宋迎輝，朱燦燦，代書桃，秦娜，王春義，張真，李君霞，平西栓

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，河南 鄭州 450002；2.洛寧縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，河南 洛寧 471700；3.河南省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，河南 鄭州 450002)

GATA轉(zhuǎn)錄因子是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，包含一個(gè)典型的Ⅳ型鋅指DNA結(jié)合域CX2CX17~20CX2C和一個(gè)后續(xù)保守區(qū)域，這類鋅指的一些成員在基因的調(diào)控區(qū)域特異性地結(jié)合DNA序列(A/T)GATA(A/G)，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄水平。從細(xì)胞黏菌到脊椎動(dòng)物的生物體中都發(fā)現(xiàn)了該基因家族成員[1]。

Reyes等[2]對(duì)擬南芥和水稻的GATA家族基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，GATA家族基因DNA基序與光依賴和硝酸鹽依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。真菌GATA因子調(diào)控氮代謝、光誘導(dǎo)、鐵載體生物合成和配對(duì)類型轉(zhuǎn)換[3]。旁系同源GATA轉(zhuǎn)錄因子GNC和CGA1/GNL受光、氮和細(xì)胞分裂素的調(diào)控，同時(shí)也受赤霉素信號(hào)的抑制[4]。在許多研究報(bào)道中對(duì)不同作物GATA轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行了全基因組的鑒定分析，分別在擬南芥(Arabidopsis thaliana)[5]、水稻(Oryza sativaL.)[6]、大豆(Glycine max)[7]、棉花(Gossypium genus)[8]、甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)[9]、谷子(Setaria italica)[10]、番茄(Solanum lycopersicon)[11]、葡萄(Vitis viniferaL.)[12]、蓖麻(Ricinus communisL.)[13]和毛竹(Phyllostachys edulis)[14]中鑒定出了29、28、64、179、96、33、30、19、19、31個(gè)成員，為其在其他作物中的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能研究提供了參考。

高粱(Sorghum bicolor)是世界第五大禾谷類作物，廣泛種植于全球干旱和半干旱地區(qū)。也是我國(guó)主要的雜糧作物之一，是傳統(tǒng)釀造業(yè)，尤其是高端白酒釀造的主要原料。高粱具有光合效率高、抗旱耐澇、耐鹽堿等諸多優(yōu)良性狀，同時(shí)也是研究甘蔗、玉米和柳枝稷等能源作物的重要模式作物[15]。2009年，高粱全基因組測(cè)序完成；2017年，高粱基因組序列得到進(jìn)一步完善[16]，許多基因家族的鑒定和功能研究迅速展開[17－21]。但目前尚未見有關(guān)高粱GATA家族全基因組鑒定的報(bào)道。本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)在全基因組水平上鑒定高粱GATA家族成員，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為探究高粱GATA家族基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 高粱GATA基因家族成員的鑒定

GATA基因家族典型鋅指結(jié)構(gòu)域種子序列(PF00320)從Pfam網(wǎng)站(http://pfam.xfam.org/)下載，并以PF00320的HMM模型為探針序列，利用HMMER 3.3軟件搜索高粱基因組功能蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)，E值小于1×10－10。當(dāng)同一基因?qū)?yīng)多個(gè)蛋白序列時(shí)，僅保留氨基酸長(zhǎng)度最長(zhǎng)的序列作為GATA基因家族成員。進(jìn)一步利用SMART(http://smart.embl.de/)在線工具驗(yàn)證GATA保守結(jié)構(gòu)域的完整性，利用DNAMAN軟件(https://www.lynnon.com)分析保守結(jié)構(gòu)蛋白序列。利用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)最終篩選出的氨基酸序列進(jìn)行在線分析，以確定蛋白的氨基酸長(zhǎng)度、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏水性平均值等理化特性。

1.2 高粱GATA家族基因的染色體分布

提取高粱GATA家族基因的已知基因組位置信息，利用Mapinspect軟件繪制染色體分布圖。

1.3 高粱GATA家族基因系統(tǒng)進(jìn)化與基因結(jié)構(gòu)分析

將所有的高粱GATA蛋白與從PlantTFDB網(wǎng)站下載的擬南芥、玉米和谷子GATA蛋白序列通過ClustalX 2.0軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，然后用MEGA 11.0軟件以鄰接法(Neighbor joining，NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap replications設(shè)置為1 000，其他參數(shù)默認(rèn)。

從數(shù)據(jù)庫(kù)中提取鑒定到的GATA基因結(jié)構(gòu)注釋信息，利用GSDS(http://gsds.gao－lab.org/)在線軟件分析高粱GATA基因的結(jié)構(gòu)。

1.4 高粱GATA蛋白保守基序(Motif)分析

利用在線保守基序分析軟件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme/)進(jìn)行Motif分析，參數(shù)中預(yù)測(cè)數(shù)目設(shè)置為8，其余均為默認(rèn)設(shè)置。

1.5 高粱GATA基因啟動(dòng)子順式調(diào)控元件分析

從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)獲取每個(gè)SbGATA基因起始密碼子上游2 kb序列，上傳至PlantCARE服務(wù)器(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)搜索預(yù)測(cè)，分別統(tǒng)計(jì)每個(gè)SbGATA基因啟動(dòng)子檢測(cè)到的順式作用元件數(shù)量，利用MeV4.9軟件繪制熱圖。

1.6 高粱GATA家族基因在不同組織中的表達(dá)模式分析

高粱不同組織中GATA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)自Phytozome(https://phytozome.Jgi.doe.gov/pz/)，用FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)值表示基因相對(duì)表達(dá)水平，利用MeV 4.9軟件繪制熱圖。

1.7 干旱處理下的基因表達(dá)分析

選擇常規(guī)種豫粱10號(hào)在溫室中用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水培，待幼苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，在處理中加入PEG6000模擬干旱處理，并分別于0、12、24、36 h取樣，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法獲得基因相對(duì)表達(dá)量，變化倍數(shù)用FC表示，用Log2FC表示基因相對(duì)表達(dá)量變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱GATA家族基因的鑒定、理化性質(zhì)及染色體定位分析

經(jīng)比對(duì)共鑒定出30個(gè)高粱GATA基因，根據(jù)其染色體位置分別命名為SbGATA1~SbGATA30。高粱GATA基因編碼的氨基酸數(shù)量差異較大，最多可以編碼547個(gè)氨基酸(SbGATA23)，最少編碼125個(gè)氨基酸(SbGATA9)，平均編碼345個(gè)氨基酸。高粱GATA基因編碼蛋白分子質(zhì)量在13 611.44~59 298.79 ku，平均為36 559.86 ku。等電點(diǎn)平均值為8.02，SbGATA4、SbGATA5、Sb-GATA11、SbGATA13、SbGATA16、SbGATA20、Sb-GATA26、SbGATA30等電點(diǎn)小于7.0，呈酸性；Sb-GATA2等電點(diǎn)約為7.0，接近中性；其余21個(gè)高粱GATA蛋白等電點(diǎn)大于7.0，呈堿性。不穩(wěn)定系數(shù)50.54~80.91，均為不穩(wěn)定蛋白(>40)；疏水性平均系數(shù)均為負(fù)數(shù)，表明高粱GATA蛋白均為親水性蛋白(表1)。

表1 高粱GATA基因家族成員基本信息

30個(gè)高粱GATA基因家族成員不均勻地分布在8條染色體上，2號(hào)和7號(hào)染色體上無(wú)SbGATA基因分布(圖1)。其中，1號(hào)染色體上的基因數(shù)量最多，有8個(gè)基因；其次是3、4、8、9號(hào)染色體，各有4個(gè)基因；5、6、10號(hào)染色體上各有2個(gè)基因。根據(jù)Holub[22]對(duì)基因簇的界定，本研究中30個(gè)SbGATA基因沒有形成基因簇分布，說(shuō)明串聯(lián)重復(fù)不是SbGATA基因家族擴(kuò)展的主要因素。

圖1 高粱GATA基因在染色體上的分布

2.2 高粱GATA蛋白系統(tǒng)進(jìn)化、保守序列分析

將鑒定到的高粱GATA基因家族成員氨基酸序列與擬南芥、玉米和谷子的GATA基因家族成員氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)(圖2)，根據(jù)已知擬南芥GATA基因家族成員進(jìn)化分類信息對(duì)高粱GATA基因家族進(jìn)行分類(圖3)，可將高粱GATA基因家族分為4組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，其中Ⅰ組包含15個(gè)家族成員，占總數(shù)的1/2，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別包含9、4、2個(gè)家族成員，同組內(nèi)GATA成員之間蛋白序列一致性較高。Ⅲ組4個(gè)成員SbGATA3、SbGATA4、SbGATA18、SbGATA30的保守鋅指結(jié)構(gòu)域?yàn)镃X2CX20CX2C，其他基因家族成員保守鋅指結(jié)構(gòu)域?yàn)镃X2CX18CX2C；Ⅳ組兩個(gè)成員SbGATA5和SbGATA20保守結(jié)構(gòu)域蛋白序列完全一致。

圖2 SbGATA蛋白家族保守序列比對(duì)分析

2.3 不同作物GATA蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)4種不同作物的126個(gè)GATA基因家族成員，包括高粱30個(gè)、擬南芥29個(gè)、玉米36個(gè)和谷子31個(gè)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，如圖3所示，可將GATA基因家族分為4個(gè)分支，分支Ⅰ含有高粱GATA家族成員15個(gè)，擬南芥GATA家族成員14個(gè)，玉米GATA家族成員20個(gè)，谷子GATA家族成員15個(gè)；分支Ⅱ中高粱、擬南芥、玉米、谷子GATA家族成員分別為9、10、10、9個(gè)；分支Ⅲ含高粱和谷子GATA家族成員各4個(gè)，擬南芥、玉米GATA家族成員各3個(gè)；分支Ⅳ中高粱、擬南芥、玉米、谷子GATA家族成員分別為2、2、3、3個(gè)。

對(duì)4種作物GATA家族成員保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，分支Ⅲ中全部GATA家族成員均為CX2CX20CX2C鋅指結(jié)構(gòu)，而其他分支GATA家族成員保守結(jié)構(gòu)域?yàn)镃X2CX18CX2C鋅指結(jié)構(gòu)。

除分支Ⅰ中SbGATA6和擬南芥GATA蛋白AT3G45170.1親緣關(guān)系較近外，其他擬南芥GATA家族成員多單獨(dú)聚為一類，表明高粱GATA家族基因與單子葉植物玉米和谷子GATA的親緣關(guān)系較近，與雙子葉植物擬南芥GATA的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 高粱GATA基因結(jié)構(gòu)分析

高粱GATA家族基因含有1~8個(gè)外顯子(圖4)，其中Ⅰ組SbGATA13和SbGATA17含有1個(gè)外顯子；SbGATA15、SbGATA19含有3個(gè)外顯子，其他11個(gè)GATA基因含有2個(gè)外顯子。Ⅱ組GATA基因含有2~3個(gè)外顯子。Ⅲ組中SbGATA18含有3個(gè)外顯子，SbGATA3、SbGATA4和SbGATA30含有7~8個(gè)外顯子。Ⅳ組中SbGATA5和SbGATA20分別含有6個(gè)和8個(gè)外顯子。說(shuō)明同組中GATA家族成員基因具有很強(qiáng)的一致性。

圖4 高粱GATA家族基因結(jié)構(gòu)分析

2.5 高粱GATA蛋白的保守基序(Motif)分析

如圖5所示，將鑒定的8個(gè)保守基序命名為Motif1~Motif8。Motif1為CX2CX18~20CX2C鋅指結(jié)構(gòu)域，所有高粱GATA蛋白均含有Motif1。同一組的高粱GATA家族成員具有相似的保守基序，除Motif1外，Ⅰ組中15個(gè)GATA家族成員均含有Motif2；Ⅱ組中9個(gè)家族成員只含有Motif1；Ⅲ組中SbGATA3、SbGATA4和SbGATA30含有Motif4和Motif7，SbGATA18含有Motif4的部分保守序列(結(jié)果未展示)；Ⅳ組中SbGATA5和SbGATA20均含有Motif5和Motif8。

圖5 高粱GATA家族蛋白保守基序分析

2.6 高粱GATA順式調(diào)控元件分析

如圖6所示，鑒定到的脅迫相關(guān)順式元件主要包括ABRE(脫落酸響應(yīng)元件)、ARE(厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件)、CAT－box(分生組織表達(dá))、CGTCAmotif(茉莉酸甲酯響應(yīng)元件)、G－box(光響應(yīng)元件)、LTR(低溫響應(yīng)元件)、MBS(干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件)、O2－site(醇溶蛋白代謝調(diào)控元件)、RY－element(種子特異調(diào)控元件)、TC－rich(防御措施響應(yīng)元件)、TCA－element(水楊酸響應(yīng)元件)、WUNmotif(機(jī)械傷害響應(yīng)元件)和circadian(晝夜節(jié)律控制元件)。

圖6 高粱GATA家族基因順式調(diào)控元件分析

多數(shù)高粱GATA家族成員都含有ABRE、ARE、CGTCA－motif和G－box元件。SbGATA2和SbGATA26中G－box和ABRE檢測(cè)量高于其他家族成員，SbGATA5中未檢測(cè)到ABRE和G－box，SbGATA6中未檢測(cè)到ABRE，其他GATA家族成員中均至少有一個(gè)ABRE和G－box。SbGATA11檢測(cè)到RY－element元件7個(gè)，SbGATA22中CATbox和SbGATA15中LTR分別檢測(cè)到5個(gè)，明顯高于其他家族成員。

30個(gè)SbGATA家族成員中共檢測(cè)到492個(gè)主要順式調(diào)控元件，其中，光響應(yīng)元件G－box數(shù)量最多，共檢測(cè)到116個(gè)；其次為ABRE，檢測(cè)到105個(gè)；CGTCA－motif和ARE分別檢測(cè)到70個(gè)和48個(gè)；CAT－box、LTR、MBS、O2－site、RY－element、TC－rich、TCA－element、WUN－motif、circadian分別檢測(cè)到24、23、24、12、21、9、16、17、10個(gè)。表明高粱GATA家族基因可以響應(yīng)低溫、干旱、光強(qiáng)和光周期等多種逆境條件。

2.7 高粱GATA家族基因的表達(dá)分析

2.7.1 不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期組織中的表達(dá) 由圖7可知，Ⅰ組SbGATA19在各組織中無(wú)表達(dá)；SbGATA15在花分化期至成熟期下部葉片和葉鞘中表達(dá)量較高；SbGATA16除在幼苗期葉片、花分化期花序梗和成熟期干籽粒中表達(dá)量較低外，在其他組織中表達(dá)量均較高。Ⅱ組中SbGATA29在幼苗期和花分化期葉片中表達(dá)量較高；SbGATA9和Sb-GATA25除在圓錐花序、花序梗和干籽粒中表達(dá)量較低外，在其他組織中表達(dá)量均較高；SbGATA1和SbGATA12花分化期圓錐花序和花序梗中表達(dá)量較高。Ⅲ組中SbGATA30在成熟期干籽粒中表達(dá)量較高。Ⅳ組中SbGATA5和SbGATA20兩個(gè)基因除在成熟期干籽粒中幾乎無(wú)表達(dá)外，在其他組織中均有不同程度表達(dá)，SbGATA20在不同組織中表達(dá)量均較高?？傮w上，Ⅲ組和Ⅳ組中SbGATA基因家族成員表達(dá)量較高。表達(dá)分析表明SbGATA基因家族在高粱生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。

圖7 高粱GATA家族基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期組織中的表達(dá)分析

2.7.2 干旱脅迫下的表達(dá) 轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)高粱幼苗模擬干旱處理36 h時(shí)，與對(duì)照相比，SbGATA11和SbGATA26上調(diào)表達(dá)，其他時(shí)間段其他GATA家族基因表達(dá)無(wú)差異，說(shuō)明SbGATA11和SbGATA26基因可能在高粱響應(yīng)干旱脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用(圖8)。

圖8 高粱GATA家族基因在干旱處理下的表達(dá)分析

3 討論與結(jié)論

本研究從高粱基因組中鑒定出30個(gè)GATA成員，其中，26個(gè)蛋白序列包含CX2CX18CX2C鋅指結(jié)構(gòu)域，與擬南芥[23]和水稻[24]等作物的研究結(jié)果一致，而SbGATA3、SbGATA4、SbGATA18和Sb-GATA30的保守鋅指結(jié)構(gòu)域?yàn)镃X2CX20CX2C。這些基因不均勻地分布在8條染色體上，1號(hào)染色體上基因數(shù)最多(8個(gè))，2號(hào)、7號(hào)染色體上未鑒定到SbGATA基因。

SbGATA蛋白均為不穩(wěn)定的親水蛋白，有21個(gè)呈堿性，8個(gè)呈酸性；編碼125~157個(gè)氨基酸，

分子質(zhì)量13 611.44~59 298.79 ku。這些差異可能使其具有不同的生物功能。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，高粱GATA家族成員可分為4組，與單子葉植物玉米和谷子的GATA親緣關(guān)系較近，與雙子葉植物擬南芥的GATA親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；同一組的SbGATA基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序一致性高，而不同組的SbGATA基因外顯子數(shù)量差異較大，UTR結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度差異明顯。

SbGATA蛋白含有多種順式作用元件，可以調(diào)控對(duì)低溫、干旱、厭氧、光強(qiáng)和光周期等非生物脅迫的響應(yīng)，并參與調(diào)控脫落酸、茉莉酸甲酯、水楊酸等激素信號(hào)傳導(dǎo)。部分基因在分生組織表達(dá)、醇溶蛋白代謝調(diào)控、防御措施響應(yīng)、機(jī)械傷害響應(yīng)及種子特異調(diào)控元件有響應(yīng)位點(diǎn)，但不能說(shuō)明都可以有效結(jié)合并影響表達(dá)，而且調(diào)控方向未明。

表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，SbGATA15在花分化期至成熟期下部葉片和葉鞘中表達(dá)量較高；SbGATA29在幼苗期和花分化期葉片中表達(dá)量較高；SbGATA1和SbGATA12在花分化期圓錐花序和花序梗中表達(dá)量較高；SbGATA30在成熟期干籽粒中表達(dá)量較高；SbGATA16、SbGATA9、SbGATA25和SbGATA20在多數(shù)組織中表達(dá)量均較高。Zhang等[25]在水稻中發(fā)現(xiàn)一個(gè)GATA轉(zhuǎn)錄因子，可以增加水稻耐冷性，在所有組織中均有表達(dá)，在圓錐花序中表達(dá)量最高。本研究也發(fā)現(xiàn)多個(gè)SbGATA基因有低溫響應(yīng)位點(diǎn)，SbGATA16和Ⅲ組、Ⅳ組的6個(gè)基因在圓錐花序中表達(dá)量較高。馬鈴薯GATA基因的組織定位研究也發(fā)現(xiàn)，StGATA9基因主要表達(dá)于葉維管束的韌皮部和莖維管束系統(tǒng)[26]，StGATA12基因在馬鈴薯根、莖、花和葉中均有表達(dá)，在花中的表達(dá)量最高[27]。盧成達(dá)等[10]研究發(fā)現(xiàn)，谷子GATA家族成員可以響應(yīng)干旱脅迫、缺氧脅迫、光強(qiáng)及光周期等多種逆境條件，參與生長(zhǎng)素、赤霉素、水楊酸等激素信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控。玉米GATA家族成員在熱脅迫處理后，表達(dá)上調(diào)的基因有9個(gè)，可能在應(yīng)答熱脅迫過程中發(fā)揮重要作用[28]。以上研究說(shuō)明GATA轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物的抗逆性調(diào)控具有重要作用，進(jìn)一步研究高粱GATA基因功能，對(duì)充分了解高粱抗逆性及抗逆育種都具有重要意義。