譚美玉，殳 潔，宣彬彬，周麗達，李 紅，侯尚偉，盛慧明

（1.上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院檢驗科，上海 200336；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院虹橋醫(yī)學國際研究院，上海 200336）

2019年年底，新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）的出現(xiàn)導(dǎo)致了新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的全球大流行[1]。目前，世界各國學者已廣泛開展對SARS-CoV-2的研究，在深入解析該病毒特性的同時，逐步開展疫苗、治療性抗體和抗病毒藥物的研究工作?！缎鹿诓《疽呙缃臃N技術(shù)指南（第一版）》建議18周歲及以上人群接種新冠病毒滅活疫苗（Vero細胞）2劑，2劑之間的接種時間間隔≥3周，并在8周內(nèi)盡早完成[2]。為了驗證接種SARS-CoV-2滅活疫苗后機體的保護性抗體滴度，確認疫苗接種效果，本研究擬分析SARS-CoV-2滅活疫苗接種者的相關(guān)指標，探討疫苗接種后中和抗體的產(chǎn)生情況，以及將外周血T細胞亞群作為疫苗接種后維持免疫力的標志物的可行性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年12月—2021年10月上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院進行SARS-CoV-2滅活疫苗接種的醫(yī)務(wù)人員志愿者121名，其中男43名、女78名，年齡20～59歲。排除標準：（1）有湖北省旅居史者，我國港、澳、臺地區(qū)居民，其他國家或地區(qū)的居民，2019年12月以來報告的COVID-19患者；（2）既往感染嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒；（3）接種SARS-CoV-2滅活疫苗14 d內(nèi)出現(xiàn)發(fā)燒、咳嗽、疼痛、腹瀉、呼吸困難或呼吸急促等不良反應(yīng)；（4）實驗室檢查異常，血清特異性IgM或IgG陽性；（5）處于孕期或哺乳期；（6）對疫苗中的任何成分過敏；（7）有癲癇發(fā)作或精神疾病史；（8）未按照知情同意書在規(guī)定時間內(nèi)采集靜脈血或采血量不足2 mL。所有受試者均接種北京生物制品研究所生產(chǎn)的新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero細胞）（6.5 U/0.5 mL）。將所有對象根據(jù)接種劑次分為2劑次組（接種2劑疫苗）和3劑次組（接種3劑疫苗），分組情況見表1。本研究通過上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院倫理委員會審查（同仁倫審2021-007-01），所有志愿者均簽署知情同意書。

表1 121名志愿者的一般情況

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集2劑次組接種第1針疫苗前和接種第2針疫苗后7 d靜脈血2 mL；采集3劑次組接種第3針疫苗前（接種第2針后6個月）和接種第3針疫苗后7 d靜脈血2 mL。所有血液樣本均采用乙二胺四乙酸抗凝，離心分離血漿，置于-80℃冰箱保存，統(tǒng)一檢測SARS-CoV-2總抗體（IgG+IgM+IgA）、SARS-CoV-2 IgG抗體、SARS-CoV-2受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）特異性中和抗體。嚴格按實驗室標準操作規(guī)程進行操作。

1.2.2 SARS-CoV-2總抗體、SARS-CoV-2 IgG抗體、SARS-CoV-2 RBD特異性中和抗體的檢測 采用Caris2000全自動化學發(fā)光儀（廈門萬泰公司）及配套試劑（化學發(fā)光微粒子免疫分析法）檢測血漿SARS-CoV-2 IgG抗體和SARSCoV-2總抗體，以S/CO值≥1.0 COI判定為陽性。采用Lumigenex時間分辨熒光免疫分析儀[光景生物科技（蘇州）有限公司]及配套試劑（時間分辨熒光免疫分析法）檢測SARS-CoV-2 RBD特異性中和抗體，基本原理：結(jié)合墊中含有標記的SARS-CoV-2棘突（spike，S）蛋白RBD抗原，標記的RBD蛋白可與固定在測試線（T線）上的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受體結(jié)合。當樣本中含有中和抗體時，樣本中的中和抗體競爭性和RBD蛋白結(jié)合，可降低RBD與ACE2的結(jié)合效率，T線信號顯著下降，質(zhì)控線（C線）信號不變。人體內(nèi)產(chǎn)生的中和抗體含量越多，T/C值越小。

1.2.3 淋巴細胞亞群檢測 采用FACSCanto Ⅱ流式細胞儀（美國BD公司）及配套試劑（CD19-FITC、CD45-APC、CD3-FITC、CD4-BV510、CD8-Percp、CD16CD56-PE、CXCR5-BV421、ICOS-PE）檢測CD3+T細胞、CD3+CD4+輔助性T細胞、CD3+CD8+細胞毒性T細胞、CD19+B細胞、CD16+CD56+自然殺傷（natural killer，NK）細胞的百分比和絕對值，以及CD4+CXCR5+ICOS+濾泡輔助性T細胞（T follicular helper cell，Tfh）百分比。對于Tfh細胞的圈門，首先圈出FSC-SSC中的淋巴細胞群，然后圈出SSC-CD3+細胞，分別設(shè)門于CD3+CD4+細胞、CD4+CXCR5+細胞、CD4+CXCR5+ICOS+細胞。

1.2.4 血常規(guī)指標及細胞因子檢測 采用BC-6800Plus全血細胞分析儀（深圳邁瑞公司）及配套試劑檢測血常規(guī)指標[白細胞（white blood cell，WBC）計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、單核細胞比值、嗜酸性粒細胞比值、嗜堿性粒細胞比值、中性粒細胞絕對值、單核細胞絕對值、嗜酸性粒細胞絕對值、嗜堿性粒細胞絕對值、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白、血小板計數(shù)]。采用多重微球流式免疫熒光發(fā)光法檢測白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12P70、IL-17、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factoralpha，TNF-α）、α-干擾素（interferon alpha，IFN-α）、γ-干擾素（interferon gamma，IFN-γ），試劑購自青島瑞斯凱爾生物科技有限公司，檢測儀器為BriCyte E6流式細胞儀（深圳邁瑞公司）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用 GraphPad Prism 8.0.1軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2劑次組SARS-CoV-2總抗體和IgG抗體檢測結(jié)果

2劑次組配對的61名受試者中有57名在第2針疫苗接種后7 d檢出SARS-CoV-2總抗體和IgG抗體，抗體產(chǎn)生的有效率均為93.44%（57/61）。2劑次組SARS-CoV-2總抗體檢出值為0.09～590.24 COI，均值為（136.5±19.2）COI；IgG抗體檢出值為0.01～21.29 COI，均值為（11.1±0.8）COI。男性、女性SARS-CoV-2總抗體分別為（139.5±27.1）、（134.7±26.0）COI；I g G抗體檢出值分別為（11.3±1.3）、（11.1±0.9）COI；不同性別之間SARSCoV-2總抗體和IgG抗體差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。2劑次組接種第2針疫苗后7 d SARSCoV-2總抗體和IgG抗體的產(chǎn)生情況見圖1。

圖1 2劑次組接種第2針疫苗后7 d SARS-CoV-2總抗體和IgG抗體的產(chǎn)生情況

2.2 2劑次組SARS-CoV-2中和抗體檢測結(jié)果

2劑次組中和抗體陽性率為8 1.9 6%（50/61），接種前和接種第2針疫苗后7 d的T/C值分別為2.247±0.072、2.058±0.099，二者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.3 2劑次組接種前與接種第2針后7 d淋巴細胞亞群和細胞因子檢測結(jié)果比較

2劑次組接種前與接種第2針后7 d血常規(guī)指標和CRP均正常。見表2。

表2 2劑次組接種前與接種第2針后7 d血常規(guī)和CRP檢測結(jié)果

2劑次組接種前與接種第2針后7 d的CD3+T細胞、CD3+CD4+輔助性T細胞、CD3+CD8+細胞毒性T細胞、CD19+B細胞、CD16+CD56+NK細胞百分比和絕對值及IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-α、IFN-γ、TNF-α水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），接種第2針后7 d的Tfh百分比（11.4%）顯著高于接種前（3.92%）（P＜0.01），結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 2劑次組接種前與接種第2針后7 d淋巴細胞亞群和細胞因子檢測結(jié)果比較

圖3 2劑次組接種前與接種第2針后7 d Tfh檢測結(jié)果比較

2.4 3劑次組第3針疫苗接種前后各項指標檢測結(jié)果比較

3劑次組第3針疫苗接種前SARS-CoV-2總抗體、IgG抗體和中和抗體（T/C值）分別為（18.52±5.20）COI、（2.66±0.40）COI、2.30±0.05；第3針疫苗接種后7 d分別為（490.74±83.20）COI、（8.87±0.90）COI、1.87±0.05；SARS-CoV-2總抗體、IgG抗體的陽性率分別為100%（30/30）、93.33%（28/30）。3劑次組第3針疫苗接種前、后SARS-CoV-2各項抗體差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見圖4。

圖4 3劑次組第3針疫苗接種前后各項抗體檢測結(jié)果的比較

3劑次組第3針疫苗接種前、后CD3+T細胞、CD3+CD4+輔助T細胞、CD3+CD8+細胞毒性T細胞、CD19+B細胞、CD16+CD56+NK細胞百分比和絕對值及IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-α、IFN-γ、TNF-α水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 3劑次組第3針疫苗接種前后淋巴細胞亞群及細胞因子檢測結(jié)果比較

3 討論

COVID-19傳染性強，早期癥狀不典型，且無可用于治療的特效藥物[3-4]，因此目前防控COVID-19疫情最有效的方法就是接種疫苗。本研究志愿者接種的疫苗為北京生物制品研究所生產(chǎn)的新型冠狀病毒滅活疫苗。滅活疫苗與減毒活疫苗相比，采用的是非復(fù)制性抗原（死疫苗），其安全性好，但免疫原性較弱，因此必須加強免疫。

本研究共入組121名志愿者，年齡為20～59歲。由于最初采用的是2劑次免疫，因此本研究中2劑次組受試者完全配對。后根據(jù)防疫政策，改為接種加強針，因時間跨度比較大，3劑次組不能做到嚴格配對，第3針疫苗接種前和第3針疫苗接種后7 d各入組30名志愿者。本研究結(jié)果顯示，2劑次組男性、女性之間SARS-CoV-2總抗體及IgG抗體差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。有學者對COVID-19恢復(fù)期血漿捐獻者做過評估，發(fā)現(xiàn)男性的抗體水平高于女性，較年長者的抗體水平高于較年輕者[5]。本研究結(jié)果與文獻報道[5]不一致，提示疫苗接種后的體液免疫狀況與真實感染后的免疫狀況有所不同。疫苗接種后抗體產(chǎn)生的年齡段差異及性別差異，以及抗體持續(xù)時間需進一步擴大樣本量后深入分析。

本研究結(jié)果顯示，2劑次組第2針疫苗接種后7 d總抗體、IgG抗體產(chǎn)生的有效率均為93.44%（57/61），3劑次組第3針疫苗接種后7 d SARS-CoV-2總抗體、IgG抗體的陽性率分別為100.00%、93.33%，提示接種SARS-CoV-2疫苗后，人體體液免疫被激活。本研究結(jié)果還顯示，在第3針疫苗接種前SARS-CoV-2總抗體和IgG抗體水平顯著降低，第3針疫苗接種后7 d SARS-CoV-2總抗體和IgG抗體水平顯著升高。說明加強針疫苗刺激了接種者體內(nèi)原有的記憶B細胞、記憶T細胞快速產(chǎn)生大量抗體，提示按免疫程序接種2針疫苗后，再次接種疫苗加強針是非常有必要的。

SARS-CoV-2可通過S蛋白結(jié)合ACE2進入人體細胞進行復(fù)制并誘導(dǎo)膜融合[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，與SARS-CoV-2 S蛋白受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體可防止病毒附著于宿主細胞并中和病毒[7]，功能性中和抗體的生成具有保護作用[8]。本研究結(jié)果顯示，2劑次組SARS-CoV-2 RBD中和抗體的陽性率為81.96%。3劑次組中和抗體接種前T/C值為2.30±0.05，接種后為1.87±0.05，其接種前、后的T/C值差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。提示接種SARS-CoV-2滅活疫苗后人體能產(chǎn)生有效的中和抗體。本研究2劑次組中和抗體陽性率低于同一疫苗在國外Ⅲ期臨床試驗的數(shù)據(jù)（中和抗體陽性率為99.52%）[9-10]，原因可能與本研究入組例數(shù)較少以及采血時間點不同有關(guān)。

從人體防御機制上看，病毒會被抗原呈遞細胞攝入，呈遞給輔助性T細胞，進而激活B細胞，產(chǎn)生抗體[11]。Tfh的主要功能是參與B細胞分化過程中的信息傳遞，協(xié)助激活B細胞，促進生發(fā)中心的形成和免疫球蛋白類別的轉(zhuǎn)換，維持長時間的體液免疫應(yīng)答。Tfh對免疫系統(tǒng)的建立以及功能的完善非常重要，特別是針對感染性疾病的體液免疫起決定性調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，2劑次組接種第2針疫苗后7 d的Tfh百分比（11.4%）顯著高于接種前（3.92%）（P＜0.01）。提示接種SARS-CoV-2滅活疫苗后機體產(chǎn)生了有效的細胞免疫應(yīng)答。后續(xù)將對疫苗接種后的細胞免疫應(yīng)答進行跟蹤和評價，分析Tfh及其他細胞亞群與疫苗接種后免疫力維持之間的關(guān)系，全面探討疫苗接種對人體各種免疫功能狀態(tài)的影響。

機體對抗外來感染是一系列免疫相關(guān)功能表達的綜合作用，COVID-19重癥患者可因細胞因子的大量釋放而導(dǎo)致細胞因子風暴。細胞因子風暴是病毒性肺炎患者已知的死因之一[12]。石玉玲等[13]的研究結(jié)果顯示，有多種炎癥指標，如CRP、IL-6、IL-8的水平變化與COVID-19關(guān)系密切。COVID-19患者在疾病的發(fā)生、發(fā)展中，IL-6和CRP均高于參考區(qū)間上限，并處于持續(xù)升高狀態(tài)，CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞數(shù)量顯著下降，并隨著患者病情的好轉(zhuǎn)而逐漸恢復(fù)[14]。本研究結(jié)果顯示，2劑次組接種前與接種第2針后7 d、3劑次組第3針疫苗接種前與接種后7 d的12種細胞因子（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-α、IFN-γ、TNF-α）水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。提示接種SARS-CoV-2滅活疫苗不會對人體免疫功能造成影響。

綜上所述，接種SARS-CoV-2滅活疫苗后機體可產(chǎn)生中和抗體和反應(yīng)性抗體，且不會影響人體免疫功能。后續(xù)研究將進一步探討邊緣區(qū)B細胞對調(diào)控SARS-CoV-2 S蛋白的免疫記憶機制，為COVID-19的早診早治提供實驗室依據(jù)。