魏鵬強(qiáng) 崔 燕,2,* 余四九,2 李仕杰 牛靜勇 張 虔

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2 甘肅省牛羊胚胎工程研究中心，甘肅 蘭州 730070；3 天?？h動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 天祝 733200)

牦牛(Bosgrunniens)是我國(guó)青藏高原特有的珍稀牛種之一，對(duì)促進(jìn)牧民經(jīng)濟(jì)和文化繁榮發(fā)揮著重要的作用。牦牛長(zhǎng)期生活在海拔3 000 m以上高寒、低氧、紫外輻射強(qiáng)的嚴(yán)酷環(huán)境中[1]。皮膚作為機(jī)體與外界環(huán)境接觸的第一道屏障，具有阻斷外來物質(zhì)入侵、防止理化損傷、感受外界刺激、分泌活性物質(zhì)以及調(diào)節(jié)體溫等重要生理功能[2]。毛囊是哺乳動(dòng)物皮膚的附屬結(jié)構(gòu)之一，由神經(jīng)外胚層和中胚層發(fā)育形成，外胚層毛囊干細(xì)胞形成毛囊的所有上皮成分，而中胚層細(xì)胞將發(fā)育成毛囊真皮乳頭和結(jié)締組織鞘[3-4]。哺乳動(dòng)物出生后，毛囊具有終生呈周期性生長(zhǎng)的特性，即經(jīng)歷活躍的毛囊生長(zhǎng)期、凋亡介導(dǎo)的退行期和相對(duì)靜止的休止期[5]。毛囊干細(xì)胞、毛乳頭細(xì)胞、毛母質(zhì)細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等均參與了毛囊的周期性生長(zhǎng)[6]。毛囊貫穿于哺乳動(dòng)物皮膚的表皮和真皮，其中毛囊干細(xì)胞位于毛囊壁及毛囊隆突部，而毛乳頭細(xì)胞位于皮膚真皮，表皮部位的毛囊干細(xì)胞與真皮部位的毛乳頭細(xì)胞之間信號(hào)交流是啟動(dòng)毛囊再生的關(guān)鍵[7]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors,IGFs)是該信號(hào)傳導(dǎo)的重要分子之一，對(duì)調(diào)節(jié)皮膚發(fā)育和毛囊周期平衡非常重要[8]。同時(shí)，IGFs作為低氧靶基因，在正常條件下可促進(jìn)細(xì)胞分化，在缺氧條件下可刺激增殖[9-10]。牦牛世代生活在高寒低氧環(huán)境下，可作為研究IGFs促進(jìn)細(xì)胞增殖的重要模式動(dòng)物[11]。

胰島素樣生長(zhǎng)因子包含2個(gè)配體，分別是胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)和胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF-2)，以及2個(gè)受體(IGF1R和 IGF2R)，6個(gè)高親和力結(jié)合蛋白(IGFBP1～6)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1是調(diào)節(jié)毛囊有絲分裂和生長(zhǎng)分化的重要因子，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有影響毛囊增殖、組織重塑、毛發(fā)生長(zhǎng)周期轉(zhuǎn)換和毛囊分化的作用[12]。體外試驗(yàn)表明，外源性IGF-1可以顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的毛囊生長(zhǎng),影響毛囊的形態(tài)發(fā)育[13-15]。IGF-2是胚胎期的重要調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞的增殖、分化，程序性細(xì)胞死亡和轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用[16]。毛囊一般在晚期胚胎發(fā)生時(shí)被誘導(dǎo)形成[17]。最新研究證明，羔羊的皮毛主要在胚胎期發(fā)育，從95 d胎齡到出生前幾天是初級(jí)毛囊和次級(jí)毛囊高度發(fā)育的時(shí)期[18]。而之前的研究發(fā)現(xiàn)，IGF-2能促進(jìn)胚胎期毛囊發(fā)育，從而促進(jìn)毛囊的生成[19]。綜上所述，IGF-1在多種體外培養(yǎng)的毛囊上發(fā)揮重要作用，其主要功能是促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)并維持毛囊的生長(zhǎng)期。而IGF-2是胚胎發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，在晚期胚胎毛囊的形成中發(fā)揮重要作用。目前有關(guān)IGF-1和IGF-2對(duì)成年牦牛皮膚毛囊生長(zhǎng)周期轉(zhuǎn)換的影響仍鮮見報(bào)道。因此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、蛋白免疫印跡(Western blot)和免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)3種方法，分別從基因和蛋白水平檢測(cè)成年牦牛毛囊生長(zhǎng)周期中IGF-1和IGF-2的基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)情況，以期為牦牛出生后毛囊生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換的分子調(diào)控機(jī)制研究提供一定的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)動(dòng)物來自天祝藏族自治縣屠宰場(chǎng)的健康成年牦牛，依據(jù)Yang等[20]對(duì)牦牛毛囊周期的劃分，選擇毛囊處于生長(zhǎng)期、退行期和休止期的牦牛(各10頭，3～6歲)。分別取其頸部皮膚，一部分樣品固定于4%的多聚甲醛溶液中，用于IHC試驗(yàn)；另一部分樣品迅速放置于液氮中，之后移至-80℃冰箱保存，用于qRT-PCR和Western blot試驗(yàn)。

1.2 主要試劑及儀器

IGF-1抗體(DF-6096)，美國(guó)Affinity公司；IGF-2抗體(ab-9574)，英國(guó)Abcam公司；β-actin(bs-0061R)、二抗(bs-0295G-HRP)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TriQuick總RNA提取試劑盒、RIPA組織裂解液，北京索萊寶科技有限公司；鏈霉卵白素-生物素法檢測(cè)(streptavidin peroxidase,SP)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；EVO-M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，長(zhǎng)沙艾科瑞生物工程有限公司；Light Cycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司；DP71顯微照相裝置，日本Olympus公司；Q5000紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Quawell公司；HI1220烘片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中已報(bào)道的野牦牛(Bosmutus)IGF-1、IGF-2基因序列以及β-actin內(nèi)參基因序列，采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，由北京華大基因合成。引物序列見表1。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列Table 1 Primer sequences of target and house-keeping genes

1.3.2 總RNA提取和cDNA合成 取毛囊生長(zhǎng)期、退行期和休止期頸部皮膚，研磨后置于冰盒上，用TriQuick總RAN提取試劑盒Reagent法提取總RNA，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。將提取的不同時(shí)期RNA濃度均調(diào)到300 ng·μL-1，按照EVO-M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增和qRT-PCR試驗(yàn)。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè) 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體系20 μL：10 μL SYBR Green Mix,7 μL ddH2O,2 μL cDNA,上下游引物各0.5 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸15 s,共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。每個(gè)樣品做4個(gè)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后利用Light Cycler 96分析其熔解曲線判定樣品擴(kuò)增的特異性，獲取每個(gè)樣品的循環(huán)數(shù)閾值(cycle threshold value,CT)，運(yùn)用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。

1.4 蛋白免疫印跡(Western blot)

1.4.1 蛋白樣品制備 將采取的毛囊生長(zhǎng)期、退行期和休止期頸部皮膚分別研磨，各稱取0.1 g于離心管中，分別加入1 mL高效RIPA(radio immunoprecipitation assay)組織裂解液和10 μL苯甲基磺酰氟(phenylm methane sulfonyl fluoride,PMSF)，放置搖床2 h使組織充分裂解，于4℃、12 000×g條件下離心10 min，吸取上清液至新的離心管，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度。將提取的毛囊生長(zhǎng)期、退行期和休止期蛋白樣品與4×SDS-PAGE loading buffer按3∶1的比例混合配置蛋白工作液，金屬浴(100℃)變性10 min。

1.4.2 Western blot檢測(cè) 用等量變性的蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h,一抗(IGF-1,1∶1 000稀釋；IGF-2,1∶200稀釋；β-actin,1∶2 500稀釋)孵育，4℃過夜。用磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffer solution tween,PBST)清洗PVDF膜，二抗(Goat Anti-Rabbit IgG/HRP,1∶2 500稀釋)孵育，室溫1 h，用PBST清洗PVDF膜，電化學(xué)發(fā)光液(electro-chemi-luminescence，ECL)顯色并觀察結(jié)果。用Image J軟件測(cè)定各條帶灰度值。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)(IHC)

1.5.1 組織切片制備 從4%多聚甲醛固定液中取出毛囊生長(zhǎng)期、退行期和休止期的皮膚組織，經(jīng)沖塊、脫水、透明、浸蠟和包埋，制成4 μm厚的石蠟切片，置于烘片機(jī)上，60℃烘烤6 h。

1.5.2 免疫組織化學(xué)染色 (1)下行酒精脫蠟至水，在pH值6.0的0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液中微波加熱修復(fù)抗原15 min，自然冷卻至室溫。(2)滴加3%過氧化氫溶液(SP試劑盒試劑1)，37℃作用15 min。(3)滴加正常山羊血清(SP試劑盒試劑2)，室溫封閉15 min。(4)一抗(IGF-1,1∶400稀釋；IGF-2,1∶500稀釋)孵育，4℃過夜。(5)復(fù)溫30 min，生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG(SP試劑盒試劑3)孵育，37℃作用15 min。(6)辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(SP試劑盒試劑4)孵育，37℃作用15 min。(7)DAB顯色液適度顯色，后用自來水沖洗10 min終止顯色。(8)蘇木精復(fù)染1.5 min，鹽酸酒精分化，自來水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以上步驟除第三步外，其余各步驟間均用PBS洗3次(3 min/次)。陰性對(duì)照用PBS代替一抗，其余步驟不變。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，以單因素方差分析ANOVA(SPSS 25.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異顯著，P> 0.05為差異不顯著。用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 qRT-PCR檢測(cè)IGF-1和IGF-2基因的表達(dá)

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，IGF-1 (圖1-A)、IGF-2 (圖1-B)和β-actin(圖1-C) 基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為118、110和80 bp，各個(gè)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期片段大小相符，引物特異性強(qiáng)，可用于后續(xù)qRT-PCR試驗(yàn)。qRT-PCR結(jié)果顯示，IGF-1基因的相對(duì)表達(dá)水平在毛囊生長(zhǎng)期最高，退行期次之，休止期最低。差異分析顯示，IGF-1基因在生長(zhǎng)期的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于退行期和休止期(圖1-D)。IGF-2基因在毛囊生長(zhǎng)周期中的相對(duì)表達(dá)水平與IGF-1基因相似，其在毛囊生長(zhǎng)期的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于退行期和休止期(圖 1-E)。

2.2 Western blot檢測(cè)IGF-1和IGF-2蛋白的表達(dá)

2.2.1 毛囊生長(zhǎng)周期中IGF-1蛋白的相對(duì)表達(dá) IGF-1蛋白在毛囊生長(zhǎng)期皮膚表達(dá)水平最高，在退行期和休止期表達(dá)水平較低。差異分析結(jié)果顯示，IGF-1蛋白在毛囊生長(zhǎng)期皮膚的表達(dá)顯著高于退行期和休止期(圖2)。

注：A～C：IGF-1,IGF-2和β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物,M：GL 2000 DNA 分子標(biāo)記,1：生長(zhǎng)期,2：退行期,3：休止期；D：IGF-1的相對(duì)表達(dá)水平；E：IGF-2的相對(duì)表達(dá)水平。不同小寫字母表示不同時(shí)期之間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: A-C: IGF-1,IGF-2 and β-actin gene amplification products. M: GL 2000 DNA Marker. 1: Anagen. 2: Catagen. 3: Telogen. D: Relative expression levels of IGF-1. E: Relative expression levels of IGF-2. Different lowercase letters indicate significant differences between different periods at 0.05 level. The same as following.圖1 毛囊生長(zhǎng)周期中IGF-1及IGF-2的相對(duì)表達(dá)水平Fig.1 Relative expression levels of IGF-1 and IGF-2 in hair follicle growth cycle

注：A: Western blot結(jié)果；B: IGF-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。Note: A: Western blot results. B: Relative expression levels of IGF-1 protein. 圖2 毛囊生長(zhǎng)周期中IGF-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平Fig.2 Relative expression levels of IGF-1 protein in hair follicle growth cycle

2.2.2 毛囊生長(zhǎng)周期中IGF-2蛋白的相對(duì)表達(dá) IGF-2蛋白在毛囊生長(zhǎng)期皮膚表達(dá)水平最高，在退行期和休止期表達(dá)水平較低。差異分析結(jié)果顯示，IGF-2蛋白在毛囊生長(zhǎng)期皮膚的表達(dá)顯著高于退行期和休止期(圖 3)。

注：A: Western blot結(jié)果；B: IGF-2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。Note: A: Western blot results. B: Relative expression levels of IGF-2 protein.圖3 毛囊生長(zhǎng)周期中IGF-2蛋白的相對(duì)表達(dá)Fig.3 Relative expression levels of IGF-2 protein in hair follicle growth cycle

2.3 IHC檢測(cè)IGF-1和IGF-2在皮膚毛囊的定位表達(dá)

2.3.1 IGF-I在皮膚毛囊生長(zhǎng)周期的定位表達(dá) 在毛囊生長(zhǎng)周期轉(zhuǎn)換過程中，IGF-1主要表達(dá)于皮膚表皮、毛囊外根鞘和毛母質(zhì)細(xì)胞，在毛乳頭細(xì)胞和毛囊內(nèi)根鞘不表達(dá)。棕黃色表示IGF-1的陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物(圖4)。

注：A～C: 毛囊生長(zhǎng)期皮膚縱切；D～F: 毛囊退行期皮膚縱切；G～I(xiàn): 毛囊休止期皮膚縱切；J～L: 陰性對(duì)照。EP: 表皮；ORS: 外根鞘；IRS: 內(nèi)根鞘；HM: 毛母質(zhì)；DP: 毛乳頭。Note: A～C: Longitudinal incision of skin in anagen. D～F: Longitudinal incision of skin in catagen. G～I(xiàn): Longitudinal incision of skin in telogen. J～L: Negative control. EP: Epidermis. ORS: Outer root sheath. IRS: Inner root sheath. HM: Hair matrix. DP: Dermal papilla.圖4 IGF-1在皮膚毛囊生長(zhǎng)周期的定位表達(dá)Fig.4 Localization and expression of IGF-1 in the growth cycle of skin hair follicles

2.3.2 IGF-2在皮膚毛囊生長(zhǎng)周期的定位表達(dá) IGF-2在毛囊生長(zhǎng)的各個(gè)周期皮膚中表達(dá)同IGF-1相似，主要表達(dá)于皮膚表皮、毛囊外根鞘和毛母質(zhì)細(xì)胞，在毛乳頭細(xì)胞和毛囊內(nèi)根鞘不表達(dá)。棕黃色表示IGF-2的陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物(圖5)。

注：A～C: 毛囊生長(zhǎng)期皮膚縱切；D～F: 毛囊退行期皮膚縱切；G～I(xiàn): 毛囊休止期皮膚縱切；J～L: 陰性對(duì)照。EP: 表皮；ORS: 外根鞘；IRS: 內(nèi)根鞘；HM: 毛母質(zhì)；DP: 毛乳頭。Note: A～C: Longitudinal incision of skin in anagen. D～F: Longitudinal incision of skin in catagen. G～I(xiàn): Longitudinal incision of skin in telogen. J～L: Negative control. EP: Epidermis. ORS: Outer root sheath. IRS: Inner root sheath. HM: Hair matrix. DP: Dermal papilla.圖5 IGF-2在皮膚毛囊生長(zhǎng)周期的定位表達(dá)Fig.5 Localization and expression of IGF-2 in the growth cycle of skin hair follicles

3 討論

早在1962年，Davis[21]就報(bào)道了哺乳動(dòng)物被毛生長(zhǎng)呈周期性變化，生長(zhǎng)期中毛囊細(xì)胞快速增殖分化，與退行期和休止期相互交替，形成周期性循環(huán)。Yang等[20]對(duì)毛囊生長(zhǎng)周期中毛囊的數(shù)量及形態(tài)變化進(jìn)行了詳細(xì)研究，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)期毛囊群結(jié)構(gòu)逐漸清晰完整，毛囊數(shù)量明顯增加；退行期毛囊群開始變得不完整，毛囊的數(shù)量開始減少，毛干開始脫落；休止期毛囊群結(jié)構(gòu)松散，只留下退化的外根鞘空腔。研究表明，大量生長(zhǎng)因子和激素都參與調(diào)控毛囊的周期性循環(huán)和形態(tài)學(xué)變化，其調(diào)控機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜[22]。目前，IGFs已被證明廣泛分布在毛囊、毛乳頭及真皮纖維細(xì)胞內(nèi)，對(duì)毛囊的上皮和真皮均有刺激作用[23]。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上探討IGF-1和IGF-2對(duì)毛囊生長(zhǎng)周期轉(zhuǎn)換的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-1和IGF-2在毛囊生長(zhǎng)期、退行期和休止期的表達(dá)存在差異性，由此推測(cè)，IGF-1和IGF-2與毛囊生長(zhǎng)周期轉(zhuǎn)換密切相關(guān)。

通過檢測(cè)IGF-1基因及蛋白在毛囊生長(zhǎng)周期的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IGF-1在毛囊生長(zhǎng)期皮膚中相對(duì)表達(dá)水平最高，在退行期和休止期顯著低于生長(zhǎng)期。這與Bai等[24]在遼寧絨山羊毛囊組織的研究結(jié)果一致。此外，魏玉青[25]通過qRT-PCR技術(shù)對(duì)遼寧絨山羊皮膚中IGF-1的相對(duì)表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)IGF-1的表達(dá)水平與絨山羊毛發(fā)生長(zhǎng)時(shí)期相關(guān)，在毛發(fā)生長(zhǎng)旺盛時(shí)期高表達(dá)，在毛囊退行期和休止期明顯降低。劉逍等[26]在吉林白鵝毛囊發(fā)育過程中檢測(cè)IGF-1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)IGF-1在毛囊生長(zhǎng)期相對(duì)表達(dá)水平最高。因此推測(cè)，IGF-1在毛囊生長(zhǎng)期可能具有促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的作用。同時(shí)，通過檢測(cè)IGF-2基因及蛋白在毛囊生長(zhǎng)周期的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IGF-2的表達(dá)模式與IGF-1相似，其在毛囊生長(zhǎng)期的皮膚中表達(dá)量最高，在退行期和休止期表達(dá)較弱。Ward等[27]用注射法研究IGF-2對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育的長(zhǎng)期影響，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的IGF-2導(dǎo)致小鼠皮膚過度生長(zhǎng)。Baker等[28]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)缺乏編碼IGF-2的功能基因沒有改變出生后小鼠的生長(zhǎng)速度或身體比例，但小鼠表現(xiàn)出表皮發(fā)育不良。另有研究表明，IGF-2在胎兒期毛囊形成過程中能夠促進(jìn)毛囊的發(fā)育和生長(zhǎng)[19]。上述研究都表明了IGF-2對(duì)胎兒期小鼠皮膚及毛囊的生長(zhǎng)和發(fā)育有重要作用。然而，目前對(duì)IGF-2的研究都集中在胚胎期或胎兒期，對(duì)于其在成年動(dòng)物機(jī)體皮膚及毛囊中發(fā)揮的作用尚不清楚。根據(jù)本研究IGF-2在毛囊生長(zhǎng)周期的表達(dá)結(jié)果，提示IGF-2在毛囊周期轉(zhuǎn)換過程中可能具有促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的作用。

相關(guān)研究認(rèn)為，毛乳頭是毛發(fā)再生的信號(hào)中心，毛囊的生長(zhǎng)是外根鞘隆突部毛囊干細(xì)胞和真皮毛乳頭共同作用的結(jié)果[29]。在1990年Cotsarelis等[30]提出的隆突激活假設(shè)中，隆突部細(xì)胞在毛囊休止期后期被毛乳頭激活并遷出，沿著外根鞘向下遷移，在毛乳頭周圍分化形成毛母質(zhì)細(xì)胞。生長(zhǎng)期毛母質(zhì)細(xì)胞分化能力增強(qiáng)，毛囊不斷向下增長(zhǎng)，毛干不斷增長(zhǎng)，隨著毛母質(zhì)細(xì)胞分化衰竭，毛囊逐漸進(jìn)入退行期[31]。研究表明，IGF信號(hào)系統(tǒng)能促進(jìn)毛囊干細(xì)胞遷移至毛乳頭周圍并增殖分化形成毛母質(zhì)細(xì)胞，再通過刺激毛母質(zhì)細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)毛囊的生長(zhǎng)，抑制毛囊退行和休止[32-34]。本研究中，IHC結(jié)果顯示，IGF-1和IGF-2均在毛母質(zhì)細(xì)胞中有陽(yáng)性表達(dá)，提示IGF-1和IGF-2均可能刺激毛母質(zhì)細(xì)胞的增殖分化。同時(shí)，前人研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1在毛囊生長(zhǎng)周期中有調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化的作用，而毛囊干細(xì)胞生成的外根鞘角質(zhì)形成細(xì)胞，具有促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)、抑制毛囊退行的作用[35-36]。結(jié)合IGF-1和IGF-2在皮膚表皮和毛囊外根鞘均有陽(yáng)性表達(dá)的試驗(yàn)結(jié)果，表明IGF-1和IGF-2可能具有促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化能力。然而，本研究在毛囊內(nèi)根鞘并未檢測(cè)到IGF-1和IGF-2的表達(dá)。毛囊內(nèi)根鞘細(xì)胞是由毛母質(zhì)細(xì)胞自身分化的終末分化細(xì)胞[31]，不再分裂增殖，進(jìn)一步提示IGF-1和IGF-2可能具有刺激毛囊上皮細(xì)胞增殖分化的作用。同時(shí)，在毛乳頭細(xì)胞也未檢測(cè)到IGF-1和IGF-2的表達(dá)。Weger等[37]在轉(zhuǎn)基因小鼠毛囊生長(zhǎng)期的毛乳頭細(xì)胞中檢測(cè)到了IGF-1的表達(dá)，但其表達(dá)強(qiáng)度與IGF-1的劑量呈依賴關(guān)系。因此，IGF-1和IGF-2對(duì)毛囊毛乳頭刺激作用可能與自身濃度以及所處的生理環(huán)境有關(guān)。此外，胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF-1和IGF-2具有自分泌和旁分泌效應(yīng)，并通過與I型IGF受體結(jié)合以旁分泌或自分泌的方式激活Ras/Raf/MAP 激酶和PI3k激酶/Akt通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[38-39]。而Tomita等[40]在角質(zhì)形成細(xì)胞中檢測(cè)到IGF-1受體的存在。同時(shí)，在皮膚組織中，IGF-1僅由真皮和毛乳頭的間充質(zhì)細(xì)胞合成[41]。綜上所述，IGF-1和IGF-2在毛囊周期的調(diào)控作用可能通過真皮乳頭釋放信號(hào)以旁分泌的方式結(jié)合到有特定I型IGF受體的上皮細(xì)胞，刺激毛囊上皮細(xì)胞的增殖和分化，從而促進(jìn)毛囊的生長(zhǎng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1和IGF-2在毛囊生長(zhǎng)周期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮重要作用，并可能具有協(xié)同作用，且該過程可能通過刺激毛囊上皮細(xì)胞增殖分化從而促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)。然而，毛發(fā)的不同步生長(zhǎng)，不同物種之間皮膚解剖結(jié)構(gòu)以及生理的差異，對(duì)介導(dǎo)毛囊生長(zhǎng)周期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵分子決定因素的識(shí)別以及調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，IGF-1和IGF-2在毛囊生長(zhǎng)期皮膚中具有較高的表達(dá)，表明兩者與毛囊的生長(zhǎng)密切相關(guān)，可能具有促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的作用。此外，IGF-1和IGF-2定位于皮膚表皮，毛囊外根鞘和毛母質(zhì)，提示其通過影響上皮細(xì)胞的活性來調(diào)控毛囊的周期轉(zhuǎn)換。