任晉東，陳紅林，牛寶龍，詹煒，樓寶

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究所，浙江 杭州 310021）

羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）是長(zhǎng)臂蝦科、沼蝦屬動(dòng)物，具有生長(zhǎng)速度快、養(yǎng)殖存活率高、抗病力強(qiáng)和廣泛的環(huán)境適應(yīng)性等特點(diǎn)。原產(chǎn)于印度太平洋地區(qū)，生活在各種類(lèi)型的淡水或咸淡水水域。20世紀(jì)60年代以來(lái)，先后移養(yǎng)于亞洲、歐洲、美洲等一些國(guó)家和地區(qū)，是全世界養(yǎng)殖量最大的淡水養(yǎng)殖蝦類(lèi)品種。1976年自日本引進(jìn)我國(guó)，主要在南方10多個(gè)?。ㄊ小^(qū)）推廣養(yǎng)殖，是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖蝦類(lèi)引進(jìn)品種。2020年，我國(guó)羅氏沼蝦產(chǎn)量達(dá)14萬(wàn)t，超全球羅氏沼蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量的一半以上，且連續(xù)20年位列世界第一，但與以色列等國(guó)相比，我國(guó)每667 m均產(chǎn)仍相差100 kg以上。與其他甲殼類(lèi)動(dòng)物類(lèi)似，羅氏沼蝦也具有性別兩態(tài)性，同齡雌、雄蝦個(gè)體的大小、生長(zhǎng)速度懸殊，單性化培育可提高我國(guó)羅氏沼蝦單產(chǎn)，但關(guān)于羅氏沼蝦個(gè)體消化發(fā)育、性別分化的分子機(jī)制尚不清楚。

目前，已有研究表明，組織和性別特異性基因是組織細(xì)胞分化、性別發(fā)育成熟的關(guān)鍵調(diào)控因子和標(biāo)記分子。組織特異性基因在調(diào)控生物體器官再生、胚胎發(fā)育方面也有著重要的作用，其表達(dá)翻譯也是組織器官發(fā)育成熟的標(biāo)志及指示工具，在研究個(gè)體發(fā)育、胚胎發(fā)育過(guò)程中有著重要的作用，Wang等研究發(fā)現(xiàn)，組織特異性基因在南美白對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）的免疫防御中也有著重要作用。性別特異性表達(dá)基因在生物性別發(fā)育分化、性別特異性表型形成、性別轉(zhuǎn)化等過(guò)程中均有重要作用，目前關(guān)于甲殼類(lèi)生物中老虎蝦、南美白對(duì)蝦的組織特異性遺傳標(biāo)記均有報(bào)道，但在羅氏沼蝦器官組織和性別特異性基因挖掘方面，還未見(jiàn)報(bào)道。

現(xiàn)有研究表明，羅氏沼蝦的眼柄、精巢、促雄性腺和卵巢等器官組織參與性別發(fā)育分化，而肝胰腺是羅氏沼蝦體內(nèi)分化形成的最大消化腺體組織?，F(xiàn)以羅氏沼蝦的眼柄、肝胰腺、精巢、卵巢和促雄性腺體各器官組織為研究對(duì)象，通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用組織特異性參數(shù)（τ），挖掘羅氏沼蝦各器官組織和性別差異表達(dá)基因，并進(jìn)行功能分析，探明其作為組織和性別發(fā)育成熟標(biāo)記（Marker）的潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集的性成熟羅氏沼蝦來(lái)自浙江省嘉興市紅寶石有限公司養(yǎng)殖基地，分別收集3只成年公蝦的眼柄（Es）、肝胰腺（Hp）、精巢（Tt）、促雄性腺（AG）和3只成年母蝦的眼柄、肝胰腺、卵巢組織（Ov），共計(jì)7個(gè)組織、21個(gè)樣品，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序及注釋由北京諾禾致源科技有限公司完成。轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)定量驗(yàn)證所用RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量分析試劑盒購(gòu)于南京Vazyme公司。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及注釋

利用Clontech SMARTer PCR cDNA合成試劑盒，并按照BluePippin轉(zhuǎn)錄本片段，選擇系統(tǒng)方案后，制備轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)。因羅氏沼蝦無(wú)參考基因組序列，故將所有器官組織樣品的混合樣進(jìn)行三代全長(zhǎng)測(cè)序，獲得所有基因序列，作為二代轉(zhuǎn)錄序列拼接比對(duì)。三代測(cè)序基因去除冗余序列和校正后，根據(jù)序列特異性形成唯一性轉(zhuǎn)錄本序列及基因ID。利用Blast軟件，以P值<10為條件，分別在NT、NR、KOG、Swiss-Prot和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，以得分最高的作為該基因的注釋基因名。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄基因定量分析

對(duì)21個(gè)樣品器官組織進(jìn)行二代轉(zhuǎn)錄測(cè)序，組裝后以三代鑒定基因結(jié)果ID為標(biāo)識(shí)，統(tǒng)計(jì)各個(gè)基因的序列條數(shù)，用來(lái)計(jì)算每個(gè)樣本中每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算所有基因的相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)FPKM（每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的碎片）值。依據(jù)組織特異性和性別特異性分析結(jié)果，選擇5個(gè)組織特異性高表達(dá)基因，設(shè)計(jì)定量分析引物（表1），進(jìn)行qPCR定量結(jié)果驗(yàn)證分析，確定轉(zhuǎn)錄組基因相對(duì)表達(dá)量的可信度。

表1 qPCR定量分析引物

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用DESeq的R軟件包，按組織分組，進(jìn)行差異基因表達(dá)比較分析，獲得各器官組織特異性差異表達(dá)基因；以性別為分組，進(jìn)行性別特異性差異表達(dá)基因分析，獲得各性別特異性差異表達(dá)基因。以各器官組織各個(gè)基因平均相對(duì)表達(dá)量FPKM值為基礎(chǔ)，利用軟件R計(jì)算各器官組織的τ，計(jì)算公式如下：

式中：X——基因在第i個(gè)器官組織內(nèi)的相對(duì)平均表達(dá)量FPKM值；

i——試驗(yàn)包含的所有器官組織樣品中第i個(gè)組織；

以τ>0.85為組織特異性基因和τ>1為組織唯一性高表達(dá)基因判定標(biāo)準(zhǔn)，鑒定組織特異性及唯一性表達(dá)基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組基因聚類(lèi)分析及注釋

21個(gè)羅氏沼蝦樣本器官組織，三代測(cè)序結(jié)果經(jīng)去除冗余和校正后，獲得唯一有效轉(zhuǎn)錄本21 345個(gè)，其中15 070個(gè)在至少一個(gè)注釋基因庫(kù)中存在對(duì)應(yīng)的注釋結(jié)果，另外有6 275個(gè)在所有注釋庫(kù)中無(wú)同源基因。另外雌雄羅氏沼蝦的7個(gè)組織樣品的平均FPKM值統(tǒng)計(jì)表明，精巢和卵巢平均FPKM值顯著高于（P<0.05）其他組織（圖1）。隨機(jī)選擇的5個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量與其FPKM值呈極顯著相關(guān)（P<0.01）。

圖1 雌雄羅氏沼蝦不同器官組織相對(duì)表達(dá)量FPKM值分布

2.2 組織特異性基因鑒定分析

以器官組織為分組單位進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，性成熟羅氏沼蝦眼柄組織特異性高表達(dá)基因1 874個(gè)，特異性低表達(dá)基因3 409個(gè)；肝胰腺存在的特異性高和低表達(dá)基因分別為2 700和5 231個(gè)；精巢的特異性高和低表達(dá)基因分別有1 698和612個(gè)；促雄性腺體特異性高和低表達(dá)基因最少，只有270個(gè)和24個(gè)；卵巢的特異性高表達(dá)基因最多，有4 216個(gè)。各器官組織特異性高、低表達(dá)基因與其他組相對(duì)表達(dá)量比較分析表明，不論是高表達(dá)基因還是低表達(dá)基因，其平均相對(duì)表達(dá)量與其他器官組織都存在極顯著差異（P<0.01），結(jié)果見(jiàn)圖2（a）（b）（c）（d）（e）。

圖2 羅氏沼蝦器官各組織的組織特異性基因相對(duì)表達(dá)量

在剔除各組織中所有基因的相對(duì)表達(dá)量FPKM平均數(shù)<1的基因后，計(jì)算各基因的τ，獲得τ≥1的組織唯一性基因835個(gè)，0.85≤τ＜1的組織特異性高表達(dá)基因7 711個(gè)。分析獲得眼柄、肝胰腺、精巢、促雄性腺和卵巢5個(gè)組織唯一性高表達(dá)基因數(shù)依次分別為33，29，39，5和729個(gè)，這個(gè)分布趨勢(shì)與0.85≤τ＜1的組織特異性高表達(dá)基因數(shù)分布一致（表2）。

表2 組織特異性基因按τ值大小分類(lèi)統(tǒng)計(jì)

2.3 性別特異性基因鑒定分析

通過(guò)雌雄個(gè)體所有器官組織基因差異比較分析鑒定，獲得羅氏沼蝦性別特異性差異表達(dá)基因455個(gè)，其中雄性個(gè)體特異性高表達(dá)基因162個(gè)，雌性個(gè)體特異性高表達(dá)基因293個(gè)。剔除差異表達(dá)基因中同一性別中不表達(dá)或低表達(dá)（FPKM值<1）的差異表達(dá)基因后的性別表達(dá)基因數(shù)為217個(gè)，其中雄性和雌性特異性表達(dá)基因分別為87個(gè)和130個(gè)，且雄性高表達(dá)基因表達(dá)水平顯著高于雌性，而雌性個(gè)體低表達(dá)基因組中平均表達(dá)水平顯著高于雄性（圖3）。另外對(duì)最終的性別差異基因分析τ值表明，性別特異表達(dá)基因41%以上的τ>0.8，26%表達(dá)基因>0.85。

圖3 羅氏沼蝦性別差異基因平均相對(duì)表達(dá)量

通過(guò)對(duì)羅氏沼蝦性別特異性表達(dá)基因的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，性別特異性表達(dá)基因在單一性別個(gè)體中的平均表達(dá)量均顯著高于另一性別個(gè)體，雄性個(gè)體各器官組織相對(duì)表達(dá)水平顯著高于雌性各器官組織，且各器官組織間同一性別相對(duì)表達(dá)量較為穩(wěn)定一致（變異系數(shù)<0.5）[圖4（a）]。如功能注釋為人體寄生動(dòng)物翅亞綱虱目動(dòng)物假設(shè)蛋白的基因，該基因在雄性個(gè)體表現(xiàn)出顯著的高表達(dá)特性，且同一性別各組織之間呈現(xiàn)變異系數(shù)<0.5的趨勢(shì)。雌性性別特異性基因的在各器官組織的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于雄性，且變異系數(shù)也<0.5的基因。如功能注釋為負(fù)鼠（Monodelphis domestica）核糖體蛋白大亞基L28e的基因，在雌性個(gè)體各器官組織表現(xiàn)穩(wěn)定的表達(dá)峰度，且各器官組織均顯著高于雄性個(gè)體[圖4（b）]。

圖4 性別特異性表達(dá)基因在羅氏沼蝦不同器官組織中的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

3.1 羅氏沼蝦性別及器官組織特異性基因挖掘進(jìn)展

隨著羅氏沼蝦規(guī)?；庇腿斯みx育技術(shù)的不斷更新，羅氏沼蝦已經(jīng)初步實(shí)現(xiàn)全雄化和全雌化單性群體培育，也是目前唯一完成兩個(gè)性別單性化培育的養(yǎng)殖蝦類(lèi)動(dòng)物。其他養(yǎng)殖蝦類(lèi)品種，如南美白對(duì)蝦和紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus），還處于關(guān)鍵基因探索階段。雖然以色列研究人員已經(jīng)報(bào)道了羅氏沼蝦性別發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵基因iag（insulin-like hormone in androgenic gonad），但關(guān)于iag調(diào)控雄性個(gè)體性腺發(fā)育和雌性性腺逆轉(zhuǎn)發(fā)育，特別是實(shí)現(xiàn)所有相關(guān)組織器官向雌性化方向逆轉(zhuǎn)發(fā)育方面還未有明確報(bào)道。本研究通過(guò)挖掘羅氏沼蝦雌雄個(gè)體消化和性腺組織器官特異性表達(dá)關(guān)鍵基因，提供了有針對(duì)性的組織和性別特異性的靶基因?qū)ο髱?kù)，提高了性別發(fā)育的研究效率。

本研究采用的差異基因鑒定分析和τ，有效挖掘了羅氏沼蝦各器官組織的特異性表達(dá)基因，建立了羅氏沼蝦消化和性別決定5個(gè)主要器官的特異性表達(dá)基因庫(kù)及器官性成熟的有效表達(dá)基因Marker，這與Kryuchkova-Mostacci等和Yanai等對(duì)τ的驗(yàn)證結(jié)果一致。目前組織特異性表達(dá)基因在生物器官組織功能、發(fā)育、甚至疾病的發(fā)生過(guò)程中都有重要的相應(yīng)分子，而本研究挖掘的消化、性腺的組織特異性基因，彌補(bǔ)了羅氏沼蝦發(fā)育研究中組織特異性標(biāo)識(shí)基因缺少的空白。與眼柄器官視覺(jué)功能相關(guān)的組織特異性基因的發(fā)現(xiàn)表明，組織特異性表達(dá)基因與生物進(jìn)化有著密切的關(guān)系，同類(lèi)生物的組織特異性基因有高保守性特征。

3.2 羅氏沼蝦視覺(jué)及消化腺特異性基因挖掘

本研究發(fā)現(xiàn)的羅氏沼蝦眼柄組織特異性高表達(dá)基因主要包括兩大類(lèi)別功能基因。一類(lèi)是KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信號(hào)通路注釋為與視覺(jué)功能相關(guān)的視紫紅質(zhì)基因，另一類(lèi)為眼柄特異性的轉(zhuǎn)錄因子，如上游激活因子spp27的亞基基因。其中羅氏沼蝦眼柄視紫紅質(zhì)基因與頂切葉蟻（Acromyrmex echinatior）、歐洲熊蜂（Bombus terrestris）、佛羅里達(dá)木蟻（Camponotus floridanus）、熱帶家蚊（Culex quinquefasciatus）等昆蟲(chóng)的視紫紅質(zhì)基因高度同源，眼柄特異性表達(dá)的上游激活轉(zhuǎn)錄因子基因與負(fù)鼠的高度同源，表明羅氏沼蝦是甲殼類(lèi)水生動(dòng)物向陸地生昆蟲(chóng)演變的中間體，具有研究節(jié)肢動(dòng)物從水生變?yōu)殛懮膬r(jià)值。

肝胰腺是蝦類(lèi)等甲殼類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)最大的組織器官之一和消化腺體，具有分泌消化酶、免疫、造血和免疫等功能，還具有為蝦類(lèi)動(dòng)物性成熟儲(chǔ)備營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能。本研究發(fā)現(xiàn)的肝胰腺唯一高表達(dá)基因有29個(gè)，其中5個(gè)在KEGG基因注釋庫(kù)中存在同源注釋信息，其中3個(gè)分別為與非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）抗原樣蛋白E同種型X4基因、果蠅（Drosophila erecta）未定性蛋白和頂切葉蟻的酚氧化酶2基因高度同源，另外2個(gè)與蟒蛇（Python bivittatus）未定性蛋白高度同源。已有研究表明，酚氧化酶存在于蝦類(lèi)動(dòng)物血細(xì)胞中，是蝦類(lèi)動(dòng)物重要的免疫系統(tǒng)成員。本研究中，肝胰腺是酚氧化酶的唯一來(lái)源，表明肝胰腺不僅是羅氏沼蝦的消化腺體，也是其唯一的造血器官。

3.3 羅氏沼蝦性腺組織及性別特異性基因挖掘

在羅氏沼蝦性腺組織器官精巢和卵巢的組織特異性基因挖掘中發(fā)現(xiàn)，卵巢組織特異性基因表達(dá)最為豐富。研究表明，與精巢相比，卵巢發(fā)育過(guò)程更加復(fù)雜，發(fā)育過(guò)程參與的基因數(shù)量更多。本文在精巢、促雄性腺和卵巢等3個(gè)性腺組織特異性基因數(shù)量方面的研究結(jié)果與現(xiàn)有的報(bào)道結(jié)果一致，即卵巢中存在更多唯一性高表達(dá)基因，其中峰度最高的基因?yàn)榕cKEGG注釋庫(kù)中歐洲熊蜂血細(xì)胞素同種型的X2基因。該基因是免疫球蛋白和半乳糖結(jié)合雙功能域唾液酸酶的同源基因。在精巢唯一性高表達(dá)基因中已知注釋功能的有參與染色體結(jié)構(gòu)維持的中心體蛋白的rho鳥(niǎo)嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)換因子基因，該基因產(chǎn)物與成員蛋白協(xié)同作用形成中心粒，進(jìn)而參與減速機(jī)體有絲分裂。蝦類(lèi)精子生成過(guò)程中精確控制染色體的均勻分布，該基因的高表達(dá)和現(xiàn)有研究表明，該基因是羅氏沼蝦保證精子狀態(tài)正常的重要因素。在促雄性腺體中發(fā)現(xiàn)的KEGG注釋為四域蛋白酶抑制劑的基因，可裂解外源生物大分子，從而保護(hù)機(jī)體精源組織免受外源生物的侵?jǐn)_。同時(shí)促雄性腺體還存在特異性高表達(dá)的絲氨酸蛋白酶抑制基因，而絲氨酸蛋白酶抑制基因是雄性動(dòng)物精子頂體成熟的重要調(diào)節(jié)因子，也是精子成熟所必需。表明羅氏沼蝦促雄性腺體具有與哺乳動(dòng)物附睪類(lèi)似的功能，是促進(jìn)精子進(jìn)一步成熟的組織器官。

對(duì)羅氏沼蝦性別特異性表達(dá)基因研究發(fā)現(xiàn)，羅氏沼蝦雄性個(gè)體在眼柄、肝胰腺、精巢和促雄性腺中存在共同的雄性特異性高表達(dá)、表達(dá)穩(wěn)定的功能（變異系數(shù)小于0.5）基因，如與體虱（Pediculus humanus corporis）高度同源的假定蛋白T01223。雌性個(gè)體在眼柄、肝胰腺和卵巢中也存在共同的雌性特異性高表達(dá)、表達(dá)穩(wěn)定的功能（變異系數(shù)小于0.5）基因，如與負(fù)鼠高度同源核糖體蛋白L28基因。研究表明，生物體雌雄個(gè)體相同組織之間差異基因占37%以上，但是多個(gè)組織共有且具有性別特異性的基因還未見(jiàn)報(bào)道。這也表明，羅氏沼蝦等水生生物雖然具有ZW染色體系統(tǒng)的性別決定機(jī)制，但由于性別可塑性和單個(gè)基因決定的因素，該物種性別決定機(jī)制更為復(fù)雜，還需深入探索性別特異性基因如何與組織特異性基因協(xié)同發(fā)揮作用，并決定雌雄兩性個(gè)體不同的表型特征。