■張 軒

(武漢設(shè)計工程學(xué)院，湖北武漢 430205)

酵母培養(yǎng)物作為一種微生態(tài)制劑，是由酵母菌，主要是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[1]，在現(xiàn)代發(fā)酵工藝控制下采用液、固態(tài)相結(jié)合或直接在固體培養(yǎng)基上發(fā)酵后連同固體基質(zhì)一起加工制得的產(chǎn)品，其主要成分是酵母發(fā)酵固體基質(zhì)產(chǎn)生的細胞外代謝產(chǎn)物、發(fā)酵后變性的固體基質(zhì)、酵母細胞內(nèi)容物以及酵母細胞壁[2]。酵母培養(yǎng)物含礦物質(zhì)、B族維生素、增味物質(zhì)、消化酶、甘露寡糖、β-葡聚糖和氨基酸以及“未知促生長因子”等，這些物質(zhì)對于動物胃腸道中的微生物而言是絕好的營養(yǎng)底物，可以激發(fā)它們的代謝活性和穩(wěn)定體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境[2]，進而提高動物的生產(chǎn)性能。酵母培養(yǎng)物具有綠色天然、無毒副作用以及適口性好、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點[3]，是集保健和營養(yǎng)等多重功效為一體的微生態(tài)飼料添加劑[4]。

近些年來，在養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)過程中，大量持續(xù)的使用抗生素等化學(xué)類飼料添加劑，使得動物胃腸道菌群失調(diào)，產(chǎn)生了藥物殘留和耐藥性等問題。但迄今，尚沒有一種單一的措施能夠?qū)游锲鸬酵耆谋Ｗo作用。目前的趨勢是向日糧中添加一些益生素來促進動物消化道有益微生物區(qū)系的形成。

酵母培養(yǎng)物因綠色、無耐藥性、營養(yǎng)豐富、能提高動物生產(chǎn)性能等優(yōu)點已經(jīng)越來越受到國內(nèi)外飼養(yǎng)業(yè)的重視，許多國外產(chǎn)品已進入我國，但價格十分昂貴，市場價格高于10 000元人民幣/t。我國是飼料養(yǎng)殖大國，按照我國目前養(yǎng)殖規(guī)模，酵母培養(yǎng)物的需求量在百萬噸以上，但由于價格因素，目前使用量不足萬噸[5]。而我國白酒年產(chǎn)量約600萬噸，白酒生產(chǎn)的副產(chǎn)物——白酒糟（濕）超過1 000萬噸。利用白酒糟生產(chǎn)酵母培養(yǎng)物，既可以充分利用這一廢物，減少它對環(huán)境的污染，又可提高白酒糟的營養(yǎng)價值，使其成為新型飼料添加劑，創(chuàng)造出更大的經(jīng)濟價值[6]。

因此，本課題以廉價的白酒糟為主要基質(zhì)，接種釀酒酵母，進行酵母高密度固體發(fā)酵后，在此固體基質(zhì)上進行酵母自溶處理，摸索酵母在白酒糟固體培養(yǎng)基中增殖后的最佳自溶條件。最終確定實驗室以白酒糟為基質(zhì)生產(chǎn)酵母培養(yǎng)物的工藝條件，以期成功實現(xiàn)白酒糟的生物轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白酒糟由湖北十堰白泉酒業(yè)有限公司提供；36%～37%分析純甲醛溶液由湖北奧生新材料科技有限公司生產(chǎn)；12 U/mg木瓜蛋白酶由Biosharp公司生產(chǎn)；釀酒酵母（白酒型活性干酵母）：由湖北宜昌安琪酵母股份有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 初始自溶條件的設(shè)定

調(diào)整經(jīng)過酵母高密度固體發(fā)酵后的固體酒糟基質(zhì)初始pH值為6，向其中添加助溶劑：9%(w/w濕糟)的NaCl溶液（以下用A表示），0.03%(w/w濕糟)木瓜蛋白酶溶液（以下用B表示）以及9%(v/w濕糟)體積分數(shù)為95%的助溶劑無水乙醇（以下用C表示），控制助溶劑添加總體積與酒糟干基總質(zhì)量的體積質(zhì)量比為1∶1，攪拌分散，保持55℃自溶48 h。

1.2.2 助溶劑的選擇

取8組以相同條件經(jīng)酵母高密度發(fā)酵所得的白酒糟，添加助溶劑：一組只添加A，一組只添加B，一組只添加C，一組添加A+B的組合，一組添加B+C的組合，一組添加A+C的組合，一組混合添加上述三種助溶劑，另設(shè)對照組(CK)不添加任何助溶劑，按照初始條件進行自溶處理，以氨態(tài)氮含量為指標確定最適助溶劑。

1.2.3 自溶時間的選擇

按照初始條件進行自溶處理，每隔6 h取出測定氨態(tài)氮的含量，持續(xù)至60 h結(jié)束，確定最適自溶時間。

1.2.4 自溶初始pH值的選擇

以CaO粉末和稀硫酸調(diào)整每組酒糟基質(zhì)pH值分別為5、6(自然)、7、8，按照初始條件進行自溶處理，測定氨態(tài)氮含量，確定最適自溶初始pH值。

1.2.5 自溶溫度的選擇

設(shè)定各組自溶溫度分別為40、45、50、55、60 ℃，并設(shè)對照組為常溫，按照初始條件進行自溶處理，測定各組氨態(tài)氮含量，確定最適自溶溫度。

1.2.6 自溶加水比的選擇

控制助溶劑添加總體積與酒糟干基總質(zhì)量的體積質(zhì)量比0.5∶1、0.75∶1、1∶1、1.5∶1，并設(shè)對照不加水，按照初始條件進行自溶處理，測定各組氨態(tài)氮含量，確定最適自溶加水比。

1.2.7 無水乙醇加量的選擇

向各組經(jīng)過相同條件酵母高密度固體發(fā)酵后的酒糟基質(zhì)中添加助溶劑：9%(w/w濕糟)的NaCl溶液，0.03%(w/w濕糟)木瓜蛋白酶溶液，1.5%、3%、6%、9%、12%(v/w濕糟)體積分數(shù)為95%的無水乙醇，并設(shè)對照不添加無水乙醇，按照初始條件進行自溶處理，測定各組氨態(tài)氮含量，確定最適無水乙醇添加量。

1.2.8 加鹽量的選擇

向各組經(jīng)過相同條件酵母高密度固體發(fā)酵后的酒糟基質(zhì)中添加助溶劑：3%、6%、9%、12%(w/w濕糟)的NaCl溶液，并設(shè)對照不添加NaCl溶液，以及0.03%(w/w濕糟)木瓜蛋白酶溶液，9%(v/w濕糟)體積分數(shù)為95%的無水乙醇，按照初始條件進行自溶處理，測定各組氨態(tài)氮含量，確定最適加鹽量。

1.2.9 加酶量的選擇

向各組經(jīng)過相同條件酵母高密度固體發(fā)酵后的酒糟基質(zhì)中添加助溶劑：9%(w/w濕糟)的NaCl溶液，9%(v/w濕糟)體積分數(shù)為95%的無水乙醇，0.01%、0.02%、0.03%、0.04%(w/w濕糟)的木瓜蛋白酶溶液，酶液添加前先在39～40℃的溫水中活化，以增加其活力[7]。并設(shè)對照不添加木瓜蛋白酶溶液，按初始條件進行自溶，測定各組氨態(tài)氮含量，確定最適加酶量。

1.2.10 正交試驗設(shè)計

研究不同的pH值、溫度、加水比、乙醇加量、加鹽量、加酶量6個因素對酵母自溶的影響，設(shè)計6因素3水平的正交試驗。自溶后測定各組氨態(tài)氮含量，得到最佳自溶條件。數(shù)據(jù)處理與分析采用正交設(shè)計助手Ⅱv3.1統(tǒng)計軟件進行直觀分析。

1.2.11 指標測定方法

試驗中氨態(tài)氮含量的測定采用甲醛滴定法[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 助溶劑的選擇

酵母自溶添加自溶促進劑（助溶劑）能提高細胞滲透性，加速自溶過程[9]，提高氨態(tài)氮的含量，同時可以防止細胞腐敗，改善飼料風味[10]，如添加食鹽[11]、醋酸乙酯[12]、蛋白酶[13]、硫胺素[14]、無水乙醇[15]等。在選擇合適助溶劑并給予合適自溶條件下，酵母細胞內(nèi)源酶活力增加，分解細胞質(zhì)且使細胞膜逐漸失去選擇性，可溶性化合物即可滲透析出，隨著細胞膜滲透性的增加，細胞外也出現(xiàn)了蛋白質(zhì)分解，自溶產(chǎn)物最終大部分以氨基酸態(tài)氮的形式存在。

本試驗在設(shè)定的初始條件下采用不同助溶劑，以自溶后氨態(tài)氮含量為指標確定最佳助溶劑，試驗結(jié)果如圖1所示。其中，A代表NaCl溶液，B代表木瓜蛋白酶溶液，C代表無水乙醇。

圖1 不同助溶劑對氨態(tài)氮含量的影響

由圖1可知，采用三種助溶劑混合的方法氨態(tài)氮產(chǎn)量最高，因此我們選定助溶劑為NaCl溶液、木瓜蛋白酶溶液和無水乙醇這三種溶液的混合液。

2.2 自溶時間的選擇

酵母的自溶過程很緩慢，為了確定酵母自溶的最佳時間，我們以樣品氨態(tài)氮含量為指標，將自溶時間延至60 h，每隔6 h測定氨態(tài)氮含量，試驗結(jié)果如圖2所示。

從圖2可知，隨著自溶時間的延長，氨態(tài)氮含量不斷提高，經(jīng)過一定時間后，氨態(tài)氮的增加明顯變慢。自溶36 h之前，隨時間的延長，氨態(tài)氨含量不斷提高。自溶36 h以后，氨態(tài)氨含量增加不再明顯，考慮到工業(yè)生產(chǎn)中，自溶時間過長占用時間，影響設(shè)備利用率[16]，且自溶時間過久，自溶產(chǎn)物略帶氨味，影響風味，因此將自溶時間確定為36 h[10]。

圖2 不同自溶時間對氨態(tài)氮含量的影響

2.3 自溶初始pH值的選擇

酶促降解蛋白質(zhì)是酵母自溶的關(guān)鍵[17]，pH值影響著酵母細胞內(nèi)酶的活性，從而影響產(chǎn)品的風味品質(zhì)和蛋白質(zhì)的降解程度。據(jù)報道，酵母胞內(nèi)蛋白酶作用的最適pH值多為微酸偏中性[18]，在自溶過程中胞內(nèi)磷脂酶、核酸酶、蛋白酶的激活使碳水化合物、核酸、蛋白質(zhì)釋放，自溶后pH值顯著下降，因此初始pH值不宜過低[7]。但也不宜過高，pH值大于8，自溶液容易變質(zhì)發(fā)臭[19]。因此本試驗選取pH值5、6（自然pH值）、7、8作為試驗范圍。試驗結(jié)果如圖3所示。從圖3中看出，pH值為7時自溶樣品氨態(tài)氮含量最高，正交試驗選擇pH值為6、7、8。

圖3 不同自溶初始pH值對氨態(tài)氮含量的影響

2.4 自溶溫度的選擇

有研究者從酵母細胞中分離到4種蛋白酶，一種外切肽酶，最適作用溫度30～35℃；三種內(nèi)切肽酶，其中一種內(nèi)切肽酶的最適作用溫度為60℃左右，另外兩種的最適作用溫度均為50℃左右。因此，酵母自溶溫度多為55℃左右[17]。適宜的自溶溫度可以提高這些酶的活性。本研究以自溶后氨態(tài)氮含量為指標選取40、45、50、55、60 ℃以及常溫做單因素試驗[20]，試驗結(jié)果如圖4所示。

從圖4看出，50℃條件下自溶效果最好，自溶后氨態(tài)氮含量達到2.97 mg/g干糟，正交試驗選擇溫度為45、50、55 ℃。

圖4 不同自溶溫度對氨態(tài)氮含量的影響

2.5 自溶加水比的選擇

加水比需適中，超過一定的加水比，氨基酸態(tài)氮溢出量處于平衡，且增加干燥能耗。據(jù)有關(guān)文獻報道，試驗選取1∶1、1.5∶1、0.5∶1等5種加水比[10]。試驗結(jié)果如圖5所示。

從圖5中看出，當加水比為1∶1時，自溶后氨態(tài)氮含量最大，達到3.02 mg/g干糟。從經(jīng)濟、節(jié)能的角度考慮，正交試驗選擇0.75∶1、1∶1、1.25∶1 3個加水比。

圖5 不同自溶加水比對氨態(tài)氮含量的影響

2.6 助溶劑無水乙醇加量的選擇

乙醇是酵母自溶促進劑[21]，它可以溶解脂肪，促進細胞膜滲透性的提高[22]，并抑制細菌的腐敗。在后續(xù)處理中可通過加熱濃縮將乙醇去除[15]。乙醇用量低于1.5%時，自溶樣品易變質(zhì)腐敗，考慮到工業(yè)生產(chǎn)，本試驗選取乙醇添加量為1.5%～12%。試驗結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同無水乙醇添加量對氨態(tài)氮含量的影響

從圖6可以看出，隨著乙醇用量的增加，自溶樣品氨態(tài)氮含量也在增加，超過9%時氨態(tài)氮的含量略有下降[15]。正交試驗選擇6%、9%、12%（v/w濕糟）三個乙醇用量。

2.7 加鹽量的選擇

食鹽具防腐、調(diào)味、除臭等作用，可減輕苦味，去除酵母味，是較理想的質(zhì)壁分離劑[7]。但食鹽用量在12%以上，成本較高，且干燥后產(chǎn)品中食鹽含量高，將直接影響產(chǎn)品的口感和品質(zhì)[23]，因此本試驗選取3%、6%、9%、12%以及對照5種用量。試驗結(jié)果如圖7所示。

由圖7見，隨著NaCl添加量的增加，自溶后樣品中氨態(tài)氮含量也增加，NaCl添加量為9%和12%時氨態(tài)氮含量差別不大，正交試驗選擇6%、9%、12%（w/w濕糟）3個NaCl添加量。

圖7 不同加鹽量對氨態(tài)氮含量的影響

2.8 加酶量的選擇

蛋白質(zhì)的酶促降解在酵母自溶過程中起著重要作用[24]，它貫穿于整個酵母自溶過程中。但酵母細胞內(nèi)源酶活力有限，隨著自溶進行，其活力不斷降低[25]，因而使得自溶效果和時間都受到了限制，通過外加木瓜蛋白酶可有效的改善這種狀況。

試驗結(jié)果如圖8所示，添加木瓜蛋白酶濃度在0.03%和0.04%時氨態(tài)氮含量差別不大。正交試驗選擇0.02%、0.03%、0.04%（w/w濕糟）三個木瓜蛋白酶添加量。

圖8 不同加酶量對氨態(tài)氮含量的影響

2.9 酵母自溶條件正交試驗結(jié)果

對影響酵母自溶的幾個因素進行單因素試驗后，設(shè)計六因素三水平的正交試驗。通過正交試驗L18(3)6找到酵母自溶最佳條件，以自溶結(jié)束后樣品中氨態(tài)氮含量作為衡量試驗結(jié)果的指標，試驗因素水平設(shè)計見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

由表2可以看出：各個因素對自溶效果的影響順序為：pH值＞溫度＞加水比＞加酶量＞NaCl加量＞乙醇加量，最佳試驗條件為A1B3C2D2E1F3。按照優(yōu)化后的試驗條件進行3次重復(fù)驗證試驗，所測得氨態(tài)氮含量分別為3.92、3.79、3.81 mg/g干糟，平均值為3.83 mg/g干糟，相當于24%的酵母細胞自溶率。在優(yōu)化的自溶條件下，氨態(tài)氮的平均值比最好的12號試驗結(jié)果的氨態(tài)氮值有所提高。

表1 正交試驗設(shè)計

表2 正交試驗結(jié)果

3 結(jié)論

經(jīng)上述試驗得出酵母高密度發(fā)酵白酒糟后的最佳自溶條件為：以稀硫酸調(diào)整酵母細胞高密度固態(tài)發(fā)酵后的固體酒糟基質(zhì)初始pH值為6，向其中添加助溶劑：6%(w/w濕糟)的NaCl溶液，0.04%(w/w濕糟)木瓜蛋白酶溶液以及9%(v/w濕糟)體積分數(shù)為95%的助溶劑無水乙醇，控制助溶劑添加總體積與酒糟干基總質(zhì)量的體積質(zhì)量比為1∶1，攪拌分散，保持55℃自溶36 h，而后干燥粉碎。所獲得的產(chǎn)品包括酵母細胞賴以生長的固體基質(zhì)，酵母菌體以及酵母細胞外代謝產(chǎn)物。與初始自溶條件下2.78 mg/g干糟的氨態(tài)氮數(shù)值相比，優(yōu)化后的自溶條件下氨態(tài)氮值提高了37.8%。

4 討論

本課題所確定的酵母培養(yǎng)物生產(chǎn)工藝是在實驗室水平上得出的，大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)還有待進一步研究。若將其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，以下部分有待完善：

①解決白酒糟大量堆積易長霉菌的問題?？梢試L試篩選一種既能抑制白酒糟霉菌生長又不影響酵母生長的益生菌與酵母共同接種培養(yǎng)，使得原料保存期更長，使用更方便。

②進一步降低酵母培養(yǎng)物生產(chǎn)成本，簡化生產(chǎn)工藝。有研究顯示，酵母自溶物本身富含各種氨基酸、B族維生素、多種金屬離子及NaCl，這些物質(zhì)均可有效促進酵母自溶。對于酵母自溶來說，其產(chǎn)品本身就是一種復(fù)合助溶劑[26]。因此我們可以嘗試取適量以上述實驗方法自溶后的酒糟摻到未經(jīng)自溶處理的酵母酒糟基質(zhì)中并混合均勻，促進后者酵母自溶，反復(fù)利用，達到便于操作、節(jié)約成本的目的，以利工業(yè)擴大化生產(chǎn)。

③確定該產(chǎn)品最適添加量。應(yīng)當在生產(chǎn)工藝確定的基礎(chǔ)上，對產(chǎn)品的營養(yǎng)成分進行分析測定，并以不同添加量進行動物飼喂試驗，觀察并記錄使用效果，以飼喂后所要達到的目的為指標確定產(chǎn)品最適添加量。

④檢測該產(chǎn)品的有效性和安全性。酵母培養(yǎng)物成分復(fù)雜，含有“未知促生長因子”，因此不能僅以自溶后氨態(tài)氮含量作為衡量指標。要開發(fā)出實用的檢測方法和科學(xué)的檢測標準，對酵母培養(yǎng)物的安全性和有效性進行檢測，以保證產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)[27]。