丁 寧 于 霞 張 雯 房超琦 王思賢 王治國,*

(1 棗莊市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東 棗莊 277100；2 棗莊市山亭區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，山東 棗莊 277800；3 棗莊市嶧城區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務中心，山東 棗莊 277300)

石榴(PunicagranatumL.)為千屈菜科(Lythraceae)石榴屬(PunicaL.)落葉果樹[1]。石榴果肉中的多酚類化合物在延緩衰老、護肝、消炎、防癌等方面具有較高的藥用價值[2-3]。全國石榴種植主要集中在四川會理、山東棗莊等八大產(chǎn)區(qū)，棗莊市石榴栽培面積已達1萬hm2[4]，該地區(qū)生產(chǎn)的嶧縣石榴已成功入選山東省知名農(nóng)產(chǎn)品區(qū)域公用品牌[5]，因此針對當?shù)厥衿贩N的研究具有重要價值。棗莊石榴產(chǎn)區(qū)的主栽品種為大青皮、大馬牙、崗榴、嶧城三白，約占總種植面積的95%[6]。但石榴植株易發(fā)生干腐病、軟腐病、褐斑病等多種真菌病害[7]，對石榴的質(zhì)量與產(chǎn)量均有嚴重影響。其中石榴干腐病在山東、云南、四川、安徽、陜西、河南等石榴主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，已成為我國石榴產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸[8]。

石榴干腐病是一類發(fā)生在枝干和果實上的系統(tǒng)性真菌病害。石榴干腐病原菌首先侵染石榴枝干，然后蔓延至花萼及果實[9]，并持續(xù)存在于果實貯藏期，造成石榴減產(chǎn)。目前已報道的石榴果實干腐病防治策略主要為噴施化學藥劑，如楊雪等[10]發(fā)現(xiàn)，嘧菌酯在水楊肟酸(salicylhydroxamic acid)協(xié)同作用下對石榴果實干腐病原菌有很好的抑制作用，且田間防治效果良好；王麗等[11]研究表明戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑?qū)麑嵏筛∮休^好的田間防治效果，然而病原菌對化學藥劑的耐藥性問題仍有待解決。石榴抗病品種篩選是一種可以克服耐藥問題的有效綠色防控策略，然而目前鮮見山東地區(qū)有關抗干腐病石榴種質(zhì)資源篩選、枝條干腐病原菌鑒定方面的報道。

鑒于此，本研究對山東省主要石榴品種枝條干腐病進行抗性篩選，分離純化石榴枝條干腐病致病菌，通過形態(tài)學、分子生物學鑒定及致病性測定明確病原菌種類，以期為山東系統(tǒng)性防控石榴干腐病及其抗病機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在山東省棗莊市嶧城區(qū)冠世榴園中采集具有典型癥狀特征的1年生大青皮品種病枝，置于自封袋內(nèi)，帶回分離得到病原菌菌株。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水定容至1 000 mL。 基礎培養(yǎng)基(minimal medium，MM): FeSO41.368 mg、(NH4)2SO40.53 g、葡萄糖1.8 g、NaCl 0.15 g、K2HPO41.74 g、MgSO4·7H2O 0.49 g、CaCl2·2H2O 0.07 g、K2H2PO41.36 g、瓊脂20 g、蒸餾水100 mL。

新型植物基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。CKX53生物顯微鏡，日本Olympus公司；Mastercycler nexus PCR儀，德國Eppendorf公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 石榴干腐病原菌的分離與形態(tài)學觀察 參考文獻[12]的組織分離法，首先選取具有典型癥狀的1年生石榴病枝，剪取病健交界處邊長為5 mm的正方形組織小塊，75%乙醇消毒20 s，0.1%氯化汞溶液浸泡4～6 min，ddH2O沖洗3次，放置在含有干燥濾紙的培養(yǎng)皿中晾干。然后將組織塊置于PDA培養(yǎng)基上，25～28℃條件下培養(yǎng)3～5 d，待長出菌絲后分離純化，將分離得到的病原菌經(jīng)單孢轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基上，4℃條件下保存。

顯微鏡下觀察分離的病原菌形態(tài)特征，分別測量100個分生孢子器、分生孢子梗及分生孢子的大小。

1.2.2 病原菌致病性測定 將分離的病原菌在馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(potato dextrose broth, PDB)培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，25℃搖床搖菌5 d，制成1×108CFU·mL-1的菌懸液備用。

1.2.2.1 枝條離體接種 選取健康1年生石榴枝條，無菌水沖洗3次后晾干，然后用70%酒精擦洗消毒，置于超凈工作臺晾干，切成5 cm左右的小段，石蠟封閉枝條切口，用無菌刀片刺傷枝條表面。用無菌注射器吸取1 mL菌懸液滴至傷口處并涂抹均勻，無菌脫脂棉包住傷口，以無菌PDB培養(yǎng)基作為對照。處理組與對照組各接種5個枝條，重復3次，將接種后的枝條置于25℃恒溫培養(yǎng)箱，觀察記錄石榴枝條的發(fā)病情況，并從病株上再分離病原菌。

1.2.2.2 離體果實接種 摘取健康石榴果實，無菌水沖洗3次后晾干，然后用70%酒精擦洗消毒，置于超凈工作臺晾干，用無菌注射針刺傷果實表面，用無菌注射器吸取1 mL菌懸液滴至石榴果實傷口處并涂抹均勻，以接種無菌PDB培養(yǎng)基為對照。每個果實接種2處，處理組與對照組各接種5個石榴果實，重復3次，培養(yǎng)條件同離體枝條接種。觀察并記錄發(fā)病情況，并從病株上再次分離病原菌。

1.2.3 病原菌分子生物學鑒定 首先使用CTAB法提取菌株DNA，分別選用通用引物ITS1(5′-T C C G T A G G T G A A C C T G C G CG-3′)/ITS4(5′-T C C T C C G C T T A T T G A T A T GC-3′)[13]和Bt2a( 5′-G G T A A C C A A A T C G G T G C T G C TT/Bt2b( 5′-A C C C T C A G T G T A G T G A C C C T T G GC)[14]擴增病原菌的rDNA-ITS和β-tubulin基因序列。PCR反應體系25 μL[15]：2×Taq Master Mix 12.5 μL，引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補齊到25 μL。PCR反應程序：95℃預變性3 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收測序。然后將病原菌β-tubulin和rDNA-ITS聯(lián)合基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中與GeneBank已登錄的相似序列進行同源性對比，使用MEGA X軟件以相鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 不同品種對枝條干腐病的抗性評價

1.2.4.1 田間發(fā)病情況調(diào)查 2021年10—11月，對種植于山東省棗莊市嶧城區(qū)石榴資源圃內(nèi)的20份石榴品種資源進行枝條干腐病抗病性調(diào)查并統(tǒng)計病情指數(shù)。每個品種隨機調(diào)查10株，重復3次。每株石榴從東南西北4個方向隨機調(diào)查共20個枝條。

1.2.4.2 離體抗性篩選 將20個石榴品種枝條分別取樣，開展離體抗性篩選，步驟與1.2.2.1枝條離體接種相同。每個品種接種5個枝條，重復3次。將接種枝條置于恒溫培養(yǎng)箱中，光周期為16 h光照/8 h黑暗，光照溫度設置為23℃，黑暗溫度設置為20℃。相對濕度保持在70%～80%。

1.2.4.3 病情統(tǒng)計 參照楊順超等[16]的病情統(tǒng)計方法，發(fā)病程度分級：0級，無癥狀；1 級，枝條病斑面積占比0～1/3；2級，枝條病斑面積占比1/3～2/3；3級，枝條病斑面積占比2/3～1；4級，枝條整體變黑干枯，然后按照公式計算病情指數(shù)：

病情指數(shù)=∑(各病級枝條數(shù)×該病級值)/(鑒定枝條數(shù)×最高病級值)×100%

(1)。

結(jié)合調(diào)查數(shù)據(jù)，將石榴枝條干腐病抗病等級標準劃分成5個等級：近免疫，病情指數(shù)=0；抗病，病情指數(shù)為0.1～25.0；中抗，病情指數(shù)為25.1～50.0；感病，病情指數(shù)為50.1～75.0；高感，病情指數(shù)為75.1～100.0。

平均病情指數(shù)=(田間發(fā)病情況調(diào)查病情指數(shù)+離體抗性篩選病情指數(shù))/2

(2)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016進行試驗數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離和代表菌株的形態(tài)學特征

近年來，棗莊市石榴果園枝條干腐病發(fā)病狀況嚴重(圖1-A)，石榴干腐病病枝發(fā)病初期病斑呈黑色，橢圓形(圖1-B)，后期整枝干枯死亡，枝條表面有黑色或棕色突起。

注：A：田間癥狀；B：枝條上的分生孢子器(如箭頭所示);C：分生孢子器;D：分生孢子器橫切面；E：分生孢子器中的分生孢子梗；F：在PDA培養(yǎng)7 d的病原菌菌落(正面);G：在PDA培養(yǎng)7 d的病原菌菌落(背面)；H：分生孢子梗(如箭頭所示);I：分生孢子。Note:A: Field symptom. B: Conidiomata on the branch(indicated by the arrow). C: Conidiomata. D: Section view of conidiomata. E: Conidiophores in the conidiomata. F: Colony morphology at the positive for 7 d. G: Colony morphology at the contrary side for 7 d. H: Conidiophores(indicated by the arrow). I: Conidia. 圖1 石榴枝條干腐病癥狀及病原菌形態(tài)特征Fig.1 Symptoms of pomegranate branch rot and Morphological characteristics of the pathogen

病原菌在石榴病枝上的分離頻率為92.3%。經(jīng)分離純化得到形態(tài)學特征基本相同的代表菌株zzdn001和zzdn007，并開展形態(tài)學鑒定。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后菌絲呈乳白色，邊緣規(guī)則，氣生菌絲發(fā)達致密，呈羽毛狀(圖1-F、G)。20 d后PDA培養(yǎng)基上可見黑色分生孢子器，形態(tài)與病斑表面分生孢子器相同，呈黑色乳頭狀隆起，直徑為450～800 μm (圖1-B～D)。分生孢子梗無色透明，圓柱形，無隔膜，不分枝，直或稍彎曲，長15～22.5 μm、寬1.9～2.5 μm(圖1-E、H)。顯微觀察可見α型分生孢子，無色單孢，孢子(6.2～8.6) μm×(1.5～2.8) μm，呈長卵圓形(圖1-I)。根據(jù)楊琴[17]對單間座殼菌(Diaportheeres)的形態(tài)學描述，初步鑒定菌株zzdn001和zzdn007為單間座殼菌(Diaportheeres)。

2.2 病原菌致病性測定

病原菌接種后，石榴枝條發(fā)病率為93.3%，果實發(fā)病率為86.6%。枝條接種組生長9 d后出現(xiàn)干腐病癥狀，枝條接種部位變?yōu)檎丈⑾蛑車鷶U展，該癥狀與枝條干腐病初期癥狀一致(圖2-A～C)。果實接種組5 d后出現(xiàn)干腐病癥狀，果皮形成黑色病斑(圖2-D,E)。室內(nèi)離體接種發(fā)病枝條和果實經(jīng)分離、純化獲得的分生孢子形態(tài)及菌落特征與原接種物完全一致，證實接種菌株為石榴枝條干腐病的致病菌。

注：A：病枝癥狀；B：枝條接種組(接種9 d后)；C：枝條對照組；D：果實接種組(接種5 d后)；E：果實對照組。紅色箭頭所示為病斑位置或接種位置。Note:A: Symptom of the diseased branch. B:The inoculated group of pomegranate branch 9 d after inoculation. C: The branch of control. D: The inoculated group of fruit 5 d after inoculation. E: The fruit of control. The red arrow indicates the location of the disease spot or inoculation.圖2 枝條干腐病的田間癥狀與致病性測定Fig.2 Symptoms of branch rot in the field and pathogenicity test

2.3 石榴枝條干腐病病原菌分子生物學鑒定

菌株zzdn001和zzdn007的ITS序列大小均為584 bp，分別提交至GenBank(zzdn001 Accession No. MT990517，zzdn007 Accession No. OL587848)；β-tubulin基因序列大小為698 bp，分別提交至GenBank(zzdn001 Accession No. OL631611，zzdn007 Accession No. OL631612)。將獲得的序列與GeneBank中已登錄的不同病原菌的相似序列進行比對，并使用β-tubulin和ITS聯(lián)合序列建樹，結(jié)果顯示，zzdn001、zzdn007的聯(lián)合序列與Diaportheeres位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，支持率為95%。結(jié)合致病性測定、形態(tài)學特征和分子生物學鑒定結(jié)果，可將菌株石榴枝條干腐病病原菌鑒定為單間座殼菌(Diaportheeres)(圖3)。

圖3 基于β-tubulin和ITS聯(lián)合基因序列構(gòu)建菌株zzdn001、zzdn007和其相關菌株的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of stain zzdn001、zzdn007 and their related strains based on combinedβ-tubulin and ITS gene sequence

2.4 山東省主要石榴品種對枝條干腐病的抗性評價

田間發(fā)病情況調(diào)查和離體抗性篩選結(jié)果顯示，17個石榴品種的抗病類型一致，不一致的品種為墨石榴、黑美人和紅皮馬牙。根據(jù)平均病情指數(shù)抗性評價如下：白皮酸、碧榴幾乎未發(fā)病，表現(xiàn)為近免疫，占調(diào)查品種的10%；秋艷、崗榴1號、大馬牙、嶧城三白、冰糖籽、黑美人、大青皮等7個品種病情指數(shù)為2.9～18.6，表現(xiàn)為抗病，占調(diào)查品種的35%；棗莊瑪瑙、墨石榴、九洲紅、青皮軟籽、棗莊軟仁、黃金榴等6個品種病情指數(shù)為26.0～42.4，表現(xiàn)中抗，占調(diào)查品種的30%；冠榴、謝花甜、紅皮馬牙等3個品種病情指數(shù)為50.7～66.4，表現(xiàn)為感病，占調(diào)查品種的15%；大紅袍和泰山紅等2個品種表現(xiàn)為高感，占調(diào)查品種的10%，其中大紅袍病情指數(shù)最高，為85.2。

3 討論

石榴枝條病害和果實病害存在一定的關聯(lián)性。例如，付娟妮等[18]認為陜西地區(qū)果實腐爛是由葡萄座腔菌引起，王含等[19]認為葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)也是造成陜西地區(qū)石榴枝條病害的病原菌，該枝條病害特征與劉會香等[9]總結(jié)的瘡痂病一致。目前有關果實干腐病病原菌的鑒定研究較多，其中多項研究表明墊殼孢菌(Coniellagranati)可以引起石榴果實干腐病[20-21]，而石榴枝條干腐病的病原菌鑒定研究較少。本研究將單間座殼菌(Diaportheeres)確定為石榴枝條干腐病病原菌，對抗病育種和病害防治具有重要意義。

在生產(chǎn)實踐中，石榴枝條病害的鑒定還需進一步細分。劉會香等[9]將石榴瘡痂病的癥狀總結(jié)為：發(fā)生在石榴多年生大枝或主干上，病枝表皮逐漸隆起、翹皮的真菌病害。病原菌葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)還可造成蘋果輪紋病、桃流膠病、甜櫻桃葉斑病等林木病害[22-24]。在病害癥狀和病原菌等方面，本研究所述的石榴枝條干腐病與石榴瘡痂病均有所區(qū)別。石榴枝條干腐病主要發(fā)生在1年生枝條上，病斑呈黑色橢圓形后期整枝干枯死亡，病原菌單間座殼菌(Diaportheeres)作為植物病原真菌、內(nèi)生菌或腐生菌在世界范圍內(nèi)廣泛分布，通?？梢砸鹬参锏母岛凸麑嵏癄€、枝干潰瘍甚至植株死亡，其中比較典型的是梨樹枝枯病[25]和獼猴桃黑斑病[26]。此外，肥水管理不規(guī)范可能增加石榴枝條干腐病的發(fā)病率。氮元素可以保證細胞壁的厚度、強度以及代謝酶活性，從而抑制病菌的侵染和孢子的萌發(fā)[27]。鈣元素能夠調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝，影響細胞壁的通透性和酚類物質(zhì)含量，抑制病原菌菌絲的生長[24]。

抗病品種篩選是防治石榴枝條干腐病的重要措施，我國目前還鮮有針對石榴枝條干腐病抗病品種篩選的系統(tǒng)研究。本研究對20個石榴品種資源進行抗病評價，對石榴抗性育種和種質(zhì)資源改良具有重要意義。另外，植物組織被病原菌侵染一般會導致被侵染組織過氧化物酶(peroxidase, POD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等防御酶類大量積累以及光合速率下降[28-30]，因此防御酶類和光合作用相關酶的活性測定可以作為不同石榴品種抗性篩選的輔助研究方法。綜上所述，本研究還需將抗性篩選與防御酶類和光合作用相關酶的活性測定相結(jié)合，以便準確判斷不同石榴品種的抗病類型。

4 結(jié)論

本研究對山東省棗莊市的20個主要石榴品種進行田間抗性調(diào)查，篩選出的抗病品種可作為石榴枝條干腐病抗病機理研究的理想材料。同時采用柯赫氏法則驗證致病性、顯微形態(tài)特征觀察及分子生物學分析鑒定單間座殼菌(Diaportheeres)為石榴枝條干腐病病原菌。研究結(jié)果為山東石榴干腐病的系統(tǒng)性防控、抗病機理研究提供了理論基礎。