劉瑤，喬海軍*，賈志龍*，張衛(wèi)兵，張春艷，霍尚蕾，苗景源，申夢娜

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學 理學院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070) 3(山東海能科學儀器有限公司，山東 濟南，250000)

近年來，隨著生活水平的提高，人們不僅追求高營養(yǎng)價值的乳制品，而且也越來越注重其風味品質(zhì)[1]。干酪(奶酪)被譽為“奶黃金”，因其富含蛋白質(zhì)、鈣等營養(yǎng)物質(zhì)，成為人類攝入乳制品的最佳選擇，而廣受消費者青睞。干酪的風味是消費者嗜好性選擇和決定其品質(zhì)的重要指標[2]，其風味特征在很大程度上是由揮發(fā)性風味物質(zhì)決定的，它們主要由原料乳中的風味物質(zhì)及加工過程中乳成分在酶及微生物代謝時產(chǎn)生[3]。牦牛乳干酪(yak milk cheese, YMC)是以新鮮牦牛乳為原料，經(jīng)添加發(fā)酵劑和凝乳酶凝乳制得的新鮮或發(fā)酵成熟的乳制品。YMC營養(yǎng)豐富、成熟期較長，且具有獨特的風味特征[4]。因此，系統(tǒng)研究YMC成熟過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)組成及差異，確定其特征揮發(fā)性風味化合物，對YMC產(chǎn)品的開發(fā)和風味品質(zhì)的控制具有重要意義。

目前，關(guān)于YMC風味物質(zhì)的研究報道相對較少，且不夠系統(tǒng)深入。如牛婕等[5]采用同時蒸餾萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從牦牛乳軟質(zhì)干酪中共鑒定出46種揮發(fā)性風味化合物。王寵等[6]采用固相微萃取結(jié)合GC-MS技術(shù)從牦牛乳硬質(zhì)干酪中共鑒定出32種揮發(fā)性成分，其中丁酸、異戊醇、甲酸甲酯、乙酸、正己酸和乙酸乙酯為主要揮發(fā)性成分。巨玉佳等[7]通過電子鼻技術(shù)輔助GC-MS分析認為己酸和2-丁醇是牦牛乳硬質(zhì)干酪關(guān)鍵香氣物質(zhì)。雖然GC-MS技術(shù)已廣泛用于食品揮發(fā)性風味物質(zhì)分析，但存在無法快速檢測、低含量組分定性不準確、需要復(fù)雜的預(yù)處理等缺點[8]。氣相-離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)技術(shù)結(jié)合了氣相色譜(GC)高分離能力和離子遷移譜(IMS)快速響應(yīng)的特點，且具有靈敏度高、響應(yīng)快、無需預(yù)處理、穩(wěn)定性好、可常壓下工作等優(yōu)點[9]，目前已被大量用于食品分類及揮發(fā)性風味物質(zhì)指紋圖譜的建立[10]、食品新鮮度和變質(zhì)評估[11]以及檢測食品儲存過程中揮發(fā)性成分的變化[12]等方面。然而，GC-IMS技術(shù)用于發(fā)酵乳制品揮發(fā)性風味成分的檢測鮮見報道，將其用于YMC揮發(fā)性風味化合物的分析尚未報道。

本研究以自制YMC為研究對象，采用GC-IMS技術(shù)建立不同成熟階段YMC的指紋圖譜，結(jié)合偏最小二乘-判別分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)、主成分分析(principal component analysis, PCA)和熱圖分析，解析YMC成熟過程中揮發(fā)性組分及差異，并篩選潛在特征揮發(fā)性化合物，以期探明不同成熟階段YMC揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化規(guī)律，為進一步闡明其特征揮發(fā)性風味化合物的代謝機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛乳，甘肅省天祝藏族自治縣紅疙瘩牧場(夏季牧場)；發(fā)酵劑(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌)，丹尼斯克(中國)有限公司；凝乳酶(小牛皺胃酶和牛胃蛋白酶質(zhì)量比為7∶3，酶活力890 IMCU/g)，北京多愛特生物科技有限公司；正構(gòu)酮類C4～C9(2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮和2-壬酮)(分析純)，北京國藥集團化學試劑有限公司；NaCl、無水CaCl2、無水Na2SO4(均為分析純)，天津市北辰方正試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

FlavourSpecc?風味分析儀，德國G.A.S公司；PR224ZH/E析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；XH-C旋渦混合器，金壇區(qū)白塔新寶儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

參考王寵等[6]的方法并適當修改。新鮮牦牛乳通過63 ℃巴氏殺菌30 min后冷卻至室溫，添加質(zhì)量濃度為0.006 2 g/L已活化的發(fā)酵劑發(fā)酵1 h，測其pH值為6.2時，添加質(zhì)量濃度為0.03 g/L的CaCl2，并加入質(zhì)量濃度為0.50 g/L的小牛皺胃酶溶液凝乳80 min，經(jīng)切割、排乳清后，再加入凝塊質(zhì)量2%的NaCl，并在42 ℃加熱20 min后二次排乳清，堆釀30 min裝入模具壓榨成型，真空包裝后置于人工氣候箱，15 ℃條件下分別成熟1、30、60、90、120、150、180 d。

1.3.2 牦牛乳干酪成熟過程中揮發(fā)性風味成分分析

準確稱取3.00 g YMC樣品和3.00 g NaCl，放入研缽研勻后，加入20 mL頂空瓶密封，進行GC-IMS分析，每個樣品平行3次。

頂空進樣條件：孵育溫度80 ℃；孵育時間20 min；進樣針溫度85 ℃；進樣體積200 μL。

GC條件：色譜柱：MXT-5(15 m×0.53 mm×1.0 μm)；柱溫60 ℃；初始流速2 mL/min，保持2 min；10 min內(nèi)線性升至10 mL/min，不保持；20 min內(nèi)線性升至100 mL/min，保持10 min。

IMS條件：漂移氣流量150 mL/min；載氣/漂移氣：N2(純度≥99.999%)；載氣流量0～2 min，2 mL/min；IMS溫度45 ℃。

1.4 統(tǒng)計分析

利用儀器配套的分析軟件VOCal、GC×IMS Library Search和內(nèi)置插件(Reporter、Gallery Plot和Dynamic PCA插件)進行數(shù)據(jù)采集和分析。應(yīng)用Library Search軟件內(nèi)置的NIST和IMS數(shù)據(jù)庫進行定性分析；利用Reporter和Gallery Plot插件對比指紋圖譜的差異；利用Dynamic PCA插件進行聚類分析。采用SIMCA-P14.1軟件進行PLS-DA建模分析。采用origin 2018進行統(tǒng)計分析及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟階段牦牛乳干酪GC-IMS揮發(fā)性風味物質(zhì)差異分析

由Reporter插件生成不同成熟階段YMC揮發(fā)性風味物質(zhì)的GC-IMS三維譜圖，由圖1所示，其中X軸為遷移時間，Y軸為保留時間，Z軸為峰強度[9]。成熟1 d時YMC的揮發(fā)性風味物質(zhì)種類最少；成熟30～90 d時揮發(fā)性風味物質(zhì)種類相似，但信號強度有所不同；成熟120～180 d時揮發(fā)性風味物質(zhì)明顯多于成熟1～90 d時的YMC樣品；不同成熟階段YMC的揮發(fā)性風味物質(zhì)差異較大。

圖2-a是不同成熟階段YMC揮發(fā)性風味物質(zhì)的GC-IMS二維譜圖。不同成熟階段樣品間揮發(fā)性風味物質(zhì)的差異主要體現(xiàn)在離子峰的位置、數(shù)量、強度和時間上。背景為藍色，橫坐標1.0處紅色豎線為反應(yīng)離子峰(reaction ion peak, RIP)。RIP峰兩側(cè)的每1個點代表1種揮發(fā)性風味化合物，顏色代表物質(zhì)的信號強度。白色表示低強度，紅色表示高強度，顏色越深，強度越大[9]。為了更加清晰地比較樣品之間的差異，采用差異對比模式，結(jié)果見圖2-b。通過從二維俯視圖(以15-CR-1 d為背景)中扣除背景，得到樣品揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化差異圖，扣除背景后為白色，紅色表示物質(zhì)濃度高于參考值，藍色表示物質(zhì)濃度低于參考值[9]。從圖2-b可以更加直觀看出，大多數(shù)紅色信號(圖2-b中紅色框區(qū)域)出現(xiàn)在100～600 s的停留時間范圍內(nèi)，漂移時間為1.0～1.5 ms；成熟120～180 d時，漂移時間迅速增加至1.8 ms；此外，圖2-b紅框中紅色點的數(shù)量明顯增加，且紅色點的顏色逐漸加深，這表明隨著成熟時間的延長，揮發(fā)性風味物質(zhì)在逐漸積累，這與程晶晶等[13]的研究結(jié)果相似。

2.2 不同成熟階段牦牛乳干酪GC-IMS揮發(fā)性風味物質(zhì)定性分析

采用FlavourSpec?GC-IMS內(nèi)置的NIST和IMS數(shù)據(jù)庫，結(jié)合保留指數(shù)、保留時間和遷移時間，以正構(gòu)酮類作為外標物計算每種揮發(fā)性物質(zhì)的保留指數(shù)，進行化合物定性分析[14]，不同成熟階段YMC的揮發(fā)性風味物質(zhì)定性分析結(jié)果見表1(其中部分化合物以單體和二聚體形態(tài)存在)。

a-二維俯視圖；b-差異圖譜圖2 不同成熟階段YMC的GC-IMS二維譜圖Fig.2 Two dimensional GC-IMS spectra of YMC at different ripening stages

表1 不同成熟階段牦牛乳干酪中揮發(fā)性化合物定性鑒定結(jié)果Table 1 Qualitative identification results of volatile compounds of YMC at different ripening stages

由表1可知，從檢測到的46個信號峰中，共鑒定了22種揮發(fā)性風味化合物，包括8種酯類、5種酮類、4種醇類、3種醛類、1種吡啶類和1種其他類。其中酯類包括乙酸乙酯二聚體、己酸乙酯二聚體、丙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸異戊酯、2-甲基丁酸乙酯和辛酸乙酯，MOLIMARD等[15]認為酯類物質(zhì)是由干酪成熟過程中脂肪酸與乳糖發(fā)酵產(chǎn)生的醇類酯化反應(yīng)產(chǎn)生，它們?yōu)閅MC貢獻了濃郁果香味；酮類包括乙偶姻、2-庚酮二聚體、2-丁酮、2-戊酮二聚體和雙乙酰，它們主要由不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生[16]，為YMC提供了奶油香味和辛辣味；醇類包括乙醇、正丁醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇和正己醇，主要來源于乳糖代謝、甲基酮還原、氨基酸代謝和亞油酸、亞麻酸降解等[17]，賦予了YMC辛辣味、酒香、嫩枝氣息和脂香味；醛類包括異戊醛二聚體、正戊醛、苯甲醛，脂肪酸代謝或Strecker降解可能是醛類化合物的主要來源[18]，為YMC提供了蘋果味和杏仁味；而2,4,6,-三甲基吡啶和烯丙基腈為YMC貢獻了芳香味和大蔥味。這些揮發(fā)性物質(zhì)共同構(gòu)建了YMC獨特的風味。

2.3 不同成熟階段牦牛乳干酪揮發(fā)性風味物質(zhì)指紋圖譜

為解析不同成熟階段YMC揮發(fā)性風味化合物的差異性，根據(jù)GC-IMS二維圖譜中全部信號峰，構(gòu)建了不同成熟階段YMC揮發(fā)性風味化合物指紋圖譜，如圖3所示，并標識了不同成熟階段的特征峰區(qū)域。橫坐標表示所檢測到的揮發(fā)性風味化合物，縱坐標表示不同成熟階段，每一行代表1個成熟階段所選全部信號峰的3次平行，每一列代表不同成熟階段檢測到的YMC揮發(fā)性風味化合物信號峰(顏色越深，反應(yīng)該物質(zhì)的含量較高)。橫坐標中阿拉伯數(shù)字表示的化合物未被定性，不作分析。

從指紋圖譜(圖3)可以看出不同成熟階段YMC樣品中揮發(fā)性風味物質(zhì)組成及差異。為了方便觀察比較，將其分為5個區(qū)域(圖3)，分別為A、B、C、D、E。圖中A區(qū)域為成熟1 d時YMC的揮發(fā)性風味物質(zhì)，在成熟過程中含量逐漸降低，主要有乙偶姻、乙醇、戊醛和2-庚酮二聚體，而戊醛的濃度在成熟60 d時有所提升。圖中B區(qū)域物質(zhì)(3-甲基-3-丁烯-1-醇)代表成熟30 d時YMC的揮發(fā)性風味物質(zhì)，其濃度遠大于其他成熟階段樣品，并為YMC提供了清香味和青草味，這與GARDE等[19]研究結(jié)果一致。圖中C區(qū)域物質(zhì)(乳酸乙酯、烯丙基腈和雙乙酰)代表成熟60 d時YMC的揮發(fā)性風味物質(zhì)。圖中D區(qū)域物質(zhì)顯示了成熟120 d時YMC的揮發(fā)性風味物質(zhì)，主要有丙酸乙酯、異戊醛二聚體、己酸乙酯二聚體、2-丁酮、2-甲基丁酸乙酯、辛酸乙酯和2,4,6-三甲基吡啶，且在成熟過程中濃度先升高后降低。圖中E區(qū)域物質(zhì)(丁酸乙酯、乙酸異戊酯、1-丁醇、苯甲醛、1-己醇、2-戊酮二聚體和乙酸乙酯二聚體)代表成熟180 d時YMC的揮發(fā)性風味物質(zhì)，其在整個成熟過程中的峰顏色明顯較深，表明這些物質(zhì)的含量高于其他成熟階段YMC的樣品，而乙酸乙酯、丁酸乙酯和2-戊酮等，與巨玉佳等[7]報道的牦牛乳硬質(zhì)干酪中揮發(fā)性風味物質(zhì)的研究結(jié)果一致。此外，在成熟過程中，乙偶姻、戊醛、3-甲基-3-丁烯-1-醇、乳酸乙酯、烯丙基腈、雙乙酰、丙酸乙酯、異戊醛和2,4,6-三甲基吡啶，在牛婕等[5]從牦牛乳軟質(zhì)干酪鑒定出32種揮發(fā)性成分中未見報道。

圖3 不同成熟階段YMC中揮發(fā)性有機物的指紋圖譜Fig.3 Gallery fingerprint of volatile organic compounds of YMC at different ripening stages

從YMC不同成熟階段揮發(fā)性風味物質(zhì)的相對含量柱狀圖(圖4)可進一步看出，YMC中揮發(fā)性成分以酮類(31%～66%)、酯類(8%～45%)和醇類(8%～20%)為主，其次是醛類(3%～9%)和吡啶類(1%～8%)。成熟1 d的YMC中揮發(fā)性風味物質(zhì)主要是酮類、醇類、醛類和酯類。成熟30～60 d時酮類、醛類、醇類含量逐漸降低，當成熟90 d時，酮類化合物含量有所增加，這可能是由于干酪中脂肪酸含量顯著降低，部分脂肪酸在微生物作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆猍20]而導(dǎo)致的，這與牛婕等[5]研究結(jié)果一致；醛類容易被氧化成酸類或者還原為醇類[17]；醇類與脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)形成酯類物質(zhì)[15]，這可能是導(dǎo)致醇類含量降低而酯類含量有所上升的主要原因。此外，隨著成熟時間的延長，酯類逐漸積累，在很大程度上，酯類可以掩蓋因脂肪酸類化合物濃度過高所帶來的不愉快的味道，從而賦予干酪更加柔和的風味[21]。

圖4 YMC成熟過程中揮發(fā)性組分相對含量變化Fig.4 The changes of relative contents of volatile components during the ripening of YMC

2.4 不同成熟階段牦牛乳干酪中揮發(fā)性風味物質(zhì)PLS-DA及模型驗證

PLS-DA是一種將數(shù)據(jù)進行降維，實現(xiàn)復(fù)雜數(shù)據(jù)的可視化及判別分析和預(yù)測[22]。利用PLS-DA得分圖對不同成熟時間的YMC揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析，結(jié)果如圖5-a所示。隨機改變分類變量的排列順序建立相應(yīng)的模型，R2X=0.995，R2Y=0.996，當R2和Q2處于0.5～1時，表明模型有較好的概括解釋率，Q2=0.99表示模型有較好的預(yù)測能力。當模型的穩(wěn)定性和預(yù)測能力都比較好時，說明構(gòu)建的模型穩(wěn)定性及預(yù)測能力均達到要求，可用于區(qū)分不同成熟時間YMC中揮發(fā)性風味物質(zhì)組成的差異。

利用置換檢驗對PLS-DA所做的模型進行驗證，在PLS-DA中使用7倍交叉驗證預(yù)測殘差(CV-ANOVA)方差分析和200次順序上的置換重新得出評價模型的性能指標結(jié)果如圖5-b所示。圖中Q2代表累計交叉預(yù)測能力，數(shù)值與模型預(yù)測能力成正比關(guān)系；R2代表累計方差值，表示有多少原始數(shù)據(jù)被用來建立新的PLS-DA判別模型，數(shù)值越大則表示模型的解釋能力越強[23]。其中，R2X=0.995，R2Y=0.996，Q2=0.990，R2X-R2Y<0.3，則表明所建模型擬合效果可靠。從圖5-b可以看出，R2與左邊縱軸相交(0，0.247)，Q2與左邊縱軸相交(0，-0.68)，2條回歸線斜率較大，且所有的R2和Q2原始值均高于試驗值，這表明該模型具有較好預(yù)測能力，無過擬合現(xiàn)象，可用于不同成熟階段YMC揮發(fā)性風味物質(zhì)的分類判別。

依據(jù)PLS-DA模型中的變量重要性(variable important for the projection, VIP)將每個變量對YMC風味的貢獻進一步量化(圖5-c)，篩選VIP>1的揮發(fā)性風味化合物作為潛在特征揮發(fā)性標志物[24](VIP值越大，差異越顯著)。從圖5-c中可看出共篩選了12種VIP>1的潛在特征揮發(fā)性標志物，分別是3-甲基-3-丁烯-1-醇、乙酸乙酯二聚體、乙偶姻、乙酸異戊酯、乙醇、丁酸乙酯、2-丁酮、正丁醇、己酸乙酯二聚體、烯丙基腈、2-戊酮和苯甲醛。

a-得分圖；b-PLS-DA擬合曲線；c-VIP值分布圖5 不同成熟時間YMC中揮發(fā)性有機物的得分圖、 PLS-DA擬合曲線及VIP值分布Fig.5 Score plot,PLS-DA simulation and VIP distribution of YMC volatile components at different ripening stages

2.5 不同成熟時間牦牛乳干酪特征揮發(fā)性風味物質(zhì)聚類分析

通過PCA可直觀地判別區(qū)分YMC樣品間的差異。從圖6-a不同成熟階段YMC主成分分析結(jié)果可以看出，PC1(53.00%)和PC2(17.00%)的累積方差貢獻率為70.00%，這表明PCA分離模型是有效的[25]。與成熟30～180 d的樣品相比，成熟1 d的樣品相距較遠，樣品間組分差異最大，成熟30～90 d的YMC樣品分布在同一象限，距離較近，說明它們之間組分差異較小，成熟120～180 d的YMC樣品彼此接近，都分布在第一象限，這表明樣品間揮發(fā)性風味組分差異較小。顯然，每個樣本都可以區(qū)分于其他樣本，基于PCA分析結(jié)果能較好地區(qū)分YMC的不同成熟階段。

a-主成分分析；b-聚類熱圖圖6 不同成熟階段YMC特征揮發(fā)性物質(zhì) 主成分及聚類熱圖分析Fig.6 PCA and clustering heat map of characteristic volatile organic compounds of YMC at different ripening stages

為了直觀區(qū)分不同成熟階段YMC特征揮發(fā)性化合物的變化，依據(jù)篩選出的12種特征揮發(fā)性標志物的峰強度值繪制熱圖(圖6-b)。從圖6-b聚類熱圖的凝聚層級聚類分析結(jié)果可以看出，YMC的成熟階段分為3個時期，分別為成熟前期(1 d)、成熟中期(30、60、90 d)和成熟后期(120、150、180 d)。YMC特征揮發(fā)性風味化合物在不同成熟時期存在明顯差異，在YMC成熟前期，2-戊酮二聚體、苯甲醛、乙偶姻和乙醇含量相對較高，其中乙醇在成熟前期含量最高，且隨著成熟時間的延長而降低；成熟中期YMC樣品揮發(fā)性風味物質(zhì)種類較少，其中烯丙基腈和3-甲基-3-丁烯-1-醇在成熟中期含量最高，成熟后期隨之降低；成熟后期YMC揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類較多，其中正丁醇、丁酸乙酯、2-戊酮二聚體、2-丁酮、己酸乙酯二聚體、苯甲醛和乙酸異戊酯含量最高，因此它們是YMC成熟后期的特征揮發(fā)性標志物。

3 結(jié)論

本研究采用GC-IMS技術(shù)對YMC成熟過程中揮發(fā)性風味化合物的變化進行了分析，從46個信號峰中共鑒定出22種揮發(fā)性風味物質(zhì)，包括4種醇類、5種酮類、3種醛類、8種酯類、1種吡啶和1種其他。不同成熟時間YMC中揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量存在明顯差異，成熟前期(1 d)乙醇含量最高；成熟中期(30、60、90 d)，烯丙基腈和3-甲基-3-丁烯-1-醇含量最高，且隨著成熟時間延長含量呈遞減趨勢；成熟后期(120、150、180 d)正丁醇、丁酸乙酯、2-戊酮二聚體、2-丁酮、己酸乙酯二聚體、苯甲醛和乙酸異戊酯含量最高。PLS-DA和熱圖分析結(jié)果共篩選出了12種潛在特征揮發(fā)性標志物(VIP>1)，包括3-甲基-3-丁烯-1-醇、乙酸乙酯二聚體、乙偶姻、乙酸異戊酯、乙醇、丁酸乙酯、2-丁酮、正丁醇、己酸乙酯二聚體、烯丙基腈、2-戊酮和苯甲醛。主成分分析結(jié)果表明，能較好區(qū)分不同成熟時間的YMC樣品。研究結(jié)果可為YMC產(chǎn)品的開發(fā)和風味品質(zhì)的控制提供依據(jù)，并為進一步闡明其特征揮發(fā)性風味化合物的代謝機理奠定基礎(chǔ)。