魏 鳴 祁雄輝 董芳維 何 偉 高榮敏 李清源 陳寶林 張冬林 許 林

(1．武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 武漢 430065；2．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院 武漢 430070； 3.美國喬治亞大學(xué)園藝系 雅典 30602)

茶花是山茶科山茶屬多種植物及園藝品種的通稱。它既是中國十大著名的花卉之一，也是盆栽及其它園林綠化的一個重要花卉品類。作為中國傳統(tǒng)花卉的茶花，原產(chǎn)于中國東部，尤以兩江流域(長江、珠江)、云貴川等地居多，亞洲各國也有普遍種植。以中國的大陸、臺灣分布居多，在日本和歐美等地區(qū)也有分布，尤以亞洲的品種數(shù)量最多[1]。

通過對國內(nèi)外有關(guān)茶花干旱脅迫下植物性狀研究的相關(guān)文獻進行梳理，發(fā)現(xiàn)目前對茶花的研究主要集中在生理生化指標、分子水平響應(yīng)等方面，對于葉片結(jié)構(gòu)的研究并不多。近年來，茶屬植物耐旱性的相關(guān)研究引起越來越多學(xué)者的關(guān)注，對于茶花葉片表皮蠟質(zhì)等結(jié)構(gòu)在保水抗旱方面的作用及機制研究才剛剛開始，特別是將其直接用于茶花品種之間的耐旱性比較研究還沒有。本研究采用盆栽控水法進行干旱脅迫，利用掃描電子顯微鏡觀測葉片的表皮，通過對葉片氣孔和表皮蠟質(zhì)抗逆響應(yīng)的表現(xiàn)進行跟蹤分析，了解干旱脅迫下不同品種茶花的表現(xiàn)差異，為進一步探討和提高其抗旱性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以前期試驗篩選出的抗旱性較強的‘十八學(xué)士’Camelliajaponica‘shibaxueshi’和較弱的‘情人節(jié)’C.japonica‘qingrenjie’2個品種為研究對象。

1.2 試驗方法

將2個品種的試驗對象放置到光照、溫度條件一致的溫室大棚中進行干旱處理。每3盆為一組，每個品種做3組重復(fù)，共18盆。分別在進行干旱脅迫處理前、第15 天、第30 天、第40 天下午14∶00～16∶00進行樣品采集，每個品種各階段取4個樣本在掃描電鏡下觀察，每個樣本收集17個視野的照片進行氣孔數(shù)統(tǒng)計，收集不同倍數(shù)下的蠟質(zhì)形態(tài)照片，做對比討論。

1.3 樣本制備

取相同位置上成熟功能葉片，避開主脈，在中脈至葉緣1/2處取約5 mm×5 mm大小的葉片小塊，迅速投入到2.5%戊二醛固定液中，抽氣30 min，使葉片全部浸泡在固定液中，于室溫下放置2 h后，放置到4 ℃冰箱保存。每個品種每次取樣9個重復(fù)。樣品進行真空冷凍干燥、噴金后，用 JSM-6390LV 生物掃描電子顯微鏡進行觀察拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)用“平均值±標準偏差”表述，應(yīng)用 Microsoft Office Excel 2007處理所有數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片氣孔形態(tài)

本試驗僅在茶花葉片下表皮觀察到了氣孔，無規(guī)則狀排列。同一個視野中‘十八學(xué)士’的氣孔較小，排列較密集(圖1-1)?！槿斯?jié)’的氣孔較大，排列較稀疏(圖1-2)。 在500 倍電鏡下觀測，‘十八學(xué)士’的氣孔數(shù)為11±3 個/視野，‘情人節(jié)’的氣孔數(shù)為 8±3 個/視野。通過放大至3 000倍觀察發(fā)現(xiàn)，兩個品種的氣孔在試驗的各個階段其形態(tài)會發(fā)生變化且存在差異。

圖1-1 干旱脅迫對‘十八學(xué)士’葉片氣孔形態(tài)的影響

圖1-2 干旱脅迫對‘情人節(jié)’葉片氣孔形態(tài)的影響

隨著干旱時間的延長，對植株表皮氣孔閉合產(chǎn)生的影響存在差異。在干旱初期，‘十八學(xué)士’氣孔大量閉合，蠟質(zhì)堵塞氣孔為極少數(shù)，僅保留部分氣孔不關(guān)閉用于基本代謝；隨著干旱時間的延長，氣孔閉合率進一步增加，直至達到96.4%。 ‘情人節(jié)’則主要通過蠟質(zhì)堆積堵塞氣孔，來降低蒸騰速率。在干旱中后期 ，才出現(xiàn)近半數(shù)的氣孔閉合；氣孔閉合機制緩慢加強，同時蠟質(zhì)分解、轉(zhuǎn)移增加(表1)。

表1 兩個茶花品種干旱脅迫期葉片氣孔形態(tài)變化統(tǒng)計

2.2 葉片表面蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)

兩個品種的葉片上下表皮均附著有蠟質(zhì)，上表皮蠟質(zhì)覆蓋較下表皮多?！藢W(xué)士’上下表皮蠟質(zhì)含量比 ‘情人節(jié)’的均較多。通過掃描電鏡500、1 000、3 000倍對葉片上下表皮放大觀察，干旱初期，‘十八學(xué)士’葉片上表皮蠟質(zhì)積累速度明顯快于下表皮，在15 d時達到高峰(表2)。脅迫中期上表皮的蠟質(zhì)減少，下表皮增多，推測此時蠟質(zhì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。在脅迫后期，上表皮蠟質(zhì)再次正向積累達到高峰。下表皮蠟質(zhì)，從干旱初期開始一直呈增加趨勢，在30 d后開始減少(圖2-1)。‘情人節(jié)’葉片上下表皮蠟質(zhì)雖有正向積累，但速度較慢。在干旱30 d時達到峰值，之后出現(xiàn)負增長。(圖2-2)。

表2 兩個茶花品種干旱脅迫期葉片上下表面蠟質(zhì)積累變化趨勢

圖2-1 干旱脅迫對‘十八學(xué)士’葉片蠟質(zhì)形態(tài)的影響

圖2-2 干旱脅迫對 ‘情人節(jié)’葉片蠟質(zhì)形態(tài)的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

試驗通過大量電鏡照片并結(jié)合以往的干旱生理試驗結(jié)論，展示并證明了茶花在抵御干旱時的防御機制特點，即通過控制葉片下表皮的氣孔開合，并結(jié)合葉片蠟質(zhì)的合成、堆積、轉(zhuǎn)移、分解來降低蒸騰，減少灼傷保護植株。由此，在抵御干旱脅迫時，相較于生化調(diào)節(jié)因素，其蠟質(zhì)層、氣孔調(diào)節(jié)和根系深度等是植物抗旱更為直接和主要的因素。本研究通過掃描電鏡觀察氣孔形態(tài)和蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)，結(jié)合光合表現(xiàn)進一步說明了茶花有別于其他品種花卉在抗旱方面的優(yōu)勢和耐受性。綜上，茶花在感受干旱脅迫后，除了表型、生理生態(tài)以及光合特性等方面會出現(xiàn)差異外，葉片結(jié)構(gòu)的差異對于品種間的抗旱能力影響更大，其在生理生態(tài)等方面有著不可忽視的作用。

3.2 討論

通過觀察發(fā)現(xiàn)，整個試驗周期不同品種茶花的氣孔密度和形態(tài)均會隨著干旱程度的增加而發(fā)生改變，這與葉片的萎蔫程度有關(guān)[2-3]。已有諸多研究表明，干旱會促使葉片角質(zhì)層蠟質(zhì)的覆蓋度變大，從而使角質(zhì)蒸騰屏障變得更強[4-6]。本研究得出，伴隨干旱周期茶花品種間葉片表皮的蠟質(zhì)積累、形態(tài)和結(jié)構(gòu)均存在差異性。通過歸納蠟質(zhì)積累規(guī)律并結(jié)合氣孔觀察結(jié)果，脅迫中期‘十八學(xué)士’表皮氣孔大量自主關(guān)閉，因此蠟質(zhì)相對減少，可能是植株本身為了延續(xù)存活降低自身消耗。而此時‘情人節(jié)’葉片蠟質(zhì)合成速度開始變快，下表皮蠟質(zhì)明顯比上表皮集聚的多，結(jié)合氣孔閉合情況，說明該品種半數(shù)氣孔閉合依賴于蠟質(zhì)堵塞。脅迫后期，‘十八學(xué)士’葉片上表皮蠟質(zhì)比下表皮集聚量差異明顯，整體蠟質(zhì)含量與30 d比較，上表皮出現(xiàn)正增長是為了降低灼傷性，下表皮出現(xiàn)負增長是為了減少合成帶來的消耗，推測‘情人節(jié)’繼續(xù)依靠蠟質(zhì)堆積降低蒸騰率。

氣孔開合及蠟質(zhì)積累隨著干旱時間延長出現(xiàn)規(guī)律性變化[7-8]。正常環(huán)境下，茶花以上表皮蠟質(zhì)含量居多為宜。隨著旱害不斷加強，葉片表皮的氣孔大量閉合，凈光合速率、蒸騰速率快速下降[9]。葉片感受到干旱后，上、下表皮蠟質(zhì)的積累規(guī)律出現(xiàn)顯著差異。其中‘情人節(jié)’的葉片下表皮蠟質(zhì)最早出現(xiàn)堆積，氣孔也最早出現(xiàn)堵塞。整個脅迫周期中，對氣孔的開張控制機制表現(xiàn)不得當，主要通過利用蠟質(zhì)的合成、堆積來堵塞氣孔，降低蒸騰作用，避免植株受害，屬于完全被動防御機制。比較抗旱性表現(xiàn)相對較強的‘十八學(xué)士’，氣孔的保衛(wèi)細胞在干旱早期就啟動閉合響應(yīng)機制，葉片上表皮的蠟質(zhì)堆積程度更強，更好地起到保護葉片免受光照和有害物質(zhì)的傷害作用。下表皮主要通過控制氣孔開張阻止蒸騰作用，降低脅迫下的生物量損耗。

這些結(jié)果說明，在經(jīng)歷逆境時，植物可能會做出一些更利己的選擇，比如對角質(zhì)蒸騰屏障功能較差的葉片上表皮的蠟質(zhì)層優(yōu)先進行修飾，這是植物在降低自身消耗，最大限度提高自身生存幾率的有效策略，這與張弋的結(jié)論一致[8]，Carr也證實了氣孔關(guān)閉是由水分虧缺引起[10]。因干旱引發(fā)茶花幼苗失水萎蔫后，植株體內(nèi)游離脯氨酸含量很低，因此沒有充足的機制保護其不受傷害[11-12]。

本試驗通過對茶花2個品種的研究，推測葉片表皮的蠟質(zhì)特性，在影響氣孔開張的同時，對植株干旱脅迫下的光合作用也存在影響，但本文未在蠟質(zhì)代謝途徑，以及葉片的細胞器水平上再做深入研究及具體數(shù)據(jù)計量。在之后的研究中，應(yīng)該結(jié)合蠟質(zhì)的合成、代謝途徑及原理，葉片的葉肉細胞和細胞器變化，通過研究不同角質(zhì)層蠟質(zhì)層次的修飾策略，來分析該物質(zhì)是如何具體參與到植物的光合活動中并發(fā)揮作用的。