蘆隱月，宋馨，夏永軍，王光強(qiáng)，艾連中，熊智強(qiáng)

(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是一類能發(fā)酵碳水化合物生成乳酸的細(xì)菌總稱，主要包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和明串珠菌屬(Leuconostoc)[1]。乳酸菌能夠減輕乳糖不耐癥、減輕病毒和藥物引起的腹瀉、輔助治療潰瘍、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[1]、防治齲齒、預(yù)防II型糖尿病和肥胖以及降低血清膽固醇水平[2]。乳酸菌在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛，例如生產(chǎn)乳制品、肉制品、泡菜、飲料和天然防腐劑。酸奶發(fā)酵劑主要菌種是保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)，其他乳酸菌作為輔助，以不同比例共生形成用于酸奶發(fā)酵的微生物菌群[3]。

雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component signal transduction system, TCS)是細(xì)菌中重要的信號機(jī)制，經(jīng)典TCS由跨膜受體組氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase, HPK)和同源胞質(zhì)內(nèi)應(yīng)答調(diào)控蛋白(response regulator protein, RR)組成，細(xì)菌通過TCS將環(huán)境刺激與適應(yīng)性反應(yīng)相結(jié)合，調(diào)控新陳代謝和運(yùn)動等基本生理活動以及發(fā)育和毒力等特殊過程。HPK感應(yīng)外界信號刺激后磷酸化自身保守的組氨酸殘基，將磷酸化基團(tuán)轉(zhuǎn)移到RR的保守天冬氨酸殘基上，從而激活RR效應(yīng)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行應(yīng)答調(diào)控[4](圖1)。目前已有許多有關(guān)TCS的報道，例如EnvZ/OmpR TCS調(diào)控大腸桿菌OmpC蛋白表達(dá)，在乙醇耐受中起關(guān)鍵作用[5]；SalK/SalR、Ihk/Irr、VirR/VirS、NisK/NisR、1910HK/RR等TCS與豬鏈球菌毒力相關(guān)[6]；PhoP/PhoQ TCS可以感知二價陽離子、低pH和陽離子抗菌肽的存在，調(diào)控大腸桿菌或沙門氏菌中Mg2+穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞膜組成、抗逆性和毒力[7]。

圖1 經(jīng)典TCSFig.1 Classical two-component signal transduction system

1 保加利亞乳桿菌TCS

作為最重要的工業(yè)乳酸菌，保加利亞乳桿菌能利用牛奶中乳糖厭氧發(fā)酵快速合成乳酸，因此在發(fā)酵乳制品生產(chǎn)中被廣泛使用。不同保加利亞乳桿菌的TCS數(shù)量有所差異，如保加利亞乳桿菌ATCC BAA 365具有7對完整的TCS，而ATCC 11842菌株僅有5對完整的TCS及1個孤立HPK和1個孤立RR[8-9]。

1.1 調(diào)控酸適應(yīng)性

在酸奶發(fā)酵過程中生長環(huán)境明顯酸化，pH值從6.5下降到4.2左右。因此，酸適應(yīng)能力和耐受性對保加利亞乳桿菌具有重要意義[10]。CUI等[11]采用定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative PCR, qPCR)方法評估保加利亞乳桿菌CH3菌株TCS在酸適應(yīng)過程中的基因表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)2個TCSJN675228/JN675229和JN675230/JN675231及2個HPK編碼基因JN675236和JN675240表達(dá)量上調(diào)，推測其與酸適應(yīng)能力有關(guān)。為驗證此推測，作者選取TCSJN675228(HPK編碼基因)/JN675229(RR編碼基因)進(jìn)行敲除，2個突變菌株的生長能力均比野生型顯著下降；JN675228敲除對菌株酸適應(yīng)能力影響不大，而JN675229敲除使菌株酸適應(yīng)能力下降。酵母雙雜交實驗也證實JN675228和JN675229編碼蛋白之間存在直接相互作用。這些結(jié)果表明保加利亞乳桿菌中TCSJN675228/JN675229與酸適應(yīng)能力密切相關(guān)。為進(jìn)一步研究JN675228/JN675229在保加利亞乳桿菌酸適應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，WANG等[10]采用二維凝膠電泳和飛行時間質(zhì)譜法，篩選出在自然發(fā)酵和酸適應(yīng)條件下JN675228/JN675229基因敲除突變株與野生菌株的差異表達(dá)蛋白，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)鑒定JN675228/JN675229的靶基因(表1)。結(jié)果表明TCSJN675228/JN675229通過多種途徑調(diào)控保加利亞乳桿菌的酸適應(yīng)能力，包括調(diào)控質(zhì)子泵相關(guān)蛋白、經(jīng)典應(yīng)激休克蛋白、碳水化合物代謝、核苷酸生物合成、DNA修復(fù)轉(zhuǎn)錄和翻譯、肽轉(zhuǎn)運(yùn)和降解及細(xì)胞壁生物合成。

表1 保加利亞乳桿菌CH3菌株TCS系統(tǒng)JN675228/JN675229靶基因Table 1 Target genes of two-component signal transduction system JN675228/ JN675229 in L.bulgaricus CH3

續(xù)表1

1.2 調(diào)控細(xì)胞自溶

乳酸菌自溶對乳制品加工至關(guān)重要，在干酪成熟過程，乳酸菌通過自溶將胞內(nèi)肽酶釋放到干酪中，降解氨基酸產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)[12]；而在生產(chǎn)酸奶時乳酸菌自溶則會降低起始菌株的活細(xì)胞數(shù)[13]。PANG等[14]通過生物信息學(xué)方法對保加利亞乳桿菌BAA-365中TCS進(jìn)行功能預(yù)測(表2)，結(jié)果顯示BAA-365中5對TCS功能與細(xì)胞自溶無關(guān)，2個功能未知。對其RR(WP_011543855.1和WP_011677872.1)編碼基因敲除，細(xì)胞自溶評估實驗表明WP_011543855.1編碼基因敲除對菌株的自溶率和菌落總數(shù)沒有明顯影響，而WP_011677872.1編碼基因敲除使菌株自溶率顯著降低，菌落總數(shù)顯著上升，基因回補(bǔ)后差異消除。酵母雙雜交實驗證實WP_011677872.1和WP_011677871.1存在直接相互作用。因此，TCS WP_011677872.1/WP_011677871.1調(diào)控保加利亞乳桿菌細(xì)胞自溶。此外，這對TCS還參與群體感應(yīng)信號分子肽II調(diào)控細(xì)胞密度[15]。

表2 保加利亞乳桿菌BAA-365菌株TCS系統(tǒng)功能預(yù)測Table 2 Functional prediction of two-component signal transduction system in L.bulgaricus BAA-365

2 嗜熱鏈球菌TCS

嗜熱鏈球菌是一種同型發(fā)酵乳酸菌，在適應(yīng)牛奶環(huán)境過程中，嗜熱鏈球菌失去了許多與毒力和糖利用相關(guān)的基因，但保留了參與牛奶發(fā)酵所需的氮代謝和乳糖利用等功能基因[16]。另外，嗜熱鏈球菌的代謝產(chǎn)物胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)不僅具有降低膽固醇、抗腫瘤和促進(jìn)腸道黏附等生理功能，還能作為食品添加劑和穩(wěn)定劑顯著改善食品物性[17]。產(chǎn)EPS與核苷酸糖代謝和EPS生物合成相關(guān)基因的高轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)[18]，精氨酸代謝調(diào)控蛋白ArgR能特異性結(jié)合eps基因簇啟動子，負(fù)調(diào)控EPS合成[19]。

不同嗜熱鏈球菌菌株具有6～8對完整TCS，例如嗜熱鏈球菌LMD-9菌株具有6對完整TCS(TCS02、04、05、06、07和09)及2個孤立RR(RR01和RR08)，其中TCS05對嗜熱鏈球菌生長至關(guān)重要。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明嗜熱鏈球菌LMD-9菌株所有RR基因在牛奶發(fā)酵過程中表達(dá)，但其表達(dá)水平不同[20]。

2.1 調(diào)控生產(chǎn)特性

牛奶發(fā)酵中嗜熱鏈球菌產(chǎn)生乳酸，使環(huán)境pH迅速下降，有助于牛奶酸化；嗜熱鏈球菌合成EPS，有助于提高乳制品的黏度和改善質(zhì)地[21]；嗜熱鏈球菌蛋白水解活性與生長能力、牛奶酸化速率和芳香化合物形成密切相關(guān)。HU等[22]從內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)酸奶樣品中分離鑒定出22株嗜熱鏈球菌，根據(jù)已公布的嗜熱鏈球菌TCS序列信息，設(shè)計引物擴(kuò)增22株嗜熱鏈球菌的TCS。結(jié)果表明，22株嗜熱鏈球菌均具有8對TCS，但不同菌株的TCS基因序列存在差異。聚類分析發(fā)現(xiàn)菌株的不同生產(chǎn)特性與TCS差異存在相關(guān)性，其中系統(tǒng)發(fā)育樹屬于Ⅰ-1組和主成分分析屬于A簇菌株，它們具有較高的牛奶酸化活性、EPS合成能力、蛋白水解活性等相似的生產(chǎn)特性；系統(tǒng)發(fā)育樹屬于Ⅲ組和主成分分析屬于A簇菌株，TCS數(shù)量和基因序列完全相同，表現(xiàn)出相似的碳水化合物利用能力及牛奶酸化活性；而系統(tǒng)發(fā)育樹屬于Ⅳ-2組和主成分分析屬于B簇的菌株，與其他菌株相比具有獨(dú)特的TCS序列，表現(xiàn)出顯著不同的生產(chǎn)特性。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究嗜熱鏈球菌TCS與生產(chǎn)特性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

2.2 調(diào)控細(xì)菌素生產(chǎn)

細(xì)菌素是細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體途徑合成的一類具有抗菌活性的多肽類物質(zhì)。乳酸菌細(xì)菌素具有良好的生物安全性、穩(wěn)定性及適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點[23]，在食品防腐保鮮方面應(yīng)用廣泛。HOLS等[20]在嗜熱鏈球菌基因組中發(fā)現(xiàn)II類細(xì)菌素基因簇，與肺炎鏈球菌類細(xì)菌素肽(bacteriocin-like peptide, blp)基因簇blpSp相似，命名為嗜熱鏈球菌blpSt。LMD-9blpSt基因簇包含23個基因，分為6個操縱子，包括肽轉(zhuǎn)運(yùn)基因和信息素基因blpABCSt，TCS基因blpRHSt(即TCS09，BlpHSt和BlpRSt分別為HPK和RR)，細(xì)菌素前體和免疫基因blpDSt-orf1、blpUSt-orf3和blpE-FSt及功能未知基因blpG-XSt。為研究blpSt基因簇功能，F(xiàn)ONTAINE等[24]構(gòu)建blpSt敲除突變株，在以BlpCSt為前體的成熟信息素誘導(dǎo)下通過spot-on-lawn法和覆蓋法觀察其細(xì)菌素生產(chǎn)和免疫力表型(表3)，結(jié)果表明blpSt基因簇與細(xì)菌素生產(chǎn)和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。通過Northern印跡雜交進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，blpSt啟動子中存在直接重復(fù)序列ACCATTCGGG和ACTTTTTGGG，作為BlpRSt假定結(jié)合位點；細(xì)菌素生產(chǎn)受BlpCSt濃度和生長階段調(diào)控，表現(xiàn)出群體感應(yīng)特征。這些結(jié)果證明blpSt基因簇調(diào)控細(xì)菌素生產(chǎn)，通過信息素介導(dǎo)的群體感應(yīng)激活TCS09完成調(diào)控。FONTAINE等[25]后續(xù)證明blpSt基因簇編碼嗜熱鏈球菌素9多肽細(xì)菌素系統(tǒng)，能抑制鏈球菌、糞腸球菌、乳酸桿菌和部分李斯特菌等大多數(shù)與嗜熱鏈球菌密切相關(guān)的細(xì)菌生長。另外，在嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌共培養(yǎng)條件下，blpRSt表達(dá)量增加6倍，表明TCS09的表達(dá)顯著受保加利亞乳桿菌的影響[20]。

表3 嗜熱鏈球菌LMD-9及其敲除突變株表型Table 3 Phenotype of S.thermophilus LMD-9 derivatives

2.3 調(diào)控桿菌肽耐藥性

桿菌肽是由芽孢桿菌產(chǎn)生的一種新型環(huán)狀肽抗生素[26]，對革蘭氏陽性細(xì)菌和陰性球菌及螺旋體均有殺菌作用，主要作用機(jī)制是抑制細(xì)菌肽聚糖合成，通過與膜受體十一烯丙基焦磷酸結(jié)合，阻止細(xì)胞壁的生物合成，抑制其去磷酸化，從而破壞十一烯丙基磷酸的再生[27]。因其具有廣譜抗菌活性、禽畜低吸收率、快速排泄率、高安全性和不易產(chǎn)生耐藥性等特點，在飼料行業(yè)被廣泛用作飼料添加劑[28]。嗜熱鏈球菌LMD-9中TCS06和TCS07在基因組上位置接近，TCS06同源物常在乳酸桿菌中被發(fā)現(xiàn)[29]，TCS07及其上游潛在的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與枯草芽孢桿菌解毒模塊BceRS/AB系統(tǒng)同源，推測TCS06和TCS07與嗜熱鏈球菌桿菌肽耐藥性相關(guān)。為驗證此推測，THEVENARD[30]等采用qPCR方法評估TCS06和TCS07附近基因在桿菌肽耐藥中表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)rr07及其上游ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因STER_1 308-1307表達(dá)量上調(diào)，并且RR07顯著誘導(dǎo)STER_1308表達(dá)。生長實驗發(fā)現(xiàn)，rr07和STER_1 308-1307敲除突變株對桿菌肽更敏感。這些結(jié)果表明TCS07及其ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)成一個解毒模塊，STER_1 308-1307在桿菌肽的泵出中發(fā)揮重要作用，且受TCS07正向調(diào)控。鼠李糖-葡萄糖多糖(rhamnose-glucose polysaccharide，RGP)合成途徑中，dTDP-4-脫氫鼠李糖3,5-差向異構(gòu)酶RmlC催化D-葡萄糖-1-磷酸生成dTDP -L-鼠李糖，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶RgpI控制RGP鼠李糖骨架上形成葡萄糖分支。在桿菌肽脅迫下，野生型菌株rmlC和rgpI表達(dá)量顯著上調(diào)，rr06敲除菌株中3種RGP聚合酶編碼基因rgpA、rgpB和rgpC表達(dá)量也顯著上調(diào)。rmlC敲除突變株對桿菌肽的敏感性顯著提高，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞膜形態(tài)異常。以上結(jié)果表明TCS06可能通過調(diào)控RGP合成和細(xì)胞膜形態(tài)影響嗜熱鏈球菌的桿菌肽耐藥性。

2.4 調(diào)控抗逆性

嗜熱鏈球菌Sfi39發(fā)酵性能優(yōu)良，但抗逆性較差[31]。Sfi39對數(shù)生長期細(xì)胞對酸和氧敏感，但對滲透壓和熱較為耐受；酸或熱適應(yīng)均使Sfi39耐熱性顯著提升，耐酸性略微提升，而氧耐受性不受酸或熱適應(yīng)的影響[32]。ZOTTA等[33]構(gòu)建covR同源基因rr01敲除突變株比較其耐受表型。與野生型菌株相比，rr01敲除菌株對數(shù)生長期和穩(wěn)定期細(xì)胞的酸和氧耐受性均顯著提高，熱和滲透耐受性均顯著降低；與未經(jīng)適應(yīng)的rr01敲除株對數(shù)生長期細(xì)胞相比，酸或熱適應(yīng)均使其酸耐受性顯著提高，滲透耐受性顯著降低，酸適應(yīng)使熱耐受性略微提高，氧耐受性無明顯變化，熱適應(yīng)使熱耐受性和氧耐受性顯著降低；rr01敲除突變株的SDS-PAGE圖譜與野生型相似，但主成分分析表明兩者存在顯著差異。以上結(jié)果表明rr01敲除使熱和滲透耐受性降低，但機(jī)制仍有待研究。

3 總結(jié)與展望

作為細(xì)菌中最常見的信號機(jī)制，TCS一直是研究熱點。許多細(xì)菌TCS已有深入研究，尤其是致病菌TCS憑借其基因保守性特點，成為新興安全高效的藥物作用靶點。但乳酸菌TCS的研究偏少，例如保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌中多數(shù)TCS功能仍不清晰，而植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌等其他常見乳酸菌的TCS功能知之甚少，且乳酸菌TCS研究主要集中在RR，對HPK鮮有涉及。制約乳酸菌TCS研究的關(guān)鍵因素之一是其基因編輯方法缺乏。根據(jù)已有的研究表明，TCS與乳酸菌的生長和功能活性息息相關(guān)。因此，研究乳酸菌TCS的調(diào)控機(jī)制，有助于利用傳統(tǒng)選育、分子生物學(xué)和代謝工程等方法改善乳酸菌的生長和性能，開發(fā)出更加優(yōu)良的酸奶發(fā)酵劑菌種。