殷鴻飛，雷強(qiáng)，李斌，李春光，謝云波，黃濤，趙瑜，景延秋，孫覓

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.中國煙草總公司四川省公司，四川 成都 610041；3.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南 鄭州 450016)

煙葉香味是評定煙葉質(zhì)量和風(fēng)格的重要指標(biāo)[1]。煙葉在調(diào)制過程中完成了香味前體物質(zhì)的降解以及香味的形成和轉(zhuǎn)化[2，3]。其中，苯丙氨酸作為煙葉香味成分的重要前體物質(zhì)，可以通過自身反應(yīng)分解產(chǎn)生如苯甲醛、苯甲醇等香味物質(zhì)[4]，其代謝轉(zhuǎn)化是影響煙葉香味的重要過程之一[5]。苯丙氨酸的降解產(chǎn)物一般認(rèn)為有4種，即苯甲醇、苯乙醇、苯甲醛和苯乙醛。苯甲醛具有杏仁香和櫻桃香，苯甲醇具有弱花香，苯乙醛具有玫瑰花香、皂香和焦香等，苯乙醇帶有辛香和堅(jiān)果香[6]，這些降解產(chǎn)物對烤煙香氣風(fēng)格的形成有直接影響[7]。因此，研究烤煙烘烤過程中的苯丙氨酸變化、降解產(chǎn)物變化規(guī)律、煙葉香味風(fēng)格的形成與轉(zhuǎn)化具有重要意義。

宋朝鵬等[8]研究不同部位煙葉游離氨基酸含量的變化后指出，烘烤過程中煙葉蛋白質(zhì)水解為包括苯丙氨酸在內(nèi)的多種游離氨基酸，同時(shí)游離氨基酸也參與其它物質(zhì)的合成，不同類型的游離氨基酸呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。王愛華等[9]研究變黃期不同升溫方式對氨基酸組分變化影響的結(jié)果表明，變黃期階梯式升溫工藝有利于煙葉蛋白質(zhì)降解，促進(jìn)苯丙氨酸的積累，該工藝下苯丙氨酸變化呈現(xiàn)“降－升－降”的趨勢。過偉民等[10]分析了6個(gè)產(chǎn)區(qū)335份不同質(zhì)量煙葉樣品，結(jié)合煙葉品質(zhì)關(guān)聯(lián)和烘烤過程中的變化分析認(rèn)為，苯丙氨酸與煙葉感官品質(zhì)呈穩(wěn)定負(fù)相關(guān)。陳頤等[11]研究表明，不同成熟度煙葉苯丙氨酸含量差異主要集中在變黃后期和定色前期，其含量變化均表現(xiàn)為先下降后上升。高婭北等[12]研究指出，烤煙烘烤過程中苯丙氨酸的降解與苯丙氨酸解氨酶(PAL)有關(guān)，其在PAL作用下降解成多種芳香族化合物，進(jìn)而產(chǎn)生苯甲醇等小分子物質(zhì)?？梢钥闯?，國內(nèi)已有研究主要集中在烘烤過程中苯丙氨酸含量轉(zhuǎn)化方面，尚未見烘烤過程中煙葉苯丙氨酸及其降解產(chǎn)物變化規(guī)律的報(bào)道。因此，本研究以中煙100為試材，對烘烤過程中主要香氣前體物質(zhì)苯丙氨酸及其降解產(chǎn)生的香味物質(zhì)含量之變化規(guī)律進(jìn)行分析，旨在明確其在烘烤過程中的動(dòng)態(tài)變化、煙葉烤香機(jī)理，進(jìn)而為提升苯丙氨酸類香味物質(zhì)含量及改善烤煙香味提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020年在河南省禹州市馬墳村烘烤工廠進(jìn)行，烤煙品種為中煙100。4月30日移栽，株行距為50 cm×120 cm。田間管理按照優(yōu)質(zhì)烤煙栽培生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行。試驗(yàn)分別以下部葉(第7~8位葉)、中部葉(第11~12位葉)、上部葉(第19~20位葉)為材料，依據(jù)烤煙成熟標(biāo)準(zhǔn)按照葉位單葉采收。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用KH－1整體供熱設(shè)備大型密集烤房進(jìn)行烘烤，由專業(yè)烘烤師傅嚴(yán)格按照三段式烘烤工藝進(jìn)行。分別于烘烤前、烘烤中、烘烤后取樣6次，即:烤前鮮樣；38℃末(變黃前期)；42℃末(變黃末期)；48℃末(定色前期)；54℃末(定色末期)；烤后樣。每次隨機(jī)取樣16片，去除葉尖和葉基部分，取其中3片剪碎混勻并用錫紙包裹放入液氮瓶中保存，用于PAL活性測定，剩余部分在烘箱中殺青烘干，粉碎后過60目篩，用于苯丙氨酸及其降解產(chǎn)物測定，重復(fù)3次。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

苯丙氨酸含量測定參照文獻(xiàn)[13]的方法，利用S－433D型氨基酸測定儀(德國SYKAM公司)平行測定3次。PAL活性采用紫外分光光度計(jì)法[14]測定。苯丙氨酸代謝產(chǎn)物包括苯甲醛、苯甲醇、苯乙醛和苯乙醇，采用文獻(xiàn)[15]的方法，利用6890N型氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司)對樣品進(jìn)行定性定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理及作圖采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行，用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 烘烤過程中煙葉苯丙氨酸含量變化

由圖1可知，烘烤過程中不同部位煙葉苯丙氨酸含量整體呈現(xiàn)先降后升的變化規(guī)律。其中，中部葉苯丙氨酸含量烘烤過程中始終高于上部葉和下部葉，48℃末時(shí)達(dá)到最大值，為0.58 mg/g，至54℃之前呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，上部葉和下部葉總體趨勢與其一致。各部位煙葉苯丙氨酸含量變化主要集中在48℃末之前，變黃前期不同程度下降，之后呈現(xiàn)升高趨勢。不同部位烤后煙葉苯丙氨酸含量相對于鮮煙葉皆略有提升。

圖1 烘烤過程中苯丙氨酸含量變化

2.2 烘烤過程中煙葉苯丙氨酸解氨酶活性變化

PAL是苯丙氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶[16]，苯丙氨酸在其催化下轉(zhuǎn)化為肉桂酸，進(jìn)而產(chǎn)生香豆素、木質(zhì)素及黃酮等次生物質(zhì)。如圖2所示，中部葉PAL活性在變黃前期(38℃末之前)緩慢上升，38℃后迅速升高，42℃末時(shí)達(dá)到峰值，為10.11 OD290/(gFW?min)，48℃末之后急劇下降直至失去活性。下部葉PAL活性變化趨勢與中部葉一致，大致呈先升高后降低趨勢，最高活性低于中部葉，為7.21 OD290/(gFW?min)，42~48℃之間活性變化不明顯，48℃末之后急劇下降。上部葉PAL活性42℃時(shí)達(dá)到峰值，為7.79 OD290/(gFW?min)，之后開始急劇下降，其活性變化的降速和降幅均大于中部、下部葉。

圖2 烘烤過程中PAL活性變化

2.3 烘烤過程中煙葉苯丙氨酸類降解產(chǎn)物的變化規(guī)律

2.3.1 烘烤過程中苯甲醇含量的變化 如圖3所示，各部位煙葉隨著烘烤進(jìn)程，其苯甲醇含量總體呈升高趨勢，烤后明顯高于烤前。烘烤前中期下部葉苯甲醇含量高于中部葉，48℃末至烘烤結(jié)束則相反。上部葉烤后苯甲醇含量略低于下部葉，為9.55μg/g，中部葉提高到13.58μg/g，下部葉為10.07μg/g。

圖3 各部位煙葉烘烤過程中苯甲醇含量變化

2.3.2 烘烤過程中苯甲醛含量的變化 由圖4可知，中部葉和上部葉苯甲醛含量在變黃前期(38℃末之前)呈升高趨勢，38℃末至42℃末迅速下降，進(jìn)入定色期后上部葉整體上緩慢下降，中部葉定色前期緩慢下降、定色后期(48℃末之后)迅速上升，最終其烤后苯甲醛含量顯著高于上部葉和下部；烘烤前期，下部葉苯甲醛含量呈下降趨勢，定色前期緩慢升高而后期又下降。

圖4 各部位煙葉烘烤過程中苯甲醛含量變化

2.3.3 烘烤過程中苯乙醇含量的變化 由圖5可知，變黃期苯乙醇含量表現(xiàn)為上部葉>中部葉>下部葉，且中部葉與下部葉變化趨勢一致；定色前期末和烘烤結(jié)束，中部葉稍高于上部、下部葉。整體上，各部位煙葉苯乙醇含量呈現(xiàn)上升趨勢，54℃末時(shí)變化趨于穩(wěn)定。

圖5 各部位煙葉烘烤過程中苯乙醇含量變化

2.3.4 烘烤過程中苯乙醛含量的變化 由圖6可知，變黃期開始至烘烤結(jié)束，苯乙醛含量表現(xiàn)為上部葉>中部葉>下部葉，且其變幅3個(gè)部位煙葉有一定差距?？傮w上，中部葉和上部葉苯乙醛含量隨著烘烤進(jìn)程均呈現(xiàn)升高后下降趨勢，上部葉以42℃末最高，為6.38μg/g，中部葉38℃末時(shí)最高，為4.97μg/g；下部葉變黃前期下降，變色后期稍有升高，進(jìn)入定色期又迅速下降。

圖6 各部位煙葉烘烤過程中苯乙醛含量變化

2.4 烘烤過程中煙葉苯丙氨酸與其降解產(chǎn)物及PAL活性的相關(guān)分析

由表1可知，煙葉烘烤過程中烤房內(nèi)溫度與PAL活性呈極顯著負(fù)相關(guān)，與苯甲醇、苯乙醇含量呈極顯著正相關(guān)。苯丙氨酸含量與苯乙醇含量呈極顯著正相關(guān)；PAL活性與苯甲醇呈顯著負(fù)相關(guān)，與苯乙醛含量呈極顯著正相關(guān)；苯甲醇含量與苯甲醛、苯乙醛含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與苯乙醇含量呈極顯著正相關(guān)；苯甲醛含量與苯乙醛含量呈極顯著正相關(guān)。

表1 煙葉烘烤過程中苯丙氨酸與其降解產(chǎn)物及PAL活性的相關(guān)系數(shù)

苯丙氨酸含量除了與苯乙醇含量極顯著相關(guān)外，與其它3種降解產(chǎn)物含量的相關(guān)性皆不顯著，這可能是由于煙葉烘烤過程中苯丙氨酸參與了多種生化反應(yīng)，影響其含量變化的因素較多所致[11]。

3 討論

游離氨基酸在烘烤過程中的代謝變化相當(dāng)復(fù)雜[17]，而苯丙氨酸作為芳香族游離氨基酸，目前認(rèn)為主要有三種代謝途徑:一種是脫氨基作用，即苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)的催化作用下轉(zhuǎn)化成反式肉桂酸，進(jìn)而在代謝中生成香豆素、木質(zhì)素、生物堿及黃酮等次生物質(zhì)[18]；第二種是脫羧基作用，即苯丙氨酸在氨基酸脫羧酶和過氧化物酶的作用下生成苯基乙胺、2－苯乙基酰胺等中間產(chǎn)物[19]；第三種是苯丙氨酸與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)[8，20]。從本研究結(jié)果可得，在烘烤過程中，各部位煙葉的苯丙氨酸含量變化整體呈現(xiàn)先降低后升高趨勢，這一結(jié)果與謝良文等[21]的研究相一致。正是由于上述三種代謝途徑的進(jìn)行，苯丙氨酸在變黃前期(38℃末之前)不斷降解，其含量呈現(xiàn)下降趨勢；從38℃末起，各部位煙葉的苯丙氨酸含量又呈升高趨勢，直至48℃末達(dá)到最大值后穩(wěn)定，這一變化可能與烘烤過程中蛋白質(zhì)降解速率的提高有關(guān)。賀帆等[22]通過研究不同溫濕度對烤煙蛋白質(zhì)含量及其相關(guān)酶活性的變化發(fā)現(xiàn)，變黃末期煙葉蛋白質(zhì)的降解速率較快，而游離氨基酸隨著蛋白質(zhì)降解而持續(xù)升高。陳頤等[23]研究表明，烘烤過程中煙葉游離氨基酸含量在變黃期轉(zhuǎn)入定色期這段時(shí)間內(nèi)達(dá)到最大值，超過此段時(shí)間蛋白質(zhì)水解酶開始變性失活，蛋白質(zhì)的降解速率逐漸變慢直至終止。由此可見，煙葉烘烤過程中苯丙氨酸動(dòng)態(tài)變化受到自身代謝降解速率和蛋白質(zhì)降解速率所影響，最終形成了“下降－上升－下降”的變化趨勢。此外，本研究結(jié)果顯示，烘烤過程中中部葉苯丙氨酸含量始終高于下部葉與上部葉，這一現(xiàn)象可能與各部位煙葉的不同素質(zhì)有關(guān)[24]。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是連接初級代謝和苯丙氨酸類代謝的關(guān)鍵橋梁，是苯丙氨酸代謝第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶和限速酶，在色素形成、黃酮類化合物及多酚類化合物合成過程中都有非常重要的作用[25]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，中部葉PAL活性在變黃前期緩慢上升，變黃后期(38℃末至42℃)后迅速上升，42℃末達(dá)到最大活性，之后開始緩慢下降，至定色后期(48℃末之后)始急劇下降；下部葉PAL活性變化與中部葉一致，呈先升高后降低趨勢，最大活性低于中部葉，在定色前期(42℃至48℃)活性變化不明顯，溫度升到48℃末之后急劇下降；上部葉PAL活性變化在定色期(42℃末之后)開始急劇下降，其活性變化的降速和降幅均大于中下部葉。PAL活性與烘烤過程中的溫度與煙葉含水率有著密切關(guān)系[26]，由于上部煙葉身份較厚、含水率較高，同時(shí)在其葉烘烤過程中會(huì)根據(jù)實(shí)際情況拉長變黃期與干筋期時(shí)間，因此出現(xiàn)上部葉PAL活性在變黃期與定色末期變化幅度較大的現(xiàn)象。

煙葉中苯丙氨酸降解后主要生成苯甲醇、苯乙醇、苯甲醛、苯乙醛等易揮發(fā)的小分子化合物[27]，這些物質(zhì)對烤煙的果香、清香等香吃味貢獻(xiàn)較大[28]。苯丙氨酸降解產(chǎn)物含量最多的是苯甲醇，且各部位煙葉在烘烤過程中均呈現(xiàn)一直上升趨勢；各部位煙葉苯乙醇含量變化趨勢一致，先上升后降低，在54℃左右達(dá)到最大值；含量較少的苯甲醛，中上部煙葉于變黃前期急劇升高，38℃末達(dá)到最大值后又迅速降低；各部位煙葉苯乙醛含量的變化趨勢不一致，說明苯乙醛在不同部位煙葉烘烤過程中可能參與較多的其它生理生化反應(yīng)。從四種苯丙氨酸降解產(chǎn)物的變化趨勢結(jié)果來看，苯丙氨酸降解生成苯甲醇、苯乙醇等產(chǎn)物并不是一個(gè)單一的過程，而是相對復(fù)雜的生理生化反應(yīng)。黃小貞等[29]研究發(fā)現(xiàn)，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)作用下可轉(zhuǎn)化為肉桂酸，之后在肉桂酸4－羥化酶(C4H)作用下形成咖啡酸、香豆酸等有機(jī)酸以及苯甲醇、苯甲醛、苯乙醛等香味物質(zhì)，除此之外該代謝通路中還包含木質(zhì)素、黃酮等次生代謝產(chǎn)物。木質(zhì)素在煙葉加工過程中也可以降解為一系列小分子香味成分，是苯甲醇和苯乙醇的重要來源之一[30]。此外，柳習(xí)月等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在苯丙氨酸代謝通路中，苯乙醇和苯乙醛還有另一種生成途徑，即苯丙氨酸在氨基酸脫羧酶作用下生成苯基乙胺，之后再在伯胺氧化酶作用下生成苯乙醇和苯乙醛。煙葉調(diào)制過程中，伴隨著苯丙氨酸的降解和這些復(fù)雜生理生化反應(yīng)的發(fā)生，苯甲醇、苯甲醛等降解產(chǎn)物含量或增加或保持穩(wěn)定甚至?xí)蠓冉档汀?/p>

4 結(jié)論

煙葉烘烤過程中苯丙氨酸的降解是一個(gè)復(fù)雜的生理生化反應(yīng)過程，這個(gè)過程中的酶促反應(yīng)和生化反應(yīng)緊密相連。伴隨苯丙氨酸的降解，其大分子降解產(chǎn)物在一系列酶的作用下不斷分解和轉(zhuǎn)化，生成的小分子香味物質(zhì)不斷累積。在烘烤過程中，各部位煙葉苯丙氨酸含量均呈現(xiàn)先降后升的變化規(guī)律，在48℃末達(dá)到最大值。通過PAL活性變化規(guī)律分析可知，42~48℃是煙葉苯丙氨酸降解的重要時(shí)期。各部位煙葉苯甲醇和苯乙醇含量在烘烤過程中不斷上升；下部葉苯甲醛含量變化相對平穩(wěn)，中上部葉含量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，在38℃末達(dá)到最大值；各部位煙葉苯乙醛含量在烘烤過程中變化趨勢各不相同，但變幅較小。