汪雨卿，張 越，徐 穩(wěn)，崔中奇

（1.上海大學(xué)計算機工程與科學(xué)學(xué)院，上海 200444；2.同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院檢驗科，上海 200072）

結(jié)腸癌是世界第三大惡性腫瘤，居腫瘤致死原因的第2位[1-2]。近10年來，盡管結(jié)腸癌的診斷和治療已取得了一定的進展，但由于缺乏早期篩查和預(yù)后監(jiān)測的生物標志物，導(dǎo)致患者的死亡率居高不下[2]。鐵死亡是一種鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物積累所致的細胞調(diào)節(jié)性死亡，明顯異于細胞凋亡、細胞自噬和細胞焦亡[3]。鐵代謝紊亂是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素[4]。與正常細胞相比，腫瘤細胞表現(xiàn)出明顯的鐵成癮性，而激活鐵死亡途徑可在一定程度上克服化療藥物的耐藥性，為腫瘤的治療開辟新的領(lǐng)域[5]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度約為200個核苷酸的RNA分子。lncRNA除具有調(diào)控基因表達的經(jīng)典功能外，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后和治療中也扮演著不可忽視的作用[6]。目前，關(guān)于鐵死亡相關(guān)lncRNA的研究很少。本研究擬基于腫瘤基因圖譜計劃（the Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫篩選鐵死亡相關(guān)lncRNA，建立結(jié)腸癌的預(yù)后風(fēng)險模型，同時探索關(guān)鍵lncRNA ITGB1-DT在結(jié)腸癌中的生物學(xué)功能，為結(jié)腸癌的治療和預(yù)后評估提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2019年7月—2021年12月同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院行結(jié)腸癌根治術(shù)的患者48例，其中男26例、女22例，年齡39～72歲。所有患者均未經(jīng)過任何化療或放療，術(shù)后經(jīng)病理診斷確診為結(jié)腸癌。收集術(shù)中切除的癌組織及對應(yīng)的癌旁組織（距癌組織邊緣2～3 cm），立即放入液氮中保存。本研究經(jīng)同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

從TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//www.cancer.gov/tcga/）中收集結(jié)腸癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床資料。通過Ensembl網(wǎng)站（http：//asia.ensembl.org/index.html）注釋人類基因注釋文件（GRCh38.103.chr.gtf.gz），以區(qū)分mRNA和lncRNA。剔除臨床資料不完整和缺失生存數(shù)據(jù)的患者，最終保留428例結(jié)腸癌患者用于后續(xù)分析。

1.2 方法

1.2.1 差異表達鐵死亡相關(guān)基因的獲取和生物學(xué)功能分析 通過鐵死亡數(shù)據(jù)庫（FerrDb）（http：//www.zhounan.org/ferrdb/） 獲得288個鐵死亡相關(guān)基因，其中鐵死亡驅(qū)動基因108個、鐵死亡抑制基因69個、鐵死亡標志基因111個。采用R軟件中的“l(fā)imma”程序包對結(jié)腸癌組和正常對照組中的鐵死亡相關(guān)基因進行差異性分析，篩選標準為|logFC|≥1且P＜0.05。采用R軟件“Clusterprofilter”程序包對這些差異基因進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析。

1.2.2 預(yù)后相關(guān)的鐵死亡lncRNA的篩選 采用Pearson相關(guān)分析篩選鐵死亡相關(guān)的lncRNA，篩選標準為r≥0.3且P＜0.001。采用R軟件“survival”程序包中的Cox比例風(fēng)險回歸模型篩選與結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)的鐵死亡lncRNA，篩選標準為P＜0.01。

1.2.3 結(jié)腸癌患者中鐵死亡相關(guān)lncRNA的共識聚類分析 使用R軟件“Consensus Cluster Plus”程序包進行無監(jiān)督有共識聚類分析。根據(jù)預(yù)后相關(guān)的鐵死亡lncRNA表達與模糊聚類測量比例之間的相似性確定具有最佳穩(wěn)定性的聚類數(shù)。采用“survival”程序包評估不同集群（集群1和集群2）的患者總體生存率。

1.2.4 鐵死亡相關(guān)lncRNA預(yù)后風(fēng)險模型的建立 將428例結(jié)腸癌患者按7∶3的比例隨機分為訓(xùn)練組和驗證組。在訓(xùn)練組中進行LASSO回歸分析，“懲罰”參數(shù)采用R軟件“glmnet”程序包，通過10倍交叉驗證的方式進行估算，根據(jù)最小的λ值篩選出10個lncRNA，按公式計算風(fēng)險評分：風(fēng)險評分=∑風(fēng)險系數(shù)（genei）×每個lncRNA的表達量（expi）。隨后采用R軟件“survival”程序包繪制Kaplan-Meier生存曲線，比較高、低風(fēng)險組的總體生存率。采用R軟件“time ROC”程序包繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，評估預(yù)后模型判斷結(jié)腸癌患者1年生存、3年生存和5年生存的效能。

1.2.5 臨床列線圖的構(gòu)建 根據(jù)428例結(jié)腸癌患者的臨床資料（年齡、性別、腫瘤Stage分期、TNM分期）和風(fēng)險評分，利用“rms”程序包繪制列線圖，用于預(yù)測結(jié)腸癌患者的1年、3年和5年的生存率。

1.2.6 RNA提取和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR） 取適量組織樣本，加入1 mL TRIzol裂解液（美國Invitrogen公司），提取總RNA，采用NanoDrop 2000紫外分光光度計（美國ThermoFisher Scientific公司）檢測RNA的純度及濃度。采用Prime-Script RT試劑盒（日本TaKaRa公司）對提取的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得互補DNA（complementary DNA，cDNA）。采用SYBR試劑盒（日本TaKaRa公司）對ITGB1-DT進行定量檢測，檢測儀器為ABI 7500 PCR擴增儀（美國ABI公司）。ITGB1-DT的正向引物序列為5'-TGTATGTGATGGCTTTGGAG-3'，反向引物序列為5'-AGGTGGGCAGTGGTATGG-3'。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析ITGB1-DT的相對表達量。嚴格按儀器和試劑盒說明書進行操作。

1.2.7 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 結(jié)腸癌細胞系HCT-116和SW480均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American type culture collection，ATCC）細胞庫。所有細胞均置于含10%胎牛血清（美國Invitrogen公司）和1%青霉素-鏈霉素（美國Invitrogen公司）的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）（美國Gibco公司）中，在37 ℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)。

將HCT-116細胞和SW480細胞分別接種于6孔板中，待細胞融合度達60%～70%時進行細胞轉(zhuǎn)染。按Lipofectamine 2000試劑（美國Invitrogen公司）說明書，分別將干擾對照質(zhì)粒（sh-NC）、ITGB1-DT表達干擾質(zhì)粒（sh-ITGB1-DT#1和sh-ITGB1-DT#2）轉(zhuǎn)染至HCT-116細胞和SW480細胞。轉(zhuǎn)染24 h后采用RT-qPCR檢測ITGB1-DT的表達量，以確定轉(zhuǎn)染效率。所有質(zhì)粒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。干擾質(zhì)粒的序列見表1。

表1 干擾質(zhì)粒的序列

1.2.8 細胞增殖和克隆形成能力的檢測 （1）細胞增殖實驗。采用CCK-8試劑盒檢測HCT-116細胞和SW480細胞的增殖水平。收集轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HCT-116細胞和SW480細胞，按1 000個細胞/孔接種到96孔板中，同時每孔加入10 μL反應(yīng)液，每組設(shè)置6個重復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24、48、72和96 h時檢測每孔450 nm波長處的吸光度（A）值，繪制生長曲線。（2）克隆形成實驗。收集轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的2種結(jié)腸癌細胞，按照2 000個/孔接種到6孔板中，加入新鮮的DMEM，每隔2天換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)2周后，棄去培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定15 min，棄去固定液，加入0.1%結(jié)晶紫染色液2 mL，染色30 min，拍照并采用Image J軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）進行計數(shù)分析。

1.2.9 細胞死亡和脂質(zhì)過氧化的測定 采用碘化丙啶（美國Invitrogen公司）染色確定細胞是否死亡。HCT-116細胞和SW480細胞轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后用胰蛋白酶消化，清洗2次，并重新懸浮在500 μL含500 ng/mL碘化丙啶的磷酸鹽緩沖液中，37 ℃孵育20 min后，采用LSRFortessa X-20流式細胞儀（美國BD公司）檢測細胞活力。采用2 μmol/L BODIPY-C11（美國Invitrogen公司）對轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的2種結(jié)腸癌細胞進行染色，并用LSRFortessa X-20流式細胞儀檢測細胞的脂質(zhì)過氧化水平。

1.2.10 谷胱甘肽檢測 采用還原型/氧化型谷胱甘肽試劑盒（美國Dojindo Molecular Technologies公司）檢測細胞內(nèi)谷胱甘肽水平。收集1×106個細胞重懸于5%磺基水楊酸中，并用玻璃珠渦旋混勻（混勻4次，每次1 min），隨后冰水浴15 min，以17 900×g離心10 min，收集上清液，用蒸餾水稀釋5倍，然后測定谷胱甘肽水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用R 4.0.3軟件和Graphad Prism 9.0軟件進行統(tǒng)計分析和作圖。組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗和Kruskal-Wallis檢驗。采用Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)腸癌患者的生存情況。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價預(yù)后風(fēng)險模型預(yù)測結(jié)腸癌患者1、3、5年生存的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達的鐵死亡相關(guān)基因的生物學(xué)功能分析結(jié)果

通過TCGA數(shù)據(jù)庫對428例結(jié)腸癌組織和41例正常結(jié)腸組織進行基因差異表達分析，篩選出72個差異表達的鐵死亡相關(guān)基因，其中表達上調(diào)47個、表達下調(diào)25個。GO聚類分析結(jié)果顯示，差異表達的鐵死亡相關(guān)基因主要涉及缺氧反應(yīng)、脂肪酸代謝和鐵離子反應(yīng)等；KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，差異表達的鐵死亡相關(guān)基因主要涉及不飽和脂肪酸生物合成、P53和白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）等信號通路。見圖1。

圖1 差異表達的鐵死亡相關(guān)基因涉及的生物學(xué)功能

2.2 結(jié)腸癌患者鐵死亡相關(guān)lncRNA鑒定結(jié)果

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，共有2 423個lncRNA與72個差異表達的鐵死亡相關(guān)基因顯著相關(guān)。單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，2 423個lncRNA中，有20個與結(jié)腸癌患者的總體生存率相關(guān)。進一步比較這20個lncRNA在結(jié)腸癌組織和正常組織中的表達，發(fā)現(xiàn)其在結(jié)腸癌組織與正常組織中的表達不同（P＜0.01、P＜0.001）。見圖2。

圖2 鐵死亡相關(guān)lncRNA的鑒定

2.3 結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)鐵死亡lncRNA的共識聚類分析結(jié)果

共識聚類分析結(jié)果顯示，當k=2時，具有最佳的聚類穩(wěn)定性。根據(jù)k值將結(jié)腸癌患者分為2個集群：集群1（333例）和集群2（89例）。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，集群2的總體生存率顯著低于集群1（P＜0.001）。見圖3。

圖3 鐵死亡相關(guān)lncRNA的共識聚類分析

2.4 鐵死亡相關(guān)lncRNA風(fēng)險評分的構(gòu)建

根據(jù)LASSC-Cox回歸分析結(jié)果，按最小λ值標準，共篩選出10個lncRNA用于構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險模型，見圖4（a）、（b），模型中每個lncRNA的風(fēng)險系數(shù)見圖4（c）。根據(jù)這10個lncRNA的表達量和系數(shù)計算出每個結(jié)腸癌患者的風(fēng)險評分，計算公式為：風(fēng)險評分=0.036 7×AL360181.1+0.798 9×ITGB1-DT+0.038 3×AC073611.1+0.112 1×AC010973.2+0.159 3×AP003555.1+0.010 6×AP001469.3+0.671 0×FALEC+0.137 8×AC105219.3+0.188 6×AC005841.1+0.367 4×FGF14-AS2。根據(jù)風(fēng)險評分的中位數(shù)，將訓(xùn)練組中的患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，高風(fēng)險組總體生存率顯著低于低風(fēng)險組（P＜0.001），見圖4（d）。在驗證組中得到了相同的結(jié)果，見圖4（e）；ROC曲線分析結(jié)果顯示，在訓(xùn)練組中，該預(yù)后風(fēng)險模型預(yù)測結(jié)腸癌患者1、3和5年生存的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.733、0.790、0.776，見圖4（f）；在驗證組中，該預(yù)后風(fēng)險模型預(yù)測結(jié)腸癌患者1、3和5年生存的AUC分別為0.697、0.726、0.722，見圖4（g）。

圖4 鐵死亡相關(guān)lncRNA預(yù)后風(fēng)險模型的構(gòu)建及驗證

2.5 預(yù)后風(fēng)險模型在結(jié)腸癌預(yù)后判斷中的價值

對于結(jié)腸癌患者總體，Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，高風(fēng)險組總體生存率顯著低于低風(fēng)險組（P＜0.001），見圖5（a）。ROC曲線分析結(jié)果顯示，預(yù)后風(fēng)險模型判斷結(jié)腸癌患者1、3和5年生存的AUC分別為0.717、0.759、0.735，見圖5（b）。單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，年齡、腫瘤Stage分期、腫瘤T分期、遠隔轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移和風(fēng)險評分與結(jié)腸癌患者的總體生存率相關(guān)（P＜0.01）；多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，年齡、腫瘤T分期和風(fēng)險評分是影響結(jié)腸癌患者的總體生存率的獨立危險因素，見表2。

表2 結(jié)腸癌患者總體生存率的Cox回歸分析

圖5 預(yù)后風(fēng)險模型在結(jié)腸癌患者預(yù)后判斷中的價值

2.6 鐵死亡lncRNA預(yù)后風(fēng)險模型和臨床病理因素列線圖的構(gòu)建

將患者的風(fēng)險評分與臨床參數(shù)結(jié)合，構(gòu)建諾模圖。通過計算患者臨床參數(shù)和風(fēng)險評分獲得總分，預(yù)測患者的1、3和5年生存率分別為96.1%、90.3%和83.3%。見圖6。

圖6 結(jié)腸癌患者列線圖的構(gòu)建

2.7 ITGB1-DT lncRNA在結(jié)腸癌中的功能的驗證結(jié)果

ITGB1-DT在預(yù)后風(fēng)險模型中的風(fēng)險系數(shù)最高。結(jié)腸癌組織ITGB1-DT相對表達量顯著高于癌旁組織（P＜0.001）。在HCT-116細胞和SW480細胞中，sh-ITGB1-DT#1組和sh-ITGB1-DT#2組ITGB1-DT表達、細胞增殖能力均顯著低于sh-NC組（P＜0.001、P＜0.01），細胞的死亡率、活性氧水平和細胞內(nèi)還原型GSH/氧化型GSH比值均顯著高于sh-NC組（P＜0.01、P＜0.01、P＜0.001）。見圖7。

圖7 ITGB1-DT對結(jié)腸癌細胞增殖及鐵死亡的影響

注：（a）癌組織與癌旁組織中ITGB1-DT相對表達量的比較；（b）各組ITGB1-DT相對表達量比較；（c）干擾ITGB1-DT對HCT-116和SW480細胞增殖的影響；sh-NC；sh-ITGB1-DT#1；sh-ITGB1-DT#2；與sh-NC比較，*P＜0.01；（d）干擾ITGB1-DT對HCT-116和SW480細胞克隆形成的影響；（e）干擾ITGB1-DT對HCT-116和SW480細胞死亡的影響；（f）干擾ITGB1-DT對HCT-116和SW480細胞活性氧的影響；（g）干擾ITGB1-DT對HCT-116和SW480細胞還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比值的影響；sh-NC；sh-ITGB1-DT#1；sh-ITGB1-DT#2。

3 討論

結(jié)腸癌是一種具有高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，發(fā)病率高，病亡率高[7]。目前尚缺乏可用于結(jié)腸癌診斷和預(yù)后判斷的特異性生物標志物。因此，探索結(jié)腸癌的分子機制，并篩選可靠的預(yù)后生物標志物，以準確預(yù)測患者的臨床結(jié)果，指導(dǎo)個性化治療成為臨床研究的熱點。

鐵死亡被認為是一種鐵依賴的調(diào)節(jié)性細胞死亡形式，在促進腫瘤發(fā)展和對抗腫瘤治療反應(yīng)中扮演著重要的角色[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在調(diào)控腫瘤細胞的鐵死亡過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，如lncRNA可通過調(diào)控鐵死亡相關(guān)蛋白的形成過程參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]。WU等[10]的研究結(jié)果顯示，lncRNA APCDC1L-AS可以通過抑制上皮細胞生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的自噬降解來誘導(dǎo)肺腺癌對埃克替尼（EGFR-酪氨酸激酶抑制劑）的耐藥。細胞質(zhì)中的lncRNA P53RRA影響一些代謝基因的轉(zhuǎn)錄，并通過激活P53促進鐵中毒[11]。lncRNA P53RRA在增強鐵誘導(dǎo)細胞死亡激活劑Erastin誘導(dǎo)生長抑制作用的同時，也增加了細胞內(nèi)鐵和脂質(zhì)活性氧的濃度，這種機制與腫瘤的鐵死亡密切相關(guān)。lncRNA LINC00336是鐵死亡的關(guān)鍵抑制因子，通過與胚胎致死性異常視覺1（embryonic lethal，abnormal visionlike 1，ELAVL1）蛋白的相互作用降低細胞內(nèi)鐵和脂質(zhì)活性氧水平，在肺癌中發(fā)揮了較好的抗腫瘤作用[12]。以上結(jié)果均提示，lncRNA作為鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子在腫瘤治療中發(fā)揮著重要作用。

本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出72個差異表達的鐵死亡相關(guān)基因，其中表達上調(diào)47個、表達下調(diào)25個。GO富集分析和KEGG通路分析結(jié)果顯示，這些基因廣泛參與了鐵代謝和脂肪酸代謝等生物學(xué)過程。根據(jù)Pearson相關(guān)分析結(jié)果和獨立預(yù)后分析結(jié)果進一步篩選出了20個與結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)的鐵死亡lncRNA。通過共識聚類分析將所有結(jié)腸癌患者分為2個亞組，采用Kaplan-Meier生存曲線分析不同亞組的生存情況，結(jié)果顯示，集群2患者的總體生存率明顯低于集群1患者的總體生存率（P＜0.001）。本研究還根據(jù)LASSO-Cox回歸分析結(jié)果篩選出10個lncRNA，用于構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險模型，并在訓(xùn)練組、驗證組和總體結(jié)腸癌患者中進行驗證，結(jié)果顯示，在訓(xùn)練組、驗證組和總體結(jié)腸癌患者中，高風(fēng)險組的總體生存率均顯著低于低風(fēng)險組（P＜0.001）。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，在訓(xùn)練組中，預(yù)后風(fēng)險模型判斷結(jié)腸癌患者1、3和5年生存的AUC分別為0.733、0.790和0.776；在驗證組中，預(yù)后風(fēng)險模型判斷結(jié)腸癌患者1、3和5年生存的AUC分別為0.697、0.726和0.722。這表明本研究構(gòu)建的鐵死亡相關(guān)lncRNA預(yù)后風(fēng)險模型可較準確地評估結(jié)腸癌患者的預(yù)后情況。本研究列線圖分析結(jié)果顯示，通過患者臨床特征和風(fēng)險進行評分，可準確評估患者的總體生存率，對結(jié)腸癌患者的臨床管理有一定的參考價值。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中ITGB1-DT相對表達量顯著高于癌旁組織（P＜0.001）；有細胞學(xué)實驗結(jié)果顯示，ITGB1-DT可促進結(jié)腸癌的增殖，并抑制其鐵死亡，從而對腫瘤的進展進行正向調(diào)控。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了鐵死亡相關(guān)lnRNA的預(yù)后風(fēng)險模型，可對結(jié)腸癌患者的預(yù)后進行準確評估；證實了ITGB1-DT通過促進結(jié)腸癌細胞增殖來抑制鐵死亡，發(fā)揮促癌作用。這將為結(jié)腸癌患者的治療和預(yù)后評估提供新的思路。