常 楊，楊俊靜，趙艷榮

(河北省秦皇島市第二醫(yī)院血液內(nèi)分泌科，河北 秦皇島 066600)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是由糖尿病引起的一種可導(dǎo)致心力衰竭的心肌病，主要病理特征為心肌纖維化引起的系列心功能不全[1]。糖尿病患者發(fā)生心力衰竭的概率在16%～29%，其病死率呈逐年上升趨勢[2]。因?yàn)镈CM的病理生理機(jī)制并未完全清楚，針對該病缺少有效的靶向藥物。格列汀類藥物是目前針對該病的一類臨床高效治療藥物，阿格列汀是其中一種新開發(fā)的藥物，2012年在日本被批準(zhǔn)用于患者[3]。阿格列汀是一種氨基酸酰胺，對二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4，DPP-4)具有長期有效的抑制作用。DPP-4抑制劑通過增強(qiáng)β細(xì)胞的胰島素分泌，抑制腸促胰島素激素的降解，降低高血糖[4]。據(jù)報(bào)道，阿格列汀通過抑制DPP-4對核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)的激活，發(fā)揮對巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和小鼠肝臟的抗炎活性[5]。但是其對DCM患者心肌纖維化的過程是否具有調(diào)控作用，及其發(fā)揮作用的機(jī)制均尚未有人研究。微小核糖核苷酸(microribonucleotide，miRNA)是長度在18～25個(gè)核苷酸之間的內(nèi)源性保守穩(wěn)定的單鏈非編碼RNA，其通過阻滯靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程抑制靶基因表達(dá)而參與人類疾病的調(diào)控[6]。miR-497-5p是最近新發(fā)現(xiàn)的一種參與DCM發(fā)展的關(guān)鍵miRNA[7]，但是其是否與阿格列汀的治療功能有關(guān)尚未可知。本研究擬以高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞MCFs為研究對象，觀察阿格列汀、miR-497-5p對MCFs細(xì)胞纖維化的作用，揭示阿格列汀通過上調(diào)miR-497-5p抑制其靶基因糖基磷脂酰肌醇特異性磷脂酶D(glycosylphosphatidylinositol specific phospholipase D，GPLD1)發(fā)揮抗纖維化的功效，為阿格列汀的臨床推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠心肌成纖維細(xì)胞(mouse cardiac fibroblasts,MCFs)購自北京北納生物公司；RPMI-1640購自美國Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自杭州四季青公司；阿格列汀(國藥準(zhǔn)字：H20130548；生產(chǎn)批號：121105)購自日本武田公司；RIPA裂解液購自(碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體、兔抗膠原Ⅰ(collagenⅠ，ColⅠ)多克隆抗體、兔抗ColⅢ單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自上海艾博抗公司；RT-qPCR試劑盒購自日本Takera公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自上海碧云天研究所。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng) 使用90%的RPMI-1640+10%的FBS細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)MCFs細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2 d更換一次培養(yǎng)液。

1.2.2分組與處理 正常培養(yǎng)的MCFs細(xì)胞隨機(jī)分為NG組(5.50 mmol/L葡萄糖)、HG組(25.00 mmol/L葡萄糖)，使用5.50、25.00 mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)MCFs。將HG組細(xì)胞分為阿格列汀低劑量(0.05 μmol/L)組、阿格列汀中劑量(0.10 μmol/L)組、阿格列汀高劑量(0.20 μmol/L)組，篩選0.10 μmol/L阿格列汀處理6 h的HG組細(xì)胞標(biāo)記為阿格列汀最適濃度。使用LipofectamineTM3000將mimics-NC組(轉(zhuǎn)染mimics-NC)、miR-497-5p組(轉(zhuǎn)染miR-497-5p)、anti-NC組(轉(zhuǎn)染anti-NC)、anti-miR-497-5p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-497-5p)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-GPLD1組(轉(zhuǎn)染si-GPLD1)、阿格列汀+mimics-NC組(轉(zhuǎn)染mimics-NC)、阿格列汀+miR-497-5p組(轉(zhuǎn)染miR-497-5p)、阿格列汀+miR-497-5p+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-497-5p和pcDNA)、阿格列汀+miR-497-5p+pcDNA-GPLD1組(共轉(zhuǎn)染miR-497-5p和pcDNA-GPLD1)轉(zhuǎn)染至MCFs細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12 h后更換新培養(yǎng)液，再用25.00 mmol/L葡萄糖(處理48 h)或0.10 μmol/L的阿格列汀(處理6 h)培養(yǎng)。RT-qPCR法鑒定轉(zhuǎn)染的效率，確定轉(zhuǎn)染成功后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3WB實(shí)驗(yàn) 收集需要檢測的各組細(xì)胞，將細(xì)胞使用RIPA裂解液冰上充分裂解30 min。提取總蛋白，定量變性。使用變性后的上清液進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，將蛋白沉積在瓊脂凝膠上。通過轉(zhuǎn)膜儀將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，整個(gè)轉(zhuǎn)膜過程需在0 ℃低溫環(huán)境下操作完成。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜用2.5%的脫脂奶粉37 ℃封閉2 h。封閉結(jié)束后，洗膜，轉(zhuǎn)移至稀釋過的一抗溶液(兔抗α-SMA單克隆抗體1∶1 000、兔抗ColⅠ多克隆抗體1∶800、兔抗ColⅢ單克隆抗體1∶1 000)中，4 ℃冰箱中孵育過夜。取出膜充分清洗，再轉(zhuǎn)移至稀釋過的二抗溶液(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔1∶500)中，37 ℃孵育1.5 h。結(jié)束后使用ECL電化學(xué)發(fā)光試劑盒對膜顯影、定影。Image J分析條帶灰度值，確定目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.4RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 收集待檢測的各組細(xì)胞，使用Trizol液提取細(xì)胞的總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其合成cDNA，作為模板。使用qPCR試劑盒檢測上述cDNA中miR-497-5p、GPLD1的表達(dá)。以U6、GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算miR-497-5p、GPLD1的相對表達(dá)量。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，8 min；95 ℃，30 min；59 ℃，30 s；72 ℃，30 s；72 ℃，5 min，41個(gè)循環(huán)。引物序列為(5′-3′)：miR-497-5p：上游引物：CCTTCAGCAGCACACTGTGG下游引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT。GPLD1：上游引物：GGTGGGCTCCGAGCAT；下游引物：GCACCTTTGTAGGTGAGCAG。U6：上游引物：CTCGCTTCGGCAGCACA；下游引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT。GAPDH：上游引物：TGACTTCAACAGCGACACCCA；下游引物：CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。

1.2.5雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn) 使用生物信息在線預(yù)測網(wǎng)站Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn)預(yù)測miR-497-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)GPLD1與miR-497-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建含有GPLD1-WT(含GPLD1 3′UTR-WT)和GPLD1-MUT(含GPLD1 3′UTR-MUT)的psiCHECK2熒光報(bào)告載體，將其分別與miR-NC、miR-497-5p、anti-miR-NC、anti-miR-497-5p共轉(zhuǎn)染。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測上述細(xì)胞的熒光活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.1統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較使用單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1阿格列汀對高糖誘導(dǎo)MCFs纖維化的調(diào)控 與NG組相比，HG組MCFs中α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；與HG組相比，阿格列汀中劑量組、阿格列汀高劑量組細(xì)胞中α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 不同濃度阿格列汀處理的高糖誘導(dǎo)MCFs纖維化標(biāo)志的蛋白圖

表1 不同濃度阿格列汀處理的高糖誘導(dǎo)MCFs纖維化標(biāo)志的表達(dá)

2.2阿格列汀對高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞miR-497-5p表達(dá)的調(diào)控 與NG組相比，HG組MCFsmiR-497-5p表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與HG組相比，阿格列汀中劑量組、阿格列汀高劑量組miR-497-5p表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 阿格列汀調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的MCFs細(xì)胞中miR-497-5p表達(dá)

2.3過表達(dá)miR-497-5p調(diào)控高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞纖維化 與mimics-NC組相比，miR-497-5p組細(xì)胞中miR-497-5p表達(dá)顯著升高，α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3，圖2。

表3 過表達(dá)miR-497-5p的高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞的纖維化標(biāo)志的表達(dá)

圖2 過表達(dá)miR-497-5p的高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞纖維化標(biāo)志蛋白圖

2.4miR-497-5p靶向GPLD1 Starbase軟件(http://starbase.sysu.edu.cn)預(yù)測到miR-497-5p與GPLD1之間存在連續(xù)的7個(gè)互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖3A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，與mimics-NC組相比，miR-497-5p組GPLD1-WT細(xì)胞的熒光活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4；與mimics-NC組相比，miR-497-5p組細(xì)胞GPLD1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，與anti-NC組相比，anti-miR-497-5p組細(xì)胞GPLD1蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3B，表5。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 miR-497-5p調(diào)控GPLD1

表5 miR-497-5p負(fù)向調(diào)控GPLD1表達(dá)

2.5敲減GPLD1調(diào)控高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞的纖維化 與si-NC組相比，si-GPLD1組細(xì)胞GPLD1表達(dá)顯著降低，α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6，圖4。

圖4 敲減GPLD1的高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞的纖維化標(biāo)志的蛋白圖

表6 敲減GPLD1的高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞的纖維化指標(biāo)

2.6過表達(dá)GPLD1對阿格列汀、miR-497-5p抑制高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞纖維化的影響 與阿格列汀+mimics-NC組相比，阿格列汀+miR-497-5p組細(xì)胞miR-497-5p表達(dá)顯著升高，α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與阿格列汀+miR-497-5p+pcDNA組相比，阿格列汀+miR-497-5p+pcDNA-GPLD1組細(xì)胞中miR-497-5p表達(dá)顯著降低，α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表7，圖5。

表7 過表達(dá)GPLD1調(diào)節(jié)阿格列汀、miR-497-5p處理的高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞纖維化標(biāo)志蛋白

圖5 過表達(dá)GPLD1調(diào)節(jié)阿格列汀、miR-497-5p處理的高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞纖維化標(biāo)志蛋白的表達(dá)

3 討 論

DPP-4抑制劑也稱格列汀類藥物，已通過直接給藥或與其他降糖藥物聯(lián)合用藥的方式廣泛用于臨床治療2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)[8]，但其在DCM中作用的分子機(jī)制仍不清楚。Soare等[9]報(bào)道，在系統(tǒng)性硬化癥患者的纖維化皮膚中，DPP-4的表達(dá)和DPP-4陽性成纖維細(xì)胞的數(shù)量以轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)依賴的方式增加，DPP-4的過度表達(dá)促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的激活，而DPP-4的藥物抑制或基因失活可通過干擾TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號活性而減少成纖維細(xì)胞的增殖、遷移及膠原的分泌，揭示DPP-4抑制劑可發(fā)揮有效的抗纖維化作用。Ma等[10]在DCM的研究中報(bào)道，H9C2細(xì)胞的缺氧處理可誘導(dǎo)DPP-4的異常升高，而DPP-4抑制劑阿格列汀能夠明顯的抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和促炎因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的分泌及氧化應(yīng)激反應(yīng)，揭示阿格列汀具有降低血糖、保護(hù)心肌細(xì)胞的雙重功能。高糖環(huán)境下，心肌過度表達(dá)蛋白激酶C，鈣調(diào)節(jié)異常，最先出現(xiàn)左心室肥厚，舒縮功能障礙，導(dǎo)致心肌壞死和多發(fā)性纖維變性[11]。于是，推測阿格列汀能夠抑制DCM心肌纖維化。為了探究阿格列汀對DCM心肌纖維化的作用，本研究檢測了不同濃度阿格列汀處理的高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞的纖維化標(biāo)志基因α-SMA、ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，中高濃度的阿格列汀(0.10、0.20 μmol/L)能夠明顯的抑制高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞α-SMA、ColⅠ和ColⅢ蛋白表達(dá)的升高。此結(jié)果揭示了阿格列汀還具有抑制DCM心肌纖維化的功能，暗示阿格列汀的臨床治療價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，阿格列汀能夠明顯的升高miR-497-5p在高糖誘導(dǎo)的MCFs細(xì)胞中的表達(dá)水平，猜測miR-497-5p表達(dá)的升高可能與阿格列汀的抑制DCM心肌纖維化有關(guān)。

miR-497-5p位于17號染色體，通過調(diào)節(jié)SMAD家族成員3、TGF-β1參與心肌纖維化過程[12-14]。Chen等[7]在DCM的研究中報(bào)道，miR-497-5p作為長非編碼RNA X-非活性特異轉(zhuǎn)錄物(X inactive specific transcription factor，XIST)的特異性結(jié)合因子調(diào)控糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)/晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)信號通路的活性進(jìn)而參與DCM的心臟損傷過程。近期，Wang等[15]在研究中報(bào)道，miR-497在糖尿病腎病組織、高糖誘導(dǎo)的人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞HK-2中的表達(dá)均顯著降低，并且高表達(dá)的硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin-interactingprotein，TXNIP)能夠結(jié)合miR-497，過表達(dá)miR-497可明顯的抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)漏出、TXNIP/核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域，富含亮氨酸重復(fù)序列和含Pyrin結(jié)構(gòu)域3(Nucleotide-binding oligomerization domain, leucine-rich repeat and pyrin domain-containing 3，NLRP3)/含半胱氨酸的天冬氨酸 蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase1，caspase-1)激活以及IL-1β和IL-18分泌的升高，說明miR-497在糖尿病治療中發(fā)揮積極的有利功效。本研究結(jié)果顯示，miR-497-5p在高糖誘導(dǎo)的MCFs細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并且過表達(dá)miR-497-5p能夠顯著的抑制高糖對MCFs細(xì)胞中α-SMA、ColⅠ和ColⅢ蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用。重要的是，研究還通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-497-5p能夠直接靶向負(fù)調(diào)控GPLD1的表達(dá)水平，這可能與miR-497-5p的抑制高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞的纖維化功能存在一定聯(lián)系。

GPLD1基因位于6號染色體上，由25個(gè)外顯子組成，曾被指定為胰腺型，是人類唯一的GPLD1基因，該基因失調(diào)與胰腺和胃部腫瘤惡化相關(guān)[16]。GPLD1與胰島之間的密切關(guān)系可能是DCM纖維化的原因之一。Qin等[17]報(bào)道，GPLD1在成人潛伏性自身免疫性糖尿病(latent autoimmune diabetes in adults，LADA)、1型糖尿病(type 1 diabetes，T1DM)患者血漿中的表達(dá)顯著高于正常人、T2DM患者，受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)分析揭示GPLD1可作為診斷LADA和T2DM的潛在候選血漿蛋白。Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)，高胰島素血癥、糖耐量減低和T2DM患者血清中脂肪組織胰島素抵抗相關(guān)的磷脂酰肌醇蛋白聚糖4(glypican，GPC4)含量明顯升高，而GPLD1是GPC4的關(guān)鍵因子，與GPC4的含量呈正相關(guān)。于是猜測，GPLD1可能也與DCM存在聯(lián)系，進(jìn)而接受阿格列汀、miR-497-5p的調(diào)控。本研究檢測了敲減GPLD1的高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞的纖維化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，敲減GPLD1具有與過表達(dá)miR-497-5p相似的抑制α-SMA、ColⅠ和ColⅢ蛋白表達(dá)的作用。過表達(dá)GPLD1能夠明顯的削弱阿格列汀和過表達(dá)miR-497-5p對α-SMA、ColⅠ、ColⅢ蛋白表達(dá)的抑制作用，說明過表達(dá)GPLD1可逆轉(zhuǎn)阿格列汀或過表達(dá)miR-497-5p高糖誘導(dǎo)MCFs細(xì)胞纖維化的抑制作用。

綜上所述，阿格列汀抑制高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的纖維化，產(chǎn)生這種作用的機(jī)制與促進(jìn)miR-497-5p進(jìn)而抑制GPLD1表達(dá)緊密相關(guān)，為阿格列汀治療糖尿病心肌病提供支持。