熱孜亞·吐爾遜，鄭 勇，阿麗亞·外力，特列吾·哈杰提，黃晶晶，瑪依拉·買蘇提，依麗米努爾·艾力，艾斯凱爾·玉蘇普，旭格拉·哈布丁

(新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆特殊環(huán)境物種多樣性應(yīng)用與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沙漠藻研究院，新疆 烏魯木齊 830054)

鹽生植物根際存在大量的耐鹽、耐堿細(xì)菌，其通過自身代謝物特征與宿主植物互作促進(jìn)植物生長[1-2].根際耐鹽堿細(xì)菌能夠通過耐鹽、耐堿、固氮、溶磷、產(chǎn)鐵載體、分泌吲哚乙酸(IAA)和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶促進(jìn)植物生長發(fā)育，并賦予植物抗鹽、抗堿、抗旱等特性，避免或降低逆境中鹽堿對植物的傷害.基于根際耐鹽堿細(xì)菌促進(jìn)植物生長的特性，研發(fā)高效的微生物肥料以替代化肥與農(nóng)藥，及降低化肥與農(nóng)藥對土壤環(huán)境的污染已成為研究熱點(diǎn)之一[3-6].

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)是具有強(qiáng)根蘗性、抗鹽堿、耐土壤貧瘠的多年生鹽生灌木植物，主要分布于我國西北鹽堿荒漠地區(qū)，兼具重要藥用、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價值[7-8].其果實(shí)含有大量的大分子物質(zhì)和微量元素(Mn、Sr、Se、Zn、Cu等)、葡萄糖、甜菜堿、甾醇類、香豆酸、枸杞多糖等多種成分[9].此外，黑果枸杞具有貯鹽功能，能承受一定濃度的鹽脅迫，在一定含鹽量的土壤環(huán)境中生長發(fā)育，可作為我國改良土壤鹽漬化和保護(hù)生態(tài)環(huán)境的先鋒樹種，具有廣泛的經(jīng)濟(jì)前景與開發(fā)潛力[10-11].近年來，新疆大力推廣種植黑果枸杞，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)種植面積已達(dá)14～18萬畝，是我國主要生產(chǎn)區(qū)，對新疆地區(qū)鹽堿地的生態(tài)建設(shè)、保護(hù)、修復(fù)及改良利用發(fā)揮著推動作用，為當(dāng)?shù)貛砹私?jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)效益[12-13].

植物根際細(xì)菌的數(shù)量分布及促進(jìn)植物生長的特性不僅與植物種類有關(guān)，還與植物所處的環(huán)境和土壤條件密切相關(guān)[14].本研究從新疆鄯善縣黑果枸杞根際分離、篩選耐鹽堿菌株，并初步研究菌株的生物學(xué)特性，以期為研發(fā)適于鹽堿環(huán)境的微生物肥料提供理論依據(jù)和菌種資源.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試土樣

供試土壤在2020年10月采自位于90.386° E、42.867° N、海拔773 m的新疆鄯善縣黑果枸杞根際土壤.共設(shè)5個采樣點(diǎn)，各采樣點(diǎn)選取生長較好的黑果枸杞，去掉樹枝落葉層，小心挖取離地表30 cm深處的根；將根際表面土壤用刷子刷落在無菌白紙上，并混勻5個采樣點(diǎn)土壤，再裝入無菌袋中，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室.

1.1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)磷培養(yǎng)基(g/L)：C6H12O610，Ca3(PO4)210，NaCl 50，KCl 10，MgCl2·6H2O 5，MgSO4·7H2O 0.3，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，MnSO4·7H2O 0.03，瓊脂粉20;pH 7.5.

有機(jī)磷培養(yǎng)基(g/L)：C13H24O410，NaCl 50，C6H12O610，C46H89NO8P 5，牛肉膏3，瓊脂粉20；pH 7.5.

阿須貝無氮培養(yǎng)基(g/L)：C6H14O610，K2HPO40.2，NaCl 50，MgSO4·7H2O 0.2，CaSO4·7H2O 0.5，CaCO35，瓊脂粉20；pH 7.5.

改良ISP2培養(yǎng)基(g/L)：C6H12O64，酵母提取物4，麥芽浸粉5，C13H24O44，NaCl 50，瓊脂粉 20；pH 7.5.

使用King培養(yǎng)基[15]檢測菌株分泌IAA的能力，使用CAS固體培養(yǎng)基和MKB液體培養(yǎng)基[16]測定菌株分泌鐵載體的能力.

1.1.3 主要試劑

基因組DNA提取試劑盒(EasyPure Genomic DNA Kit)、高保真PCR試劑盒(2×High Fidelity PCR SuperMix)等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色液(包括結(jié)晶紫染色液、碘溶液、脫色液、沙黃染色液或復(fù)紅染色液)；氫氧化鉀溶液、鉬酸鈉稀硫酸溶液、磷標(biāo)準(zhǔn)溶液等用于鉬藍(lán)比色法.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 根際土壤理化性質(zhì)測定

供試土樣送至中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所生態(tài)與環(huán)境分析測試中心進(jìn)行pH、總鹽、SO42-、Cl-、Na+、Mg2+、K+、有機(jī)質(zhì)、全氮、水解性磷、有效磷等指標(biāo)的測定.

1.2.2 根際細(xì)菌的分離、純化及保存

采用梯度稀釋涂布培養(yǎng)的方式稀釋所采集的土壤樣品，取稀釋土懸液200 μL涂布于改良ISP2培養(yǎng)基上，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)待菌落長出；將長出來的菌落根據(jù)不同菌落形態(tài)通過平板劃線法分別進(jìn)行分離純化.將純化菌株分別劃線于無機(jī)磷培養(yǎng)基、有機(jī)磷培養(yǎng)基和阿須貝無氮培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，并選取在這3種培養(yǎng)基上都能生長的菌株保存于改良ISP2斜面培養(yǎng)基中，4 ℃保存?zhèn)溆茫?0%(體積分?jǐn)?shù))甘油按體積比1∶1加入培養(yǎng)的菌液中，-80 ℃保存.

1.3 菌種鑒定

1.3.1 菌落形態(tài)特征鑒定

將測試菌株劃線于阿須貝無氮培養(yǎng)基上，長出單菌落后觀察菌落大小、顏色、表面、透明度、邊緣、質(zhì)地等形態(tài)特征.挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體特征.

1.3.2 基于16SrRNA基因序列分子鑒定

采用EasyPure Genomic DNA Kit提取細(xì)菌總DNA.采用2×High Fidelity PCR SuperMix進(jìn)行16SrRNA基因序列擴(kuò)增,擴(kuò)增引物為27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’).PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×High Fidelity PCR SuperMix 25 μL，引物27F(20 μmol/L)1 μL，引物1492R(20 μmol/L)1 μL，基因組DNA 1 μL，用無菌雙蒸水補(bǔ)充至50 μL.PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，33次循環(huán)；72 ℃保溫10 min.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測：取4 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物與1 μL DNA上樣緩沖液混勻，上樣進(jìn)行電泳檢測.根據(jù)電泳檢測結(jié)果將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)股份有限公司測序.將測序結(jié)果提交至NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast序列比對，并分析細(xì)菌多樣性.

1.4 耐鹽、耐堿能力測定

1.4.1 耐鹽能力測定

將待測菌株活化后，按1%接種量將菌株分別接種于50 mL改良ISP2液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，制備波長600 nm處吸光度(A600)為0.5的菌液懸浮液.

定性測定：取5 μL懸浮液，用微量移液槍分別點(diǎn)種于NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，5%，10%，15%，20%，25%的改良ISP2固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)待菌落長出，觀察菌落特征，每組3個平行.

定量測定：按1%接種量將菌株分別接種于NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，5%，10%，15%，20%，25%的50 mL改良ISP2液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，利用分光光度計(jì)測量菌懸液的A600，每組3個平行樣.

1.4.2 耐堿能力測定

定性測定：將菌種取5 μL分別接種于pH為5，6，7，8，9，10，11，12的改良ISP2固體培養(yǎng)基上，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)待菌落長出，觀察菌落特征，每組3個平行樣.

定量測定：按1%接種量將菌株分別接種于pH為5，6，8，9，10，11，12(以NaOH計(jì))的50 mL改良ISP2液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，利用分光光度計(jì)測量菌懸液的A600，每組3個平行樣.

1.4.3 除鹽、除堿能力測定

將待測菌株按1%接種量接種于pH為9、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的改良ISP2液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，在12，24，36，48 h取樣測定.

利用AgNO3溶液滴定法測定菌株除鹽能力：取2 mL 發(fā)酵液，滴加1滴10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鉻酸鉀溶液作為指示劑，用0.1 mol/L AgNO3溶液滴定；邊滴邊搖晃，直至三角瓶中出現(xiàn)磚紅色沉淀且顏色不褪去，即為滴定終點(diǎn)；記錄AgNO3溶液用量，并計(jì)算氯離子濃度，每組3個平行樣.c(Cl)=c(AgNO3)×V1/V2.式中：V1為滴定時消耗AgNO3溶液的體積(mL)；V2為滴定時所取發(fā)酵液的體積，即2 mL.

菌株除鹽效率η1=(c(Cl)max-c(Cl)min)/c(Cl)max×100%，式中，c(Cl)max為培養(yǎng)基中Cl-降解前濃度，c(Cl)min為培養(yǎng)基中Cl-降解后濃度.

利用pH計(jì)測定發(fā)酵液前后pH值，并計(jì)算除堿效率η2：η2=(pHini—pHter)/pHini×100%，式中，pHini為接種前的培養(yǎng)基pH，pHter為反應(yīng)終止時菌株降解后的培養(yǎng)基pH.

1.5 根際細(xì)菌生物活性檢測

1.5.1 阿須貝無氮培養(yǎng)基中生長能力測定

以1%接種量將待測菌株接種于100 mL阿須貝無氮液體培養(yǎng)基，在37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每2 h 取5 mL發(fā)酵液測定(0，2，4，8，10，12，…，72 h)，記錄A600并繪制生長曲線(3個生物學(xué)重復(fù)).

1.5.2 溶磷能力測定

采用打孔法在無機(jī)磷固體培養(yǎng)基中打4個孔，直徑為6 mm，每孔中分別加入50 μL發(fā)酵液(108 cfu/mL，cfu為菌落形成單位)，3個生物學(xué)重復(fù)；在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)15 d后，記錄各菌株的溶磷圈直徑，初步判斷菌株的溶磷能力.

將菌株按1%接種于裝有50 mL無機(jī)磷液體培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，置于37 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)5 d，4 ℃、10 000 r/min離心10 min后取上清液，采用鉬藍(lán)比色法測定上清液中有效磷的含量[17].

1.5.3 分泌IAA能力測定

參考Glickmann等[18]的方法，將菌株按1%接種量接種至裝有3.0 mL King液體培養(yǎng)基的12.0 mL試管中(添加0.5 g/LL-色氨酸)，每組3個生物學(xué)重復(fù).37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，4 ℃、10 000 r/min離心10 min后取50 μL上清液，加入100 μL Sackowcki’s顯色劑，在室溫下避光靜置15～20 min.觀察顏色變化，顏色變紅說明能夠分泌生長素，且顏色越深表示分泌生長素能力越強(qiáng).

取上清液加入等體積顯色液(10.8 mol/L H2SO4、4.5 g/L FeCl3)，混勻避光靜置30 min，測定其在波長540 nm處的吸光度(A540).用0.5～20 μg/mL IAA標(biāo)準(zhǔn)液測定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌液中IAA含量[19].

1.5.4 分泌鐵載體能力測定

在CAS固體培養(yǎng)基中打4個直徑為6 mm的孔，分別加入50 μL菌液，每組3個生物學(xué)重復(fù)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d.若菌落周圍產(chǎn)生橘黃色暈圈，則該菌株能夠分泌鐵載體，且黃色圈的直徑大小與該菌株分泌鐵載體能力大小成正比[20].

1.6 盆栽促生試驗(yàn)

設(shè)計(jì)3個處理，即空白對照(不加NaCl溶液、不接種根際細(xì)菌)、陰性對照(加入300 mmol/L NaCl溶液、不接種根際細(xì)菌)和陽性對照(加入300 mmol/L NaCl溶液、接種根際細(xì)菌)，每組3個生物學(xué)重復(fù).選擇直徑為14 cm的花盆，每盆裝入500 g經(jīng)高溫滅菌的土壤，挑選飽滿度較好、大小基本一致的黑果枸杞種子在70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中表面消毒3 min，用滅菌的蒸餾水沖洗3～5次，在37 ℃水浴鍋中24 h恒溫催芽，每盆中種植5顆種子，放置在12 h光照/12 h黑暗、溫度25 ℃/20 ℃條件下培養(yǎng)14 d后，連續(xù)3次澆灌NaCl溶液，以保持鹽濃度在300 mmol/L.從第4天開始，各菌株在37 ℃、180 r/min振蕩過夜培養(yǎng)，4 ℃、10 000 r/min離心10 min后棄上清，沉淀用無菌水洗滌2次后，用無菌水重懸；調(diào)節(jié)重懸菌液A600=0.50±0.04，取1 mL灌根相應(yīng)盆中的幼苗.同時，陰性對照組和空白對照組用NaCl溶液和無菌水灌根培養(yǎng)，每隔2 d灌根一次.培養(yǎng)60 d后，盆中黑果枸杞連根拔起，用蒸餾水沖洗干凈后擦干稱量，記錄為鮮質(zhì)量(g)；隨后放入干燥箱中75 ℃干燥24 h再稱量，記錄為干質(zhì)量(g).用游標(biāo)卡尺測量其株高(cm)和根長(cm)；另測定葉綠素含量及葉片數(shù)等指標(biāo).

1.7 耐鹽堿根際細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

圖1 黑果枸杞根際3株代表性細(xì)菌的菌落形態(tài)Fig.1 Morphology of three typical bacterial colonies in rhizosphere of L.ruthenicum

根據(jù)基于16SrRNA基因測序的Blast比對結(jié)果，選取所需的參照菌株及其16SrRNA基因序列，采用MEGA7.0軟件通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤理化性質(zhì)

鄯善縣野生黑果枸杞根際土壤理化性質(zhì)測定結(jié)果顯示：根際土壤pH為8.86，總鹽含量為0.838 mg/g，根際土壤有機(jī)質(zhì)含量為2.66 g/kg，總氮含量為0.16 g/kg，速效磷3.37 mg/kg，Na+0.843 mg/g，K+0.043 mg/g，Mg2+0.086 mg/g，Cl-0.990 mg/g，SO42-0.556 mg/g.可見鄯善縣黑果枸杞根際土壤屬于有機(jī)質(zhì)、氮、磷元素嚴(yán)重匱乏，微量元素不平衡的極端鹽堿土壤.

2.2 根際細(xì)菌的篩選

采用4種不同培養(yǎng)基分離鄯善縣黑果枸杞根際土壤樣品，獲得110株根際細(xì)菌.經(jīng)過菌株形態(tài)、顏色、黏稠性及生長大小的不同重排結(jié)果后得到37株根際細(xì)菌，各菌落形態(tài)及菌體特征見附錄(http:∥jxmu.xmu.edu.cn/upload/html/20220516)表S1.圖1(a)與(b)顯示其中3株代表性菌株在固體培養(yǎng)基上及顯微鏡下的革蘭氏染色結(jié)果.

測序得到的16SrRNA基因序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast序列比對發(fā)現(xiàn)，篩選所得的37株根際細(xì)菌分別屬于9個屬，其中芽孢桿菌屬(Bacillus)為優(yōu)勢菌屬(22株)，其次為鏈霉菌屬(Streptomyces，4株)，此外分別為節(jié)桿菌屬(Arthrobacter，2株)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus，2株)、假單胞菌屬(Pseudomonas，2株)、桿菌屬(Bacterium，2株)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus，1株)、葡萄球菌屬(Staphylococcus，1株)、腸桿菌屬(Enterobacter，1株)，與其相似菌B.halotoleransDSM 8802(MN483266)、B.rugosusSPB7(MK453326)、B.subtilissubsp. HUB-I-047(GQ892930)、PriestiamegateriumIAM 13418(AF311995)、B.paramycoidesMCCC 1A04098(KJ812444)、P.putidaATCC12633(JN630890)等菌株的相似度為99%或100%.

2.3 根際細(xì)菌的耐鹽、耐堿及除鹽、除堿能力

2.3.1 耐鹽、耐堿能力

37株根際細(xì)菌分別在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～25%的改良ISP2液體培養(yǎng)基和pH為5～12的改良ISP2液體培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)，結(jié)果顯示(圖2)：其中10株根際細(xì)菌兼有較好的耐鹽及耐堿能力，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～20%和pH為5～11的液體培養(yǎng)基中均能生長，其生長最適NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，最適pH為7，其中菌株HQA8、HQA9、HQX34和HQX56耐鹽、耐堿的綜合能力最好.

圖2 10株根際細(xì)菌的耐鹽(a)和耐堿(b)能力Fig.2 Salt tolerance (a) and alkali tolerance (b) abilities of 10 rhizosphere bacteria

2.3.2 除鹽、除堿能力

根據(jù)耐鹽、耐堿能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將上述10株根際細(xì)菌分別在pH為9、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的改良ISP2液體培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)，結(jié)果顯示(圖3)：10株根際細(xì)菌培養(yǎng)至36 h時除鹽、除堿效率最高，其中菌株HQA8的除鹽、除堿效率分別達(dá)到最高值75%和46%.

圖3 10株根際細(xì)菌的除鹽(a)和除堿(b)能力Fig.3 Desalination (a) and alkali removal (b) abilities of 10 rhizosphere bacteria

2.4 根際細(xì)菌的生物活性

2.4.1 根際細(xì)菌在阿須貝無氮培養(yǎng)基中的生長曲線

10株根際耐鹽堿細(xì)菌在阿須貝無氮液體培養(yǎng)基中的生長情況如圖4所示：在6 h左右進(jìn)入對數(shù)生長期，26 h左右對數(shù)生長期達(dá)到最高值，30 h左右進(jìn)入生長平臺期，32～46 h生長曲線略有下降趨勢，46 h左右進(jìn)入生長衰竭期.可見這10株菌株在阿須貝無氮培養(yǎng)基中對數(shù)生長期和平臺期時間較長，表明其具有一定的固氮能力.

圖4 10株根際細(xì)菌在無氮培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.4 Growth curves of 10 rhizosphere bacteria in nitrogen-free medium

2.4.2 溶磷能力

10株耐鹽堿根際細(xì)菌在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后進(jìn)行溶磷能力測定，結(jié)果顯示：10株根際細(xì)菌產(chǎn)生大小不同的溶磷圈，溶磷圈直徑為8.5～23.6 mm，其中菌株HQA2的溶磷圈直徑最大，達(dá)23.6 mm(圖5(a)).進(jìn)而將10株根際細(xì)菌在無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，結(jié)果顯示：10株根際細(xì)菌的溶磷量為28.20～52.63 mg/L，其中HQA2的溶磷量最大，達(dá)52.63 mg/L，與產(chǎn)溶磷圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；同時，無機(jī)磷液體培養(yǎng)基的pH值由初始的9降低至4.82～5.55(圖5(b)).

圖5 10株根際細(xì)菌溶磷圈直徑(a)及溶磷量和培養(yǎng)基的pH值(b)Fig.5 Diameters of phosphate solubilizing zones of 10 rhizosphere bacteria (a), and their phosphorus solubilization amount and pH value of culture medium (b)

2.4.3 分泌IAA能力

對上述10株根際細(xì)菌在培養(yǎng)48，60，72 h的產(chǎn)IAA能力進(jìn)行測定，結(jié)果顯示：10株根際細(xì)菌均具有大小不同的產(chǎn)IAA能力，其中菌株HQA2產(chǎn)IAA能力最強(qiáng)，在60 h達(dá)到最大值54.21 mg/L(圖6).

圖6 10株根際細(xì)菌在不同時間的IAA產(chǎn)量Fig.6 IAA production of 10 rhizosphere bacteria at different time

2.4.4 分泌鐵載體能力

進(jìn)一步對上述10株根際細(xì)菌進(jìn)行產(chǎn)鐵載體能力測定，結(jié)果顯示：各菌株在CAS固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生大小不同的黃色暈圈，可以初步判斷這10株根際細(xì)菌均具有產(chǎn)鐵載體的能力，其中菌株HQA2周圍所產(chǎn)生的黃色暈圈直徑最大，為37.25 mm(圖7).

圖7 10株根際細(xì)菌在CAS固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生的黃色暈圈直徑Fig.7 Diameters of surrounding yellow circles produced by 10 rhizosphere bacteria on CAS solid medium

采用CAS檢測方法[20]測定各菌株A/Ar的值(A表示CAS液體培養(yǎng)基的吸光度,Ar表示菌液吸光度,A/Ar表示鐵載體的相對含量，其值越大表示鐵載體相對含量越低).結(jié)果如表1所示：HQK4的A/Ar值最大，約1.98；HQA2的A/Ar值最小，約0.62.

2.5 鹽脅迫下接種根際細(xì)菌對黑果枸杞幼苗生長的影響

基于以上10株根際細(xì)菌的耐鹽、耐堿、除鹽、除堿能力以及溶磷能力、產(chǎn)IAA能力和產(chǎn)鐵載體能力的分析結(jié)果進(jìn)行盆栽試驗(yàn).結(jié)果顯示:與空白對照組相比,陰性對照組的黑果枸杞幼苗生長受到嚴(yán)重抑制，鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、株高、葉片數(shù)和葉綠素含量較空白對照組分別減少69.4%，86.2%，42.4%，28.5%和32.7%.分別用10株耐鹽堿根際細(xì)菌處理植株，與陰性對照組相比，各根際細(xì)菌對黑果枸杞幼苗生長有不同程度的促進(jìn)作用，其中菌株HQA8處理的黑果枸杞幼苗各項(xiàng)指標(biāo)與陰性對照組相比促進(jìn)作用最明顯，鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、株高、葉片數(shù)和葉綠素含量較陰性對照組分別增加300.0%，725.0%，54.6%，44.8%和49.3%(表2).

表1 10株根際細(xì)菌產(chǎn)鐵載體量Tab.1 Iron carrier production of 10 rhizosphere bacteria

2.6 根際耐鹽堿菌株鑒定

將測序所得16SrRNA基團(tuán)序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast序列比對，并將序列提交GenBank，獲得10株根際耐鹽堿細(xì)菌的登錄號.構(gòu)建菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果顯示：菌株HQA9、HQA4與B.halotoleransDSM 8802(MN483266)，菌株HQA2、HQK4、HQY5、HQX56與B.rugosusSPB7(MK453326)，菌株HQA8與B.subtilissubsp. HUB-I-047(GQ892930)，菌株HQA14與P.megateriumIAM 13418(AF311995)，菌株HQX34與B.paramycoidesMCCC 1A04098(KJ812444)，菌株HQY4與P.putidaATCC 12633(JN630890)的序列具有最高同源性(圖8).

表2 不同根際細(xì)菌處理對黑果枸杞幼苗生長的影響Tab.2 Effects of different rhizosphere bacterial treatments on the growth of L.ruthenicum seedlings

圖8 基于10株根際耐鹽堿細(xì)菌16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of 10 rhizosphere saline alkali tolerant bacteria

3 討 論

土壤鹽堿化是世界上最嚴(yán)重的環(huán)境問題之一.我國的鹽堿化土壤主要分布在我國西北干旱半干旱的甘肅、新疆等地區(qū)，尤其是新疆受不同程度鹽堿危害的耕地面積約占新疆耕地總面積的1/3[21].土壤鹽堿化造成的植物營養(yǎng)不足、微量元素極度缺乏等會抑制植物的正常生長.通過文獻(xiàn)與實(shí)地調(diào)研了解到，新疆吐魯番地區(qū)鄯善縣黑果枸杞種植基地為干燥、高溫、多風(fēng)、年均降水量低、蒸發(fā)強(qiáng)烈、水資源和土壤營養(yǎng)元素匱乏的極端鹽堿內(nèi)陸荒漠區(qū)[22-23].對新疆鄯善縣根際土壤理化性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該土壤的pH值和鹽含量偏高，屬于有機(jī)質(zhì)及氮、磷元素嚴(yán)重匱乏，微量元素不平衡的極端鹽堿地，因此確保黑果枸杞生產(chǎn)穩(wěn)定的重要措施之一就是合理施肥種植技術(shù).然而，施用大量的化肥會造成土壤養(yǎng)分流失、水土失衡、土壤板結(jié)、鹽堿化程度加深、土壤源污染等生態(tài)問題；而微生物肥料的出現(xiàn)則降低了化學(xué)肥料使用量，有利于保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境.

微生物群落多樣性和組成在不同生境的差異性與土壤理化性質(zhì)密切相關(guān)，不同生境下根際微生物群落有所不同[24].劉國強(qiáng)等[25]對新疆阿克陶縣黑果枸杞根際促生菌的篩選及促生能力分析研究表明，鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬、微桿菌屬(Microbacteriumsp.)為阿克陶縣黑果枸杞根際微生物中的優(yōu)勢屬.李巖等[26]對新疆精河縣、烏蘇市、路旁荒地和五家渠等不同生境下黑果枸杞根際與非根際土壤微生物群落多樣性的研究報道中，已驗(yàn)證Haliea、Pelagibius、Microbulbifer、Acidobacteria Gp10、假單胞菌屬等是北疆地區(qū)黑果枸杞根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢屬.張春林等[27]在寒旱區(qū)對檸條(Caraganakorshinskii)根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的研究發(fā)現(xiàn)：3個不同地區(qū)優(yōu)勢菌種的豐度存在較大差異，同地區(qū)不同取樣點(diǎn)微生物分布具有更多相似性；不同地區(qū)間烏蘭察布和赤峰間的微生物組成相對更接近，表明檸條根際微生物結(jié)構(gòu)在同一地域具有一定的穩(wěn)定性和均勻性，而隨著地域不同顯示出一定差異性，這可能與土質(zhì)、氣候條件等有關(guān).本研究從黑果枸杞根際土壤中分離與純化具有耐鹽、耐堿以及除鹽、除堿能力的微生物，并進(jìn)行各種生物活性的測定，為改良根際土壤微生物生態(tài)環(huán)境、開發(fā)天然無害微生物肥料、提高植物脅迫耐受性等問題提供了理論依據(jù).

本研究從生長在新疆鄯善縣鹽堿區(qū)的黑果枸杞根際土壤中篩選出110株根際微生物，根據(jù)菌落形態(tài)和生長特性選擇37株進(jìn)行16SrRNA基因序列比對，發(fā)現(xiàn)共9個屬的25種，其中芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬；對這37株菌進(jìn)行耐鹽、耐堿及除鹽、除堿能力的測定并篩選，其結(jié)果顯示菌株HQA2、HQA4、HQA8、HQA9、HQA14、HQY4、HQY5、HQK4、HQX34和HQX56具有較好的耐鹽、耐堿能力，這一結(jié)果與宋郭柳等[28]篩選所得耐鹽菌的耐鹽能力結(jié)果相似.本研究篩選的10株根際細(xì)菌在不同時間階段除鹽、除堿能力不同，培養(yǎng)至36 h時菌株HQA8的除鹽、除堿率達(dá)最高值，分別為75%和46%；而趙媛等[29]從青海湖分離的耐鹽微生物除鹽效率最高達(dá)17.30%，除堿效率最高達(dá)7.60%.進(jìn)一步研究生物活性測定發(fā)現(xiàn)，10株根際耐鹽堿菌均能在阿須貝無氮培養(yǎng)基中生長，這一結(jié)果與靳海洋等[30]關(guān)于稻田土壤固氮菌的分離篩選以及促生潛力研究的報道一致.此外，這10株耐鹽堿根際細(xì)菌均有不同大小的溶磷、產(chǎn)IAA和產(chǎn)鐵載體等能力.Patel等[31]在鹽堿環(huán)境中篩選的15株溶磷菌的最大溶磷量為45 mg/L，劉國強(qiáng)等[25]在新疆阿克陶縣鹽堿土壤中篩選的根際促生菌的最大溶磷量為49.97 mg/L，本研究篩選得到的10株根際細(xì)菌的溶磷量為28.20～52.63 mg/L，同時無機(jī)磷液體培養(yǎng)基的pH值由初始的9降低到4.82～5.55，可以初步判斷這些菌株既能提高土壤肥力又能降低土壤堿性環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)鹽堿化土壤的生物改良.

菌株HQA2在60 h時產(chǎn)IAA含量達(dá)到最高值54.21 mg/L，且隨后10株根際細(xì)菌產(chǎn)IAA能力總體開始減弱，可能是由于后期營養(yǎng)不足所致；參考Datta等[32]的研究報道，也可能是由于在一定時間段內(nèi)IAA降解酶(如IAA氧化酶和過氧化物酶)的釋放使產(chǎn)生的IAA被降解所致.土壤根際微生物所產(chǎn)生的鐵載體可以抑制有害病原菌并促進(jìn)植物生長[33].本研究中10株根際細(xì)菌都有不同大小的產(chǎn)鐵載體的能力，提示這些菌株可能具備抑制病原菌的特性.

盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，施用10株耐鹽堿根際細(xì)菌對黑果枸杞幼苗生長有明顯的促進(jìn)作用，其中菌株HQA8處理下各項(xiàng)指標(biāo)與陰性對照相比增加幅度最大.葉綠素含量的增加可以間接促進(jìn)植物的光合作用，Nadeem等[34]證實(shí)在鹽脅迫下根際促生菌處理植物可以使葉綠素含量增加，而且大幅度提高了植物的光合作用效率.在鹽脅迫下，這10株耐鹽堿根際細(xì)菌可以有效地緩解鹽害對黑果枸杞幼苗生長的抑制.

綜上，本研究篩選得到10株黑果枸杞耐鹽堿根際細(xì)菌，并測定了這些菌株的除鹽、除堿、固氮、溶磷、分泌IAA以及分泌鐵載體等生物特性，最后對其綜合能力給予評價：其中菌株HQA8、HQA9、HQX56、HQX34和HQA2有較高的促進(jìn)植物生長的潛力，其次為HQA14、HQY4、HQY5、HQA4和HQK4.這些結(jié)果可為生物菌肥開發(fā)提供優(yōu)良菌株，為改良土壤極端環(huán)境和擴(kuò)大適用范圍提供理論依據(jù).