馬云睿，周 力，高 盼,2，胡傳榮,2，羅 質(zhì),2，何東平,2

(1.武漢輕工大學(xué) 食品學(xué)院，武漢430000; 2.大宗糧油精深加工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430023)

菜籽油是我國主要食用植物油之一，每年產(chǎn)量約520 萬t，占國產(chǎn)植物油總量的 47%[1]。冷榨制油是指在低于85℃的溫度下借助機(jī)械外力將未經(jīng)過炒制的油料中的油脂擠壓出來，此方法可以有效保留油脂中的特殊風(fēng)味與營養(yǎng)物質(zhì)[2-5]。但油菜籽在經(jīng)過冷榨后獲得的菜籽原油，含有磷脂、糖、蛋白質(zhì)等膠質(zhì)混合物，且主要是磷脂[6-10]。油脂中的磷脂含量高時(shí)，加熱后會(huì)產(chǎn)生絮狀沉淀物，并使油色變深，因此須進(jìn)行脫膠處理以除去磷脂[11-12]。常用的水化脫膠和酸法脫膠一般只能去除油脂中的水化磷脂[13]，并且容易造成中性油乳化，增加油耗和皂腳量；而酶法脫膠具有操作條件溫和、能耗低、基本無污染的優(yōu)點(diǎn)。磷脂酶Lecitase Ultra(A1)與磷脂酶C作為目前應(yīng)用較為廣泛的兩種脫膠酶，對于其單一應(yīng)用于油脂脫膠已有較多研究，如單一使用磷脂酶Lecitase Ultra，對蘋果籽油(3 h,磷含量降至7.8 mg/kg)[14]、葵花籽油(3 h，磷含量降至3.02 mg/kg)[15]、大豆油(6.3 h，磷含量降至10.38 mg/kg)[16]等進(jìn)行脫膠，雖然大多數(shù)研究可將磷含量降至較低的水平，脫膠效果顯著，但一般需要超過3 h的酶解時(shí)間，降低了工業(yè)化生產(chǎn)的效率；也有單一使用磷脂酶C對菜籽油[17]、葵花籽油[18]等進(jìn)行脫膠的研究，在最優(yōu)條件下分別在90 min和3 h內(nèi)將磷含量降至7.85、8.2 mg/kg，脫膠效果較好，有研究者使用從地衣芽孢桿菌MTCC 7445提取的新型磷脂酶C對高品質(zhì)植物油在40℃、5 h條件下進(jìn)行脫膠，可使磷含量降至4 mg/kg以下[19]，雖然磷含量降至較為理想的水平，但仍然存在酶解時(shí)間過長的問題。有研究者使用磷脂酶C和磷脂酶A1復(fù)合用于大豆原油的脫膠，在2 h內(nèi)將磷含量降至10 mg/kg[20]。目前，針對菜籽油的復(fù)合酶法脫膠條件的優(yōu)化鮮有報(bào)道。本文采用磷脂酶Lecitase Ultra與磷脂酶C復(fù)合對冷榨菜籽油進(jìn)行脫膠處理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化得到冷榨菜籽油脫膠的工藝條件，以期為冷榨菜籽油的高效脫膠提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

冷榨菜籽原油，實(shí)驗(yàn)室自制。磷脂酶C，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；磷脂酶Lecitase Ultra， 丹麥諾維信公司；磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)、磷脂酰肌醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；乙腈、甲醇均為色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；超純水、雙蒸水，實(shí)驗(yàn)室自制；檸檬酸、氫氧化鈉等均為分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Milli-Q Integral超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器，鞏義市英峪予華儀器廠；XHF-D高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；SHA-CA數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，江蘇東鵬儀器制造有限公司；TD5A臺(tái)式離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；AB204-E型電子分析天平，梅特勒-托利多有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市國華電器有限公司；101-1-S型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 磷脂酶Lecitase Ultra和磷脂酶C酶活力測定

參照文獻(xiàn)[17]，采用NPPC法測定酶活力。

1.2.2 菜籽油的酶法脫膠

參考文獻(xiàn)[21]的方法，對冷榨菜籽原油進(jìn)行酶法脫膠，具體工藝流程：稱取100 g冷榨菜籽原油→水浴加熱至40℃→加50%檸檬酸溶液酸化→加NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.8→以500 r/min攪拌→滯留反應(yīng)3 min→加入磷脂酶Lecitase Ultra→加入蒸餾水→以10 000 r/min高速均質(zhì)→酶解反應(yīng)一定時(shí)間→水浴加熱至55℃→加NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.3→加入磷脂酶C→以10 000 r/min高速均質(zhì)→酶解反應(yīng)一定時(shí)間→于85℃水浴滅酶10 min→以4 000 r/min離心分離→取上層即為脫膠菜籽油。

1.2.3 磷脂含量測定

菜籽油中磷脂主要有磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)[22]，因此通過測定PC、PE、PI含量對菜籽油磷脂含量進(jìn)行定量分析。參考GB 5009.272—2016，采用反相高效液相色譜法測定菜籽油中PC、PE和PI含量。測定條件：Extend-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；柱溫25℃；流動(dòng)相為乙腈-甲醇(體積比6∶4)，流速1.0 mL/min；紫外檢測波長205 nm。

1.2.4 基本指標(biāo)的測定

酸值測定，參照GB 5009.229—2016；過氧化值測定，參照GB 5009.227—2016；水分及揮發(fā)物含量測定，參照GB 5009.236—2016；碘值測定，參照GB/T 5532—2008；皂化值測定，參照GB/T 5534—2008。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析，使用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，使用Design 8.0.6軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料指標(biāo)

經(jīng)測定,冷榨菜籽原油磷脂含量為693 mg/kg，磷脂酶C的酶活力為9 000 U/g，磷脂酶Lecitase Ultra的酶活力為10 000 U/g。

2.2 菜籽油酶法脫膠單因素試驗(yàn)

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間的確定

2.2.1.1 磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時(shí)間

在檸檬酸溶液添加量1.2 mL/kg、磷脂酶Lecitase Ultra添加量30 mg/kg、加水量30 mL/kg、不加磷脂酶C條件下，研究磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時(shí)間對冷榨菜籽油脫膠效果的影響，結(jié)果見圖1。

注：磷脂含量為PC、PE、PI三者總和。下同圖1 磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時(shí)間對冷榨菜籽油脫膠效果的影響

由圖1可知，隨著磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時(shí)間從30 min延長到90 min，磷脂含量由93.11 mg/kg降至27.47 mg/kg，可見在前90 min磷脂酶Lecitase Ultra的酶解反應(yīng)迅速，隨著磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時(shí)間的繼續(xù)延長，磷脂含量趨于穩(wěn)定。在工業(yè)生產(chǎn)中，脫膠時(shí)間對生產(chǎn)效率影響較大，故磷脂酶Lecitase Ultra脫膠時(shí)間初步定為90 min。

2.2.1.2 磷脂酶C反應(yīng)時(shí)間

在磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時(shí)間90 min，磷脂酶C添加量60 mg/kg，改變磷脂酶C的反應(yīng)時(shí)間，其他參數(shù)同2.2.1.1的條件下，研究磷脂酶C反應(yīng)時(shí)間對冷榨菜籽油脫膠效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 磷脂酶C反應(yīng)時(shí)間對冷榨菜籽油脫膠效果的影響

由圖2可知，將經(jīng)過磷脂酶Lecitase Ultra脫膠后的菜籽油用磷脂酶C進(jìn)行二次脫膠，磷脂含量進(jìn)一步降低，當(dāng)磷脂酶C反應(yīng)時(shí)間超過60 min后，磷脂含量趨于穩(wěn)定，故磷脂酶C反應(yīng)時(shí)間可以初步定為60 min。

2.2.2 加水量的確定

在磷脂酶C反應(yīng)時(shí)間60 min，改變加水量，其他參數(shù)同2.2.1.2的條件下，研究加水量對冷榨菜籽油脫膠效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 加水量對冷榨菜籽油脫膠效果的影響

由圖3可見：隨著加水量由10 mL/kg增加到30 mL/kg，磷脂含量由78.41 mg/kg降至3.50 mg/kg，這是因?yàn)橛椭心z體分散相的質(zhì)點(diǎn)粒度隨加水量的增多而增大[21]，有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行；之后，隨著加水量的繼續(xù)增加，磷脂含量反而升高，這可能是因?yàn)榧铀窟^多導(dǎo)致菜籽油乳化，不利于磷脂的脫除[6]。因此，加水量初步定為30 mL/kg。

2.2.3 檸檬酸溶液添加量的研究

在磷脂酶C反應(yīng)時(shí)間60 min，改變檸檬酸溶液添加量，其他參數(shù)同2.2.1.2的條件下，研究檸檬酸溶液添加量對冷榨菜籽油脫膠效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 檸檬酸溶液添加量對冷榨菜籽油脫膠效果的影響

由圖4可見：檸檬酸溶液添加量對磷脂含量的影響曲線與加水量的相似，檸檬酸溶液添加量由0.8 mL/kg增加到1.2 mL/kg時(shí)，磷脂含量由78.38 mg/kg降至4.59 mg/kg，這是因?yàn)闄幟仕崛芤旱奶砑涌梢砸欢ǔ潭壬吓c菜籽油中的金屬離子螯合，使非水化磷脂轉(zhuǎn)化為水化磷脂[23-24]；之后，隨著檸檬酸溶液添加量的繼續(xù)增加，磷脂含量升高，這可能是因?yàn)闄幟仕岬奶砑恿窟^多改變了酶解環(huán)境的pH，超過了磷脂酶的最適pH，從而導(dǎo)致磷脂含量上升。因此，檸檬酸溶液添加量宜取1.2 mL/kg。

2.2.4 加酶量的確定

2.2.4.1 磷脂酶Lecitase Ultra添加量

在磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時(shí)間90 min，改變磷脂酶Lecitase Ultra添加量，其他參數(shù)同2.2.1.1的條件下，研究磷脂酶Lecitase Ultra添加量對冷榨菜籽油脫膠效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 磷脂酶Lecitase Ultra添加量對冷榨菜籽油脫膠效果的影響

由圖5可見，隨著磷脂酶Lecitase Ultra添加量的增加，磷脂含量逐漸降低，在添加量達(dá)到30 mg/kg時(shí)，下降趨勢趨于平緩，這主要是因?yàn)殡S著磷脂酶Lecitase Ultra添加量的增多，酶解反應(yīng)逐漸完全。從經(jīng)濟(jì)方面考慮，磷脂酶Lecitase Ultra添加量取30 mg/kg。

2.2.4.2 磷脂酶C添加量

在磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時(shí)間90 min，磷脂酶C反應(yīng)時(shí)間60 min，改變磷脂酶C添加量，其他參數(shù)同2.2.1.1的條件下，研究磷脂酶C添加量對冷榨菜籽油脫膠效果的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 磷脂酶C添加量對冷榨菜籽油脫膠效果的影響

由圖6可見，隨著磷脂酶C添加量的增加，磷脂含量逐漸降低，在添加量達(dá)到60 mg/kg后，下降趨勢趨于平緩。從經(jīng)濟(jì)方面考慮，磷脂酶C添加量取60 mg/kg。

2.3 菜籽油酶法脫膠響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上， 固定磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時(shí)間為90 min，磷脂酶C反應(yīng)時(shí)間為60 min，以磷脂酶Lecitase Ultra添加量(A)、磷脂酶C添加量(B)、加水量(C)、檸檬酸溶液添加量(D)為因素，以磷脂含量(Y)為響應(yīng)值，利用Design Expert軟件中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法，對菜籽油酶法脫膠工藝進(jìn)行優(yōu)化，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表2 回歸方程方差分析

由表2可知，模型極顯著(p<0.001)，失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05)，說明該模型擬合程度較好，可準(zhǔn)確預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。A、C、A2、C2、D2的影響極顯著(p<0.001)；B與B2的影響較顯著(p<0.01)；因素影響程度的大小排序?yàn)镃>A>B>D，即加水量>磷脂酶Lecitase Ultra添加量>磷脂酶C添加量>檸檬酸溶液添加量。

以磷脂含量(Y)為響應(yīng)值，擬合所得各因素編碼值回歸方程為：Y=3.3-1.58A-0.9B-2.1C-0.29D+0.025AB-0.75AC+0.15AD-0.55BC-0.025BD-0.1CD+1.69A2+1.23B2+2.52C2+3.51D2。

用Design-Expert 8.0.5軟件預(yù)測最佳脫膠條件為磷脂酶Lecitase Ultra添加量32.91 mg/kg、磷脂酶C添加量64.85 mg/kg、加水量32.77 mL/kg、檸檬酸溶液添加量1.2 mL/kg，在此條件下預(yù)測脫膠油磷脂含量為2.03 mg/kg。為了方便實(shí)際操作，將最佳工藝條件修正為磷脂酶Lecitase Ultra添加量33 mg/kg、磷脂酶C添加量65 mg/kg、加水量33 mL/kg、檸檬酸溶液添加量1.2 mL/kg，在此條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，脫膠油平均磷脂含量為2.3 mg/kg，與預(yù)測值基本吻合，進(jìn)一步表明了回歸模型的有效性。

2.4 脫膠菜籽油理化指標(biāo)

采用磷脂酶Lecitase Ultra和磷脂酶C復(fù)合脫膠法，在確定的最佳工藝條件下，對冷榨菜籽原油進(jìn)行脫膠，對脫膠菜籽油和冷榨菜籽原油的基本理化指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 脫膠菜籽油與菜籽原油基本理化指標(biāo)的對比

由表3可知，經(jīng)磷脂酶Lecitase Ultra和磷脂酶C復(fù)合脫膠法制備的脫膠油其過氧化值、酸值均達(dá)到GB/T 1536—2021中規(guī)定的一級壓榨菜籽油標(biāo)準(zhǔn)，皂化值及碘值對于菜籽原油也有明顯提升，磷脂含量相對于菜籽原油由693 mg/kg降至2.3 mg/kg，效果顯著，氣味、滋味與透明度也有明顯提升，可為后續(xù)精煉提供優(yōu)質(zhì)的油品。

3 結(jié) 論

為提高脫膠效率，以冷榨菜籽原油為原料，磷脂含量為指標(biāo)，在對影響菜籽油磷脂酶Lecitase Ultra和磷脂酶C復(fù)合脫膠工藝的單因素進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對復(fù)合酶法脫膠工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最終得到菜籽油磷脂酶Lecitase Ultra和磷脂酶C復(fù)合脫膠的最佳工藝參數(shù)為：磷脂酶Lecitase Ultra添加量33 mg/kg，磷脂酶Lecitase Ultra反應(yīng)時(shí)間90 min，磷脂酶C添加量65 mg/kg，磷脂酶C反應(yīng)時(shí)間60 min，加水量33 mL/kg，檸檬酸溶液添加量1.2 mL/kg。在最佳條件下脫膠，脫膠油中磷脂含量為2.3 mg/kg，脫膠效果良好，脫膠油的皂化值、碘值均有明顯提升，過氧化值及酸值均達(dá)到一級壓榨菜籽油的國家標(biāo)準(zhǔn)。說明優(yōu)化的工藝條件可用于冷榨菜籽油的脫膠。