衛(wèi) 萍，張雅媛，游向榮，鄧靜友，周 葵，楊兆杏

(廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西香蕉保鮮與加工工程技術(shù)研究中心，南寧 530007)

玉米，同小麥和稻谷并稱為世界三大糧食作物[1]，在糧食作物中位居第3位[2]。我國(guó)是全球第二大玉米生產(chǎn)國(guó)，僅次于美國(guó)，玉米產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的20%[3]。普通玉米中含有70%的淀粉，主要用于生產(chǎn)玉米淀粉[4]，近年來(lái)發(fā)展了新型高油高蛋白玉米，改善了玉米籽粒的營(yíng)養(yǎng)成分，研究新型高油高蛋白玉米具有顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。賴氨酸和色氨酸是必需氨基酸，只能從食物中攝取，高蛋白玉米中賴氨酸含量在0.4%以上，其色氨酸含量也比普通玉米高1倍左右。從食用價(jià)值方面來(lái)看，高蛋白玉米具有改善人體營(yíng)養(yǎng)的作用，特別是對(duì)兒童的身體、智力發(fā)育大有裨益，對(duì)嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良的兒童有一定的治療作用，此外對(duì)預(yù)防癩皮病也有較好的療效[5]。微胚乳玉米是一種新型高油高蛋白玉米，與普通玉米相比，胚乳含量極低，籽粒含油率高，油酸、VE、甾醇等有益營(yíng)養(yǎng)成分多，具有玉米的特有香味，榨油后的粕蛋白質(zhì)含量亦很高，且氨基酸組成合理，深加工潛力大。因而對(duì)新型微胚乳高蛋白玉米開展蛋白提取及性質(zhì)研究，對(duì)其后續(xù)加工利用具有重要意義。

目前常用的蛋白提取方法有堿提酸沉法[6]、溶劑法[7]、酶法、反膠束萃取法[8]以及微波和超聲波輔助提取法[9-10]等。其中堿提酸沉法因操作簡(jiǎn)單、易于控制、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)成為應(yīng)用最多且已用于工業(yè)化的蛋白提取方法[6]。本研究首先采用單因素試驗(yàn)考察堿提酸沉法提取微胚乳玉米蛋白的主要工藝參數(shù)，然后以玉米蛋白得率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化獲得微胚乳玉米蛋白的最優(yōu)提取條件，然后對(duì)最優(yōu)條件下提取的微胚乳玉米蛋白和普通玉米蛋白的組成進(jìn)行了比較，以期為微胚乳高蛋白玉米的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

微胚乳玉米(水分7.13%、粗脂肪24.7%、粗蛋白質(zhì)21.6%、總淀粉27.1%、灰分3.2%)，廣西益寶油料玉米有限公司；普通玉米(爆米花用)，廣西南寧市廣百佳超市；氫氧化鈉、鹽酸、冰乙酸、溴酚藍(lán)、甘氨酸、甘油、過硫酸銨，均為分析純；丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)R250、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、N，N，N,N-四甲基乙二胺(TEMED，超純級(jí))、β-巰基乙醇(生化級(jí))、標(biāo)準(zhǔn)蛋白，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

JY6002電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；RRH-100萬(wàn)能高速粉碎機(jī)，歐凱萊芙(香港)實(shí)業(yè)有限公司；L550低速大量離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；PHS-3C pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LGJ-18冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；XH-C渦旋混合器，江蘇省金壇市榮華實(shí)驗(yàn)器材有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市萬(wàn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠；DYCZ-25E電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米蛋白等電點(diǎn)的確定

將微胚乳玉米干燥，然后準(zhǔn)確稱取50.0 g干微胚乳玉米，粉碎過0.18 mm(80目)篩，經(jīng)索氏抽提脫脂后按1∶10的料液比加500 mL蒸餾水充分混勻，用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至11，在50℃恒溫水浴中振蕩60 min后以4 000 r/min離心20 min，底部沉淀重復(fù)提取1次，將2次提取的上清液合并分別用1.0 mol/L HCl調(diào)pH至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，靜置30 min出現(xiàn)分層，以4 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀經(jīng)真空冷凍干燥后稱質(zhì)量，計(jì)算玉米蛋白得率。以pH為橫坐標(biāo)，玉米蛋白得率為縱坐標(biāo)，繪制曲線，曲線中玉米蛋白得率最高的點(diǎn)對(duì)應(yīng)的pH即為玉米蛋白的等電點(diǎn)。玉米蛋白得率按式(1)計(jì)算。

Y=m1/m0×100%

(1)

式中：Y為玉米蛋白得率；m1為玉米蛋白(沉淀)質(zhì)量，g；m0干玉米粒質(zhì)量，g。

1.2.2 堿提酸沉法提取玉米蛋白

準(zhǔn)確稱取一定量的干玉米粒，粉碎過0.18 mm(80目)篩，經(jīng)索氏抽提脫脂后按一定料液比加蒸餾水充分混勻，用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至一定的pH，置于一定溫度的恒溫水浴鍋中振蕩提取一定時(shí)間后，離心取上清液用1.0 mol/L HCl調(diào)pH至玉米蛋白等電點(diǎn)，靜置，待玉米蛋白沉降后以10 000 r/min離心10 min，取沉淀真空冷凍干燥后即得玉米蛋白。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

參照衛(wèi)萍等[11]的方法進(jìn)行SDS-PAGE分析，其中樣品制備方法略有修改。樣品制備方法：分別稱取1 mg玉米蛋白溶于5 mL 2倍蛋白樣品緩沖液中，渦旋混合器混勻溶解成透明的深藍(lán)色溶液，沸水浴中煮沸10 min使蛋白質(zhì)充分變性。

1.2.4 氨基酸組成分析

參考GB 5009.124—2016測(cè)定樣品的氨基酸組成。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析，并用Origin 8.1軟件進(jìn)行繪圖，響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行多元回歸擬合及工藝參數(shù)優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米蛋白的等電點(diǎn)

按1.2.1方法測(cè)定玉米蛋白等電點(diǎn)，pH與玉米蛋白得率的關(guān)系見圖1。

圖1 pH對(duì)玉米蛋白得率的影響

由圖1可知，隨著pH的升高，玉米蛋白得率先升高后下降。在pH為5.0時(shí)，玉米蛋白得率達(dá)到最大值，為19.54%。這是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中不存在同電荷的相互排斥作用，其顆粒極易相互碰撞凝聚而沉淀析出，此時(shí)溶液中蛋白質(zhì)的溶解度最小[10]。因此，確定玉米蛋白的等電點(diǎn)為5.0。另外，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)二次提取對(duì)玉米蛋白得率影響較小，故后續(xù)試驗(yàn)使用一次提取工藝，以便節(jié)約時(shí)間和成本。

2.2 微胚乳玉米蛋白提取單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)玉米蛋白得率的影響

在提取溫度50℃、提取時(shí)間60 min、提取pH 11條件下，考察料液比對(duì)玉米蛋白得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對(duì)玉米蛋白得率的影響

由圖2可知，隨著料液比的增加，玉米蛋白得率先迅速增加后緩慢增加。在料液比為1∶5時(shí)，玉米蛋白得率最低，為9.51%，在料液比為1∶10時(shí)玉米蛋白得率迅速增加至18.93%。這是因?yàn)樵诹弦罕容^低時(shí)，一方面提取體系黏度大，分子擴(kuò)散速率低，蛋白質(zhì)分子的溶出速率低，另一方面蛋白質(zhì)濃度較高，分子間的相互排斥力阻礙更多蛋白質(zhì)的溶出[12]，而隨料液比的增加，稀釋作用加強(qiáng)，提取體系的黏度和蛋白質(zhì)濃度都有所下降，蛋白質(zhì)溶出增加，從而使玉米蛋白得率增加。但當(dāng)料液比超過1∶10時(shí)，玉米蛋白得率增加放緩，并且與料液比1∶10時(shí)的玉米蛋白得率差異不顯著(p>0.05)。分析原因可能是蛋白質(zhì)的溶解度達(dá)到飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加溶劑蛋白質(zhì)溶解也不明顯[13]。綜合考慮，料液比為1∶10 左右較適宜。

2.2.2 提取pH對(duì)玉米蛋白得率的影響

在提取溫度50℃、提取時(shí)間60 min、料液比1∶10的條件下，考察提取pH對(duì)玉米蛋白得率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著提取pH的升高，玉米蛋白得率逐漸增大，在提取pH為11.5時(shí)達(dá)到最大，為18.56%。原因在于堿液能使細(xì)胞緊密結(jié)構(gòu)變得疏松，破壞蛋白質(zhì)分子的次級(jí)鍵特別是氫鍵，使玉米蛋白質(zhì)分子表面帶有相同電荷，促進(jìn)結(jié)合物與蛋白質(zhì)的分離，使蛋白得率增加[14-15]。當(dāng)提取pH大于11.5時(shí)，玉米蛋白得率反而降低，原因可能是蛋白質(zhì)水解導(dǎo)致的[10]。另外，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著提取pH的升高，玉米蛋白的顏色會(huì)變深。因此，選擇提取pH為11.5左右較適宜。

圖3 提取pH對(duì)玉米蛋白得率的影響

2.2.3 提取溫度對(duì)玉米蛋白得率的影響

在提取時(shí)間60 min、提取pH 11、料液比1∶10的條件下，考察提取溫度對(duì)玉米蛋白得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對(duì)玉米蛋白得率的影響

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，玉米蛋白得率先增大后減小，在提取溫度為50℃時(shí)，玉米蛋白得率最大，為18.35%，這與任秀艷等[16]研究獲得的最佳提取溫度一致。當(dāng)提取溫度高于50℃后，玉米蛋白得率開始顯著下降。分析原因可能是溫度較高時(shí)，水發(fā)生了解離，Sereewatthanawut等[17]利用色譜分析也證明了水的解離現(xiàn)象，同時(shí)在高溫條件下蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生降解，共同造成了玉米蛋白得率的降低。因此，選擇提取溫度50℃左右較適宜。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)玉米蛋白得率的影響

在提取溫度50℃、提取pH 11、料液比1∶10的條件下，考察提取時(shí)間對(duì)玉米蛋白得率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)玉米蛋白得率的影響

由圖5可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，玉米蛋白得率增加，在提取時(shí)間為90 min時(shí)，玉米蛋白得率達(dá)到最大，為18.10%，之后玉米蛋白得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)反而降低。分析原因可能是提取時(shí)間太長(zhǎng)，玉米蛋白發(fā)生部分變性或降解。因此，適宜的提取時(shí)間為90 min左右。

2.3 微胚乳玉米蛋白提取響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)，以料液比(A)、提取pH(B)、提取溫度(C)及提取時(shí)間(D)4個(gè)因素為自變量，以玉米蛋白得率(Y)為響應(yīng)值，采用中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1，響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

續(xù)表2

2.3.2 回歸模型的建立及方差分析

對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y=18.44+1.10A+0.30B+2.500E-003C-0.69D-0.23AB+0.038AC+0.22AD-0.68BC-0.071BD+0.29CD-6.042E-003A2-0.62B2+0.038C2-0.39D2。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析

由表3可知，模型的p小于0.000 1，表明模型差異極顯著，失擬項(xiàng)p為0.359 9，大于0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，說明未知因素對(duì)結(jié)果干擾很小，該模型基本能反映料液比、提取pH、提取溫度及提取時(shí)間與玉米蛋白得率的關(guān)系，可以用此模型分析和預(yù)測(cè)堿提酸沉法提取玉米蛋白的結(jié)果。由F值可以看出各因素影響主次順序?yàn)锳(料液比)>D(提取時(shí)間)>B(提取pH)>C(提取溫度)。由p值可知AB、AD交互作用差異高度顯著(p<0.01)，BC、CD交互作用差異極顯著(p<0.001)。

通過對(duì)回歸模型求偏導(dǎo)，得到玉米蛋白提取的最優(yōu)工藝條件為料液比1∶14.75、提取pH 11.4、提取溫度48.95℃、提取時(shí)間61.20 min，在此條件下玉米蛋白得率的預(yù)測(cè)值為20.42%。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，采用響應(yīng)面優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行玉米蛋白提取試驗(yàn)，考慮實(shí)際操作的便利，將最優(yōu)工藝條件修正為料液比1∶15、提取pH 11.5、提取溫度50℃、提取時(shí)間60 min。試驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)際玉米蛋白得率平均值為20.40%，與理論得率20.42%的相對(duì)誤差為0.10%，無(wú)顯著性差異，說明模型可以很好地預(yù)測(cè)微胚乳玉米蛋白提取情況。

2.4 玉米蛋白的分子質(zhì)量分布

分別以微胚乳玉米和普通玉米為原料，按照1.2.2方法，在響應(yīng)面優(yōu)化的微胚乳玉米蛋白提取最優(yōu)工藝條件下，提取微胚乳玉米蛋白和普通玉米蛋白，并對(duì)兩種蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖6。

注：條帶1、2、3、4分別代表Marker(標(biāo)準(zhǔn)蛋白)、普通玉米蛋白、微胚乳玉米蛋白、Marker圖6 玉米蛋白SDS-PAGE分析圖

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率和分子質(zhì)量對(duì)數(shù)制作工作曲線，再根據(jù)被測(cè)蛋白的遷移率估算其分子質(zhì)量。由圖6可見，微胚乳玉米蛋白與普通玉米蛋白出現(xiàn)條帶的位置基本一致，且分子質(zhì)量分布均小于60 kDa，普通玉米蛋白有5條主帶，分子質(zhì)量分別為55.59、40.62、30.46、24.82、19.21 kDa，微胚乳玉米蛋白亦有5條主帶，分子質(zhì)量分別為55.59、40.62、30.46、24.82、18.14 kDa，但是二者在15～20 kDa之間出現(xiàn)的條帶略有不同，說明微胚乳玉米蛋白與普通玉米蛋白組成有區(qū)別，這可能會(huì)導(dǎo)致二者加工性質(zhì)方面有所差異，有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

2.5 玉米蛋白的氨基酸組成

對(duì)最優(yōu)工藝條件下提取的微胚乳玉米蛋白和普通玉米蛋白的氨基酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果如表4所示。

表4 玉米蛋白氨基酸組成及含量 %

由表4可見，玉米蛋白中共檢出16種氨基酸，種類較為齊全，未檢測(cè)到色氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺和胱氨酸，可能是因?yàn)樵谒嵝詶l件下水解，色氨酸被沸酸完全破壞，天門冬酰胺和谷氨酰胺側(cè)鏈的酰胺基也被水解成了羧基。普通玉米蛋白和微胚乳玉米蛋白包含7種人體必需氨基酸(色氨酸除外)，分別占氨基酸總量的35.44%和36.15%，兩種玉米蛋白的蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、組氨酸含量較少，但是谷氨酸、亮氨酸、精氨酸、天門冬氨酸含量較高，其中普通玉米蛋白這4種氨基酸分別占氨基酸總量的16.92%、9.50%、7.56%和7.50%，微胚乳玉米蛋白這4種氨基酸分別占氨基酸總量的17.56%、11.77%、7.09%和7.49%。高含量的谷氨酸是表征玉米蛋白的一個(gè)重要特性，這與唐紅明[18]報(bào)道的結(jié)果相似。谷氨酸可促進(jìn)機(jī)體生物代謝，提高大腦思維活躍水平，可用于治療神經(jīng)衰弱和記憶力減退[19]。

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法建立了微胚乳玉米蛋白提取工藝的二次項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，該模型擬合度良好。影響微胚乳玉米蛋白得率的因素主次順序?yàn)榱弦罕?提取時(shí)間>提取pH>提取溫度，最優(yōu)提取工藝條件為料液比1∶15、提取pH 11.5、提取溫度50℃、提取時(shí)間60 min。在最優(yōu)條件下，微胚乳玉米蛋白得率為20.40%。對(duì)最優(yōu)條件下提取的微胚乳玉米蛋白與普通玉米蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，二者出現(xiàn)的條帶位置基本一致，只是在15～20 kDa出現(xiàn)的條帶略有不同。兩種玉米蛋白的氨基酸種類一致，較為齊全，同時(shí)谷氨酸、亮氨酸、精氨酸、天門冬氨酸含量較高，其中微胚乳玉米蛋白的必需氨基酸含量較普通玉米蛋白高。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究利用新型微胚乳玉米蛋白提供了良好的研究基礎(chǔ)。