，且特定miRNA組合可能在臨床實踐中具有診斷價值。雖然miRNA在PBC療效預測方面的作用也已被初步證實，但受限于樣本量及標準治療的影響，后續(xù)需要來自多個中心的更多人群以及接受治療前后的對比差異研究，來評估m(xù)iRNA與治療反應以及預后預測的臨床結(jié)果之間的相關(guān)性。miRNA作為無創(chuàng)生物標志物展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，是早期病情評估的重要補充。而探究在PBC發(fā)病過程中參與的miRNA可提供潛在的治療靶點選擇，為PBC提供新的診療策略思路。