宋曄娜 俞程程 陳宇珂

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，據(jù)估計每年約有100萬新發(fā)病例，并有大約20萬人死于膀胱癌[1]。膀胱分為肌層浸潤性和非肌層浸潤性，20%～25%的患者在首診時即被確定為肌層浸潤性膀胱癌。肌層浸潤性膀胱癌是患者死亡的主要原因，其長期生存率不理想，遠處轉移風險較高[2]。肌層浸潤性膀胱癌預后不良可能歸因于對膀胱癌的分子特征和生物學機制認識不足。因此，尋找可靠的預測預后的生物標志物加以提前干預，對預測臨床預后、指導治療具有重要意義。細胞凋亡是由基因控制的有序生理過程，細胞內各組分在這一過程中相互協(xié)調，在維持機體內環(huán)境穩(wěn)定方面起重要作用，在細胞代謝過程中，一旦細胞凋亡失衡，將會導致許多疾病。細胞凋亡是一種由基因調控的細胞程序性死亡，研究表明細胞凋亡在各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但是其與膀胱癌的關系卻并未得到研究[3]。文章旨在明確膀胱癌細胞凋亡相關基因的表達，以更好地了解膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展機制。

1 資料與方法

1.1 基因表達與差異表達基因分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站下載膀胱癌樣本的轉錄組RNA測序數(shù)據(jù)，包括患者年齡、性別、病理分級、臨床分期、病理TNM（tumor node metastasis）分期、總生存時間等臨床信息。抗生素耐藥基因（antibiotic resistance genes，ARGs）集從基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）下載，其中包括163個通過胱天蛋白酶激活而定義凋亡的基因。使用R軟件的limma軟件包，在轉錄數(shù)據(jù)中進行了膀胱癌和非腫瘤樣品之間的差異表達基因（DEGs，differentially expressed genes）。然后在匹配DEG之后鑒定差異表達的ARG。

1.2 ARGs的鑒定及預測模型的建立

通過單因素Cox回歸分析確定與OS顯著相關的ARGs（P＜0.05）。通過多因素Cox回歸分析最終確定與OS相關的ARG（P＜0.05）。以多變量Cox回歸為基礎，采用glmnet軟件包，應用OS相關的ARGs建立預后模型。每位患者的ARGs風險評分計算如下：風險評分=[（系數(shù)mRNA1）×（mRNA1的表達）]+[（系數(shù)mRNA2）×（mRNA2的表達）]+……+[（系數(shù)mRNAn）×（mRNAn的表達）]。根據(jù)中位風險評分將所有膀胱癌患者分為高風險組和低風險組，通過生存ROC程序包進行ROC分析，并用AUC評估其判別力。

1.3 AGRs預后模型與其他臨床病理特征的獨立性

為了確定該預后模型是否在其他臨床特征中有意義，將癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)集中的所有臨床病理特征，包括年齡、性別、病理分級、臨床分期、病理TNM分期，分為兩組?；颊叻譃椋耗挲g≤65歲、年齡＞65歲；女性、男性；病理等級高、等級低；Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期；病理性T1/2、T3/4；病理性N0、N1。Kaplan-Meier分析用于評估每個亞組中高危組和低危組之間的總生存時間（overall survival，OS）差異。

1.4 預后相關的ARG的臨床應用

通過R軟件包“ggpubr”分析與預后相關的ARGs與臨床病理特征（包括年齡、性別、病理等級、臨床分期、病理TNM分期）的相關性。將所有具有臨床病理特征的患者分為兩組，分別為年齡≤65歲和年齡＞65歲的亞組，女性和男性亞組，病理分級的高和低亞組，臨床Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ期亞組，病理T1/2和T3/4組，病理N0和N1/2/3組。通過R軟件通過Wilcox檢驗比較每個亞組之間的差異表達。

1.5 觀察指標

觀察研究病例患者的性別、年齡、腫瘤分期、腫瘤分級、淋巴結以及遠處轉移等臨床病理特征，比較膀胱癌組織與非腫瘤組織之間差異表達的ARG，篩選差異基因。

1.6 統(tǒng)計學處理

所有統(tǒng)計均使用R 3.6.1和GraphPad Prism 7（San Diego，CA，USA）進行。計量資料表示為（±s），計數(shù)資料以n（%）表示。通過R軟件的Wilcox檢驗比較組之間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)集中的409例膀胱癌患者的臨床病理特征

在筆者的研究中，TCGA數(shù)據(jù)集中共有409例膀胱癌患者，其中106例女性和303例男性患者。他們的病理階段從Ⅰ期到Ⅳ期不等。T分期從1～4，N分期從0～3，M分期從0～1。見表1。

表1 TCGA數(shù)據(jù)集中膀胱癌癥患者的臨床病理特征

2.2 膀胱癌組織與非腫瘤組織之間差異表達的ARG

本研究共納入409例具有RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床隨訪信息的原發(fā)性膀胱癌患者。膀胱癌與非腫瘤組織之間存在4 880個DEG，見表2）。與163個AGR匹配后，膀胱癌與非腫瘤組織之間存在40個AGR，包括21個下調基因和19個上調基因，見圖1a。然后，將火山圖可視化以顯示PCa與非腫瘤組織之間差異表達的ARGs的表達模式，見圖1b。

圖1 在膀胱癌和非腫瘤組織中不同表達的ARGs

2.3 與預后相關的五個ARG 單變量

Cox回歸分析中共有9個ARG與OS顯著相關，多變量Cox回歸分析中有5個ARG，它們分別是AIFM3、CASP6、EMP1、GSN、TAP1，見表2。

表2 ARGs相關OS的單變量和多變量Cox回歸分析

2.4 ARGs相關的預后模型構建和驗證

Kaplan-Meier生存曲線表明，低危組的死亡率低于高危組（P＜0.001），見圖2a。與OS相關的預測基因的ROC曲線如圖所示。圖2b中的AUC為0.686，風險評分的分布，OS狀態(tài)和預后性5種ARG的熱圖如圖2c所示。高危組的患者預后較差，而低危組的患者預后較好。

圖2 KM生存分析、TCGA-BC數(shù)據(jù)集中的時間依賴性ROC曲線和預后相關ARG的風險評分評估

2.5 與預后相關的ARGs模型與其他臨床病理特征的獨立性

圖3顯示了根據(jù)預后相關ARGs按臨床特征分層的亞組的KM生存結果。與其他臨床病理特征無關，低風險組的預后要好于高風險組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 臨床分層亞組的K-M生存分析

3 討論

在癌變過程中正常細胞轉化為惡性細胞，避免細胞死亡是導致這種惡性轉化的重要細胞變化之一。20世紀70年代，Kerr等人將凋亡與潛在惡性細胞的消除、增殖和腫瘤進展聯(lián)系起來[4]。惡性腫瘤細胞逃避凋亡的途徑很多，包括破壞促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間的平衡，破壞死亡受體信號通路等[5-6]。凋亡是一種受基因調控的程序性細胞死亡，研究[6]表明細胞凋亡在各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。然而凋亡相關基因在膀胱患者中的預后價值研究還很有限。因此，筆者嘗試從多個凋亡相關基因構建一個風險評分模型，以提高膀胱癌患者生存率的預測能力。

本研究中筆者結合TCGA和GSEA數(shù)據(jù)庫來篩選膀胱腫瘤和正常組織中差異表達的ARG，并對ARG進行了單變量Cox回歸分析和多元Cox回歸分析，最終筆者篩選了5個ARG（AIFM3、CASP6、EMP1、GSN、TAP1），它們與膀胱癌患者的生存率顯著相關。多項研究表明這些基因在腫瘤發(fā)生中起重要作用。EMP1可用作多種腫瘤的潛在生物標志物，包括卵巢癌、骨肉瘤和乳腺葉狀腫瘤[7-9]。EMPs家族的成員包括EMP1，EMP2和EMP3，EMP1也被稱為CL-40或腫瘤相關膜蛋白（tumor-associated membrane protein，TMP）。研究表明[10]EMP1參與細胞黏附、增殖和分化，在腫瘤形成和轉移中起著至關重要的作用。一些研究[7-9]表明EMP1可能是包括卵巢癌等多種腫瘤的潛在生物標志物。Miao等[11]發(fā)現(xiàn)，在膠質母細胞瘤中，高表達的EMP1通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)EMP1在骨肉瘤組織中表達上調，并且與淋巴轉移和遠處轉移密切相關，它可通過IRX2/MMP9軸刺激骨肉瘤的惡性進展。Singh等[12]發(fā)現(xiàn)在兒童急性淋巴細胞白血病治療過程中EMP1過度表達，且EMP1的mRNA表達可作為兒童B-ALL患者風險分層的潛在生物標記物。

Caspase是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的家族，在介導細胞程序性死亡和維持細胞內穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。根據(jù)其在凋亡級聯(lián)中的功能，Caspase可分為啟動子（Caspase-2、-8、-9）或 執(zhí) 行 子（Caspase-3、-6、-7）32。Caspase-6（CASP6）表達為一種非活性酶原[13]。已有研究[14]表明，單獨過表達CASP6可促進細胞凋亡和死亡，在人類癌癥基因調查中發(fā)現(xiàn)許多CASP6特異性底物與腫瘤相關。具有代表性的腫瘤相關CASP6底物包括雙鏈斷裂修復蛋白RAD21、腫瘤細胞抗原p53和TP53；乳腺癌1型易感蛋白BRCA1；補充XP-G細胞的DNA修復蛋白ERCC5；DNA錯配修復蛋白MLH1；ras相關蛋白Rab-10、RB10。因此，CASP6與這些已知的腫瘤相關底物之間的串擾表明CASP6可能參與了癌癥的發(fā)生。幾年前，有報道[15]在腫瘤相關組織中進行了初步的CASP6體細胞突變研究，在胃癌和結直腸癌組織中檢測到3個CASP6體細胞突變，表明CASP6在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有一定作用。

凝膠素（glsolin，GSN）是一種肌動蛋白結合蛋白，用于切割和覆蓋肌動蛋白絲，調節(jié)細胞骨架的周轉，在細胞運動中起重要作用。此外，GSN還可以調節(jié)細胞形態(tài)、增殖甚至凋亡，已發(fā)表的數(shù)據(jù)表明[16]GSN在肝癌、結腸癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌等實體腫瘤中下調，表明其對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有調控作用。早期研究發(fā)現(xiàn)TAP1和TAP2在各種癌癥中均下調，其與腫瘤預后有關。TAP1蛋白的過表達被認為是乳腺癌侵襲性的指標，這可能是由于高級別腫瘤下調TAP1的能力較低，或由于在產(chǎn)生IFN-γ的微環(huán)境中較高的免疫浸潤濃度，導致TAP亞基被上調[17]。在大腸癌中，帶有神經(jīng)周圍浸潤的腫瘤中TAP1的水平降低，這使得TAP1的下調成為Ⅰ期和Ⅱ期疾病患者的預后因素[18]。在食道癌中，發(fā)現(xiàn)癌癥組織中TAP1蛋白的上調是不利的預后因素[19]。

為了確定這些特異性基因是否可作為膀胱癌預后因子，筆者構建了一個基于5個基因的的預測模型。單因素和多元Cox回歸分析結果表明，筆者發(fā)現(xiàn)了一種新的分子生物學標志物和凋亡相關危險信號，可用于準確預測膀胱癌患者的臨床預后。筆者用K-M分析驗證了這一點，并觀察到高危分患者的生存率明顯較差。這些結果表明，五基因風險評估法具有較高的預后評估價值，不僅是預測膀胱癌患者預后的一種新方法，而且有助于臨床醫(yī)師制定個性化的治療方案。