干建松

（1.江蘇財(cái)經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院糧食與食品藥品學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，江蘇 徐州 221116）

荸薺（Eleochairis toberosa），俗稱馬蹄，是多年生淺水草本植物荸薺的地下球莖，我國(guó)荸薺資源豐富[1]。荸薺營(yíng)養(yǎng)豐富，味甜多汁，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。荸薺可直接食用，亦可加工成菜品、罐頭、果脯及飲料等[2-4]。荸薺皮為荸薺加工副產(chǎn)物，多被丟棄，造成資源浪費(fèi)并污染環(huán)境[5]。荸薺皮含有黃酮類、多酚類、甾醇類、糖類等多種活性物質(zhì)[6-9]。陳秋娟等[10]研究微波輔助提取荸薺皮多酚工藝，結(jié)果表明荸薺皮中多酚含量為3.15%。以荸薺皮為原料制備具有生物活性的多酚對(duì)荸薺皮的深度開發(fā)利用具有重要意義。

多酚類物質(zhì)是一種含有多個(gè)羥基，化學(xué)性質(zhì)活潑的化合物[11-12]，具有抑菌、抗氧化、抗炎及抗腫瘤等活性[13-14]，可用于醫(yī)藥、食品、飼料及日用化妝品等。目前荸薺皮多酚的研究多集中在提取工藝及粗提物的活性研究[15-16]，粗提液中含有大量的蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，對(duì)其生物活性的評(píng)價(jià)準(zhǔn)確性不高[17]。因此研究適宜的方式分離純化荸薺多酚，并評(píng)價(jià)其生物活性、理化性質(zhì)是重要的研究方向。

本文考察5種大孔吸附樹脂對(duì)荸薺皮粗多酚的純化效果，篩選最佳的純化樹脂，并進(jìn)行純化工藝優(yōu)化，分析純化后荸薺皮多酚的抗氧化活性、穩(wěn)定性等，為荸薺皮多酚類物質(zhì)在功能性食品、藥品和化妝品中的利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荸薺皮：市售，50℃熱風(fēng)干燥；D101（非極性）、AB-8（弱極性）、ADS-17（中等極性）、S-8（極性）、NKA-9（極性）樹脂：天津波鴻樹脂科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國(guó)sigma公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；NaOH、HCl、福林酚、沒食子酸、Na2CO3、乙酸乙酯：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

FA2004N電子天平：上海菁華科技儀器有限公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī)、Eppendorf5418小型臺(tái)式高速離心機(jī)：德國(guó)艾本德股份有限公司；DHC-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；D-8紫外可見分光光度計(jì)：南京菲勒儀器有限公司；XO-1500DN超聲波萃取儀：南京先歐儀器制造有限公司；ZHWY-2102c恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 荸薺皮多酚的提取

取干燥荸薺皮，粉碎，加入50%乙醇，置于超聲波萃取儀內(nèi)，設(shè)定提取溫度50℃、料液比1∶25（g/mL）、超聲功率300 W、超聲時(shí)間40 min、提取次數(shù)2次，合并2次提取液，減壓濃縮，得到荸薺皮多酚粗提液，置于冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大孔樹脂的篩選

選取5種不同極性的大孔吸附樹脂，分別為D101（非極性）、AB-8（弱極性）、ADS-17（中等極性）、S-8（極性）、NKA-9（極性）。取適量樹脂置于無水乙醇浸泡24 h，用去離子水洗至無醇味，加入4%HCl溶液浸泡6 h后，用去離子水洗至中性，然后加入4%NaOH溶液浸泡6 h，用去離子水洗至中性，備用。分別取2.0 g預(yù)處理的大孔樹脂，置于帶塞三角瓶中，加入荸薺皮多酚粗提液50 mL，于恒溫?fù)u床中25℃、150 r/min下吸附12h，測(cè)定上清液的總多酚濃度C1。吸附結(jié)束后抽濾，樹脂用去離子水清洗2次后，置于具塞三角瓶中，加入70%乙醇100 mL，于恒溫?fù)u床中振蕩洗脫2 h，測(cè)上清液的總多酚濃度C2[18]。樹脂吸附量、吸附率及解吸率計(jì)算公式如下。

式中：C0為初始多酚濃度，mg/mL；C1為吸附后上清液中多酚濃度，mg/mL；C2為解吸液中多酚濃度，mg/mL；W為大孔吸附樹脂的質(zhì)量，g；V1為多酚溶液體積，mL；V2為解吸液體積，mL。

1.2.3 樹脂靜態(tài)吸附與解吸

1.2.3.1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

分別取2.0 g預(yù)處理的大孔樹脂，置于帶塞三角瓶中，加入荸薺皮多酚粗提液100 mL，于恒溫振蕩器中25℃、150 r/min下吸附，每隔20 min測(cè)定上清液的多酚濃度至無明顯變化。計(jì)算吸附量并繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.3.2 多酚初始濃度對(duì)吸附的影響

取2.0 g預(yù)處理好的AB-8樹脂5份，分別加入100 mL 的質(zhì)量濃度分別為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL荸薺皮粗多酚溶液，在25℃、150 r/min下振蕩2 h，測(cè)定上清液中多酚濃度，計(jì)算吸附量。

1.2.3.3 乙醇濃度對(duì)樹脂解吸效果的影響

取飽和吸附多酚且吸附量已知的AB-8樹脂5份，各2.0g，分別加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇200 mL，在25℃、150 r/min下振蕩2 h，測(cè)定洗脫液中的多酚濃度，計(jì)算解吸率及純度。

多酚純度測(cè)定方法：多酚純度為混合物中多酚類物質(zhì)質(zhì)量與混合物總質(zhì)量的比值。將洗脫液減壓濃縮后，真空冷凍干燥至恒重，稱取一定量多酚純化物（m1）溶解，測(cè)定多酚含量（m2），純度按如下公式計(jì)算。

1.2.4 動(dòng)態(tài)吸附-解吸

1.2.4.1 上樣流速對(duì)樹脂吸附效果的影響

稱取適量處理好的AB-8樹脂，采用濕法裝柱（2.0 cm×50 cm），將質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL的樣液分別以2、4、6 mL/min的流速過柱，每30 mL收集流出液一次，測(cè)定流出液中的多酚濃度，繪制穿透曲線。

1.2.4.2 洗脫速度對(duì)樹脂解吸效果的影響

在多酚質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL、上樣速度為1.0 mL/min條件下上樣40 mL，吸附2 h后，用70%乙醇以洗脫速度分別為1、2、3 mL/min洗脫，每10 mL為一管收集流出液，測(cè)定其多酚濃度，繪制解吸曲線。

1.2.4.3 多酚濃度的測(cè)定

稱取0.025 g的沒食子酸，加入蒸餾水使其溶解，然后倒入1 000 mL的容量瓶中，用蒸餾水潤(rùn)洗燒杯倒入容量瓶中，再加蒸餾水定容至刻度線，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0.025 mg/mL。吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 置于 25 mL 的容量瓶中，每份都加入1.0 mL福林酚試劑，搖晃均勻，隨后再加4 mL 15%Na2CO3，搖勻后加入蒸餾水定容至刻度線，避光于30℃靜置1 h后，在波長(zhǎng)760 nm下測(cè)定其吸光度，由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=10.119 0x-0.017 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 7。多酚樣品處理同沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)照沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中多酚的濃度。

1.2.5 多酚抗氧化活性的測(cè)定

1.2.5.1 DPPH自由基清除試驗(yàn)

取2 mL多酚溶液，加1 mL濃度為0.2 mmoL/L的DPPH溶液，振蕩搖勻，置暗處反應(yīng)30 min后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定517 nm處吸光度A1；取乙醇溶液1 mL與多酚溶液2 mL混勻，測(cè)吸光度A2；取乙醇溶液2 mL和DPPH溶液1 mL混勻，測(cè)吸光度A3；2 mL水與2 mL乙醇混合溶液調(diào)零[19]。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

參照DE等[20]的方法，分別取5mL7.4mmol/LABTS溶液與3.6 mmol/L過硫酸鉀溶液，混勻，25℃避光反應(yīng)12 h，得ABTS+溶液。取樣品液0.4 mL，加入3.6 mL ABTS+溶液，避光反應(yīng)6 min，測(cè)定734 nm處吸光度。以去離子水替代樣品做空白對(duì)照。ABTS+自由基清除率計(jì)算如下。

式中：A0為空白對(duì)照吸光度；A1為樣品與ABTS反應(yīng)后吸光度；A2為樣品吸光度。

當(dāng)數(shù)據(jù)包是以HBF模式轉(zhuǎn)發(fā)時(shí),數(shù)據(jù)包目的節(jié)點(diǎn)是t,雷區(qū)FAR為F。節(jié)點(diǎn)si是任意一個(gè)節(jié)點(diǎn)。而節(jié)點(diǎn)sj是節(jié)點(diǎn)si的一個(gè)鄰居節(jié)點(diǎn)。從節(jié)點(diǎn)si至節(jié)點(diǎn)sj的HTHS表示為

1.2.6 多酚穩(wěn)定性研究

1.2.6.1 溫度對(duì)荸薺皮多酚穩(wěn)定性的影響

取一定濃度的多酚溶液，分別放置于40、60、80、100℃的水浴中，每隔1 h取樣，在760 nm處測(cè)吸光度。

1.2.6.2 pH值對(duì)荸薺皮多酚穩(wěn)定性的影響

用1 mol/L HCl和0.5 mol/L NaOH配成pH值為3、6、9的溶液，加入適量多酚樣品，每隔2 d取樣，在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。

1.2.6.3 光照對(duì)荸薺皮多酚穩(wěn)定性的影響

取一定濃度的多酚溶液，密封，分別置于自然光和避光條件下，每隔2 d取樣，在760 nm處測(cè)吸光度。

1.2.6.4 蔗糖對(duì)荸薺皮多酚穩(wěn)定性的影響

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示（n=3），采用Origin pro 18.0和Design-expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

5種大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸性能見圖1。

圖1 大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸性能Fig.1 Static adsorption and desorption properties of macroporous resin

由圖1可知，非極性的D101和弱極性的AB-8的吸附量較高，極性的S-8、NKA-9吸附量較低，其中AB-8的吸附量最高，為（31.64±1.11）mg/g。D101 和AB-8的解吸率較高，其中AB-8的解吸率最高，為（88.35±2.65）%；多酚類化合物的分子中含有多個(gè)酚羥基結(jié)構(gòu)，其分子的極性不高，所以弱極性或非極性的樹脂吸附效果較好[2，19]。因此，本試驗(yàn)選擇AB-8為最適宜樹脂。

2.2 樹脂靜態(tài)吸附與解吸

2.2.1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

AB-8對(duì)多酚吸附的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線及對(duì)應(yīng)的吸附速度曲線見圖2。

圖2 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)與吸附速度曲線Fig.2 Static adsorption kinetics and adsorption rate curve

由圖2可知，在吸附的前80 min，吸附量迅速增加，在80 min～180 min，吸附量增加緩慢，在160 min達(dá)到了最大吸附量（31.64±1.11）mg/g。吸附速度先迅速降低，后趨于平緩。出現(xiàn)此變化規(guī)律的原因可能是，樹脂上具有許多吸附活性位點(diǎn)，每個(gè)活性位點(diǎn)吸附固定數(shù)量的分子，在吸附起始階段，較多的活性點(diǎn)處于未吸附的活性狀態(tài)，導(dǎo)致吸附較快，從而樹脂吸附量增加較快，隨著吸附的進(jìn)行，可利用的活性位點(diǎn)越來越少，吸附量趨于穩(wěn)定，從而吸附速度下降。140 min時(shí)，吸附量為（31.25±1.09）mg/g，與最大吸附量無明顯差異，綜合考慮時(shí)間與吸附量，選擇吸附時(shí)間為140 min。

2.2.2 多酚初始濃度對(duì)吸附的影響

多酚初始濃度對(duì)樹脂吸附的影響結(jié)果見圖3。

圖3 多酚初始濃度對(duì)吸附的影響Fig.3 Effect of initial concentration of polyphenols on adsorption

由圖3可知，吸附量隨初始濃度的增加呈先上升后略下降的趨勢(shì)，當(dāng)初始濃度為3.0 mg/mL時(shí)，吸附量達(dá)到最大值（31.70±0.95）mg/mL。出現(xiàn)該趨勢(shì)的原因一方面為濃度越高，溶液與樹脂之間的濃度差越大，吸附動(dòng)力也越大，故濃度越高相同時(shí)間吸附量越大；另一方面，當(dāng)粗提液多酚濃度高時(shí)雜質(zhì)濃度也高，部分雜質(zhì)會(huì)與多酚競(jìng)爭(zhēng)樹脂的吸附活性位點(diǎn)，導(dǎo)致對(duì)多酚的吸附量降低[21]。綜合考慮，選擇初始濃度為3.0 mg/mL為最適初始濃度。

2.2.3 乙醇濃度對(duì)樹脂解吸率和多酚純度的影響

乙醇濃度對(duì)樹脂解吸率和多酚純度的影響結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇濃度對(duì)樹脂解吸率和多酚純度的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on desorption rate and polyphenol purity of resin

由4圖可知，多酚的解吸率隨著乙醇濃度的增加呈增加趨勢(shì)，但多酚純度隨乙醇濃度的增加呈先增加后減小的趨勢(shì)。乙醇濃度為70%時(shí)，解吸率為（86.13±2.58）%，多酚純度達(dá)到最大值（57.5±1.72）%；當(dāng)乙醇濃度 80%時(shí)，解吸率基本達(dá)到最大值（91.07±2.73）%，但是多酚純度降到（50.16±1.50）%。綜合考慮解吸率和多酚純度，選擇乙醇濃度70%為最適洗脫溶劑。

2.2.4 上樣流速對(duì)樹脂吸附效果的影響

上樣流速對(duì)AB-8樹脂吸附荸薺皮多酚的影響結(jié)果見圖5。

圖5 上樣流速對(duì)樹脂吸附的影響Fig.5 Effect of sample loading flow rate on resin adsorption

當(dāng)流出液中目標(biāo)成分的質(zhì)量濃度為上樣液質(zhì)量濃度的1/10時(shí)即為泄漏點(diǎn)，此時(shí)大孔樹脂基本達(dá)到吸附飽和狀態(tài)，可以停止上樣[22]。由圖5可知，當(dāng)流速為2、4、6 mL/min時(shí)，泄漏點(diǎn)的流出液體積分別為240、190、140 mL，泄漏點(diǎn)的流出液體積隨上樣流速的增加而降低，導(dǎo)致其吸附率隨上樣流速的增加而降低。速度越快，樣液與樹脂接觸時(shí)間越短，吸附率下降，反之，速度降低，吸附率增加。但是速度過慢，穿透時(shí)間越長(zhǎng)，導(dǎo)致生產(chǎn)效率降低，綜合考慮速度與吸附率，選擇流速為4 mL/min。

2.2.5 洗脫速度對(duì)樹脂解吸效果的影響

洗脫劑流速對(duì)多酚解吸的影響見圖6。

圖6 洗脫速度對(duì)解吸的影響Fig.6 Effect of elution rate on desorption

由圖6可知，當(dāng)洗脫劑流速較低時(shí)，洗脫峰峰型較對(duì)稱、尖銳，洗脫劑流速增加，洗脫峰拖尾較嚴(yán)重，對(duì)洗脫劑用量為250 mL時(shí)的解吸率進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，流速為1、2、3 mL/min時(shí)，解吸率分別約為91%、87%、74%，洗脫劑流速越低，解吸效率越高。但是，洗脫速度過慢，洗脫時(shí)間太長(zhǎng)，綜合考慮，確定洗脫流速為2 mL/min。

2.2.6 純化工藝的驗(yàn)證

在多酚初始濃度3.0 mg/mL、上樣流速4 mL/min、洗脫劑70%乙醇溶液、洗脫流速2 mL/min條件下，采用AB-8樹脂對(duì)初始純度為12.54%的荸薺皮多酚進(jìn)行純化，多酚回收率為（81.65±2.45）%，多酚純度為（58.64±1.76）%。

2.2.7 多酚抗氧化活性的測(cè)定

純化前后荸薺皮多酚ABTS+自由基和DPPH自由基清除率研究結(jié)果見圖7。

圖7 多酚抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of polyphenols

由圖7可知，多酚對(duì)兩種自由基的清除率都隨著濃度的增加而增加，多酚粗提物的抗氧化活性較低，純化多酚與VC的抗氧化活性相近，說明純化多酚有較高的抗氧化活性。

2.2.8 荸薺皮多酚穩(wěn)定性

為有效利用荸薺皮多酚、采取科學(xué)的加工方式提供依據(jù)，試驗(yàn)研究溫度、pH值、光照、蔗糖等因素對(duì)荸薺皮多酚的穩(wěn)定性研究，結(jié)果見圖8。

圖8 荸薺皮多酚的穩(wěn)定性Fig.8 Stability of Eleochairis toberosa peel polyphenols

由圖8a可以看出，在不同溫度下，多酚濃度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，溫度為40℃時(shí)，多酚變化較平緩，4 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定，60℃～100℃時(shí)，隨時(shí)間延長(zhǎng)下降較快，說明多酚熱穩(wěn)定性較差。由圖8b可以看出，多酚在pH3時(shí)，較穩(wěn)定，放置14 d后含量仍較高，在pH9時(shí)，多酚濃度迅速下降，說明多酚在較高pH值下穩(wěn)定性較差。由圖8c、圖8d可以看出，多酚在光照和蔗糖條件下較穩(wěn)定。

3 結(jié)論

采用大孔樹脂對(duì)荸薺皮多酚進(jìn)行純化，對(duì)5種大孔吸附樹脂，包括 D101（非極性）、AB-8（弱極性）、ADS-17（中等極性）、S-8（極性）、NKA-9（極性）的吸附和解吸性能研究，結(jié)果表明弱極性AB-8樹脂的吸附量與解吸率均較高，吸附量為（31.64±1.11）mg/g，解吸率為（88.35±2.65）%，選擇AB-8為最適樹脂。AB-8樹脂對(duì)荸薺皮多酚的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線表明，靜態(tài)吸附140 min基本達(dá)到飽和，此時(shí)樹脂對(duì)荸薺皮多酚的飽和吸附量為（31.25±1.09）mg/g。樹脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸研究結(jié)果表明，多酚初始濃度3.0 mg/mL、以4 mL/min的流速吸附，吸附平衡后以70%乙醇為洗脫劑，洗脫流速為2 mL/min工藝最佳。對(duì)大孔樹脂純化荸薺皮多酚工藝進(jìn)行驗(yàn)證，純化后，荸薺皮多酚純度由12.54%提高到（58.64±1.76）%。對(duì)純化前后多酚與VC的ABTS+自由基和DPPH自由基清除率研究，結(jié)果表明純化多酚抗氧化活性高于粗多酚，純化多酚的抗氧化活性接近VC的抗氧化活性，說明純化多酚有較高的抗氧化活性。對(duì)多酚穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明多酚熱穩(wěn)定性較差，在pH3、光照和蔗糖條件下較穩(wěn)定。本試驗(yàn)為荸薺皮多酚的進(jìn)一步研究及保健食品與食品加工奠定了研究基礎(chǔ)。