陶宇逍，李強強*，周桂華，吳黎明

（1.中國農業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100093；2.廣西蜜博士蜂業(yè)有限責任公司，廣西 南寧 532706）

蜂花粉是蜜蜂從顯花植物花蕊中采集的花粉，經蜜蜂加入花蜜及其唾液混合加工成的一種不規(guī)則的花粉團[1]。蜂花粉含有多糖、蛋白質、必需氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素、礦物質、核酸、酶類、酚酸類、黃酮類化合物以及微量營養(yǎng)素等200余種營養(yǎng)成分，幾乎包含了自然界全部營養(yǎng)素。因此，蜂花粉是一種良好的膳食補充劑，并享有“天然微型營養(yǎng)庫”的美稱[2]。蜂花粉富含生物活性物質，可有效增強免疫力、防止衰老、美容皮膚，同時對炎癥、癌癥、心腦血管疾病、糖尿病、前列腺疾病等有輔助治療作用，是理想的功能性食品。但因蜂花粉的致敏性，蜂花粉產品的安全性和質量控制仍是亟待解決的難題[3]。

蜂花粉的來源是普通花粉，因此蜂花粉和普通花粉一樣有可能引起人體的過敏反應[4]?；ǚ圻^敏原是目前已知的最重要的一種過敏原，許多植物的花粉都會引起過敏患者一定的過敏反應[5]。在一項研究中，用蜂花粉對147名特應性患者和57位健康個體進行過敏皮試，結果發(fā)現，具有致敏性的成分是蜂花粉中的花粉，而不是蜜蜂唾液中的酶[6]。目前對于蜂花粉過敏案例的研究并不像其它花粉那樣豐富。本文將國內外關于蜂花粉的致敏案例、過敏原分離鑒定、致敏機制評價，以及改善致敏性的加工控制技術相關研究進展進行綜述，以期為蜂花粉的安全生產和開發(fā)利用提供相關參考。

1 致敏機理

蜂花粉引起的食物源性過敏反應屬于I型過敏反應。I型過敏反應的機制是過敏原刺激呼吸道或消化道的免疫細胞，細胞信號由抗原呈遞細胞傳遞到T細胞，T細胞釋放細胞因子促進B細胞產生IgE抗體，IgE與肥大細胞表面的Fc受體結合，此時機體處于致敏狀態(tài)。當機體再次接觸過敏原，過敏原與附著于肥大細胞上的IgE結合，肥大細胞發(fā)生脫粒，激發(fā)過敏反應[7]。致敏過程如圖1所示。

圖1 I型過敏反應機理Fig.1 Mechanism of type I allergy

2 蜂花粉變應原的分離鑒定方法

2.1 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法

對植物花粉過敏原的研究，研究者們通常利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離花粉粗提液組分并確定其蛋白質的相對分子量，經離子交換層析法分離純化幾類主要的蛋白質，通過免疫印跡法對比鑒定每種主要蛋白質過敏原的致敏性，從而鑒定出蜂花粉中的主要變應原[8]。

陳小文等[9]通過SDS-PAGE對油菜花粉的蛋白質組分進行分離并測定相對分子質量，之后用免疫印跡法測定變應原成分，并通過離子交換層析對油菜花粉變應原進行分離純化，結果顯示，油菜花粉中有10余條蛋白帶，其中分子質量為30、25、15、10 ku的蛋白可與油菜花粉過敏癥病人的血清IgE結合，其中15 ku和10 ku的蛋白質為主要變應原。目前研究者使用此方法，已分離、純化得到了椰子、重陽木、大籽蒿、田菁等多類植物花粉的變應原[10-13]。

2.2 雙向電泳法

除SDS-PAGE外，雙向電泳法也是分離測定過敏原的常用方法。與SDS-PAGE相比，雙向電泳法可以得到獨立的蛋白質點，且分子量和等電點更加準確。劉碩等[14]使用雙向電泳法對真葉葵花粉提取液的蛋白質組分進行分析，電泳圖結果顯示約有601個主要蛋白斑點，分子量分布約20 kDa～130 kDa，等電點主要集中在pH4.0～8.0。

2.3 聚合酶鏈反應法

聚合酶鏈反應法（polymerase chain reaction，PCR）是一種更加靈敏的檢測方法，可檢測到編碼過敏原蛋白質的痕量DNA和RNA，并且結合分子生物學技術可獲得完整的致敏蛋白。Midoro-Horiuti等[15]通過雪松花粉樣品中的mRNA獲得雪松花粉主要過敏原Jun a 1的cDNA基因序列，并由大腸桿菌表達出過敏原蛋白質，之后通過過敏癥患者的IgE進行免疫痕跡分析，從而確定了Jun a 1的致敏性。為獲得梯牧草中的主要過敏原Phl p 4的完整蛋白并確定其致敏性，Dewitt等[16]通過PCR方法克隆出Phl p 4的全長cDNA，并由大腸桿菌表達出完整蛋白，再通過離子親和色譜進行分離純化，成功獲得Phl p 4蛋白，并分析出其與芹菜過敏原蛋白Api g 5具有同源性。Vrtala等[17]利用過敏患者的IgE從Phleum pretense花粉中分離出一種由cDNA編碼的過敏原，可與約80%的草花粉過敏患者體內的IgE結合，通過重組蛋白鑒定為來自梯牧草Phl p V的V組過敏原。由此可見，PCR法并非直接鑒定樣品中過敏原的完整蛋白序列，而是通過檢測編碼基因間接地獲得致敏蛋白序列。

2.4 色譜-質譜聯(lián)用法

色譜-質譜聯(lián)用法具有高靈敏性、高分辨率、高自動化等優(yōu)點，能直接檢測過敏原蛋白的存在、亞型、特異性肽段等，并且在檢測復雜樣品中的多個過敏原蛋白時具有優(yōu)越性，同時不涉及免疫手段，不需要特異性抗體的參與，被廣泛應用于過敏原蛋白的研究中。Sepp?l?等[18]使用液相色譜-質譜聯(lián)用技術，鑒定出了梯牧草中的Phl p 1b、Phl p 1a和Phl p 5b 3種過敏原蛋白的含量。付婉藝[19]依據免疫印跡結果，從黃花蒿花粉蛋白提取物SDS-PAGE膠上取蛋白條帶，使用高效液相色譜-離子阱質譜聯(lián)用儀進行鑒定，成功鑒定出黃花蒿花粉中的新過敏原Art an 7。由于花粉的自然變異，花粉中的蛋白質過敏原存在很多同工型，不同的同工型的氨基酸序列可能僅相差一個或幾個氨基酸，色譜-質譜聯(lián)用技術可同時鑒定出多種同工型。Fenaille等[20]基于蛋白質組學的分析方法，使用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術，鑒定出來自不同草種的草花粉第一類過敏原存在5個同工型。因此，將質譜技術與各種分離手段相結合，可用于蛋白質組學高通量分析，從而明確致敏蛋白的各種亞型及特異性肽段等[21]。

3 基于過敏動物模型的蜂花粉致敏性評價與機制研究

由于人體實驗的安全性和局限性，建立敏感動物的過敏模型研究過敏原是更為安全高效的方法。研究表明，嚙齒動物在免疫調節(jié)的許多方面與人類相似，并且某些品系屬于高IgE反應型，類似于人類的遺傳性過敏癥，因此過敏動物模型被廣泛應用于食物致敏性評價與機制研究中，常用過敏嚙齒動物模型見表1。

表1 常用過敏嚙齒動物模型Table 1 Commonly used rodent models of allergy

3.1 基于小鼠模型的蜂花粉致敏性評價與機制研究

小鼠作為最常用的動物模型，具有體積小、繁殖快、成本低等優(yōu)點，目前近親交配和轉基因小鼠以及多種小鼠免疫分子試劑已經商品化，小鼠模型被廣泛用于過敏性疾病和過敏機制的研究[33]。

BALB/c小鼠是近親交配高IgE應答品系，常被作為食物過敏和花粉過敏的動物模型。Castillo-Courtade等[34]用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）作為過敏原，氫氧化鋁作為佐劑對BALB/c小鼠進行經口灌胃，用大劑量OVA灌胃激發(fā)，制備小鼠消化道過敏模型。結果顯示，過敏組小鼠中，血清總IgE、OVA特異性IgE和OVA特異性IgG表達量增高，回腸、結腸及血清中mMCp-1表達量增高，脾細胞、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和白細胞介素-3（interleukin-3，IL-3）表達量增高。不同品系小鼠對同一過敏原的過敏反應可能存在差異，如趙新鳳等[35]對BALB/c和KM兩個品系小鼠食物過敏模型進行比較，結果顯示，BALB/c小鼠對OVA的敏感性高于KM小鼠。

3.2 基于大鼠模型的蜂花粉致敏性評價與機制研究

敏感品系大鼠能產生較為理想的I型過敏反應，相較于豚鼠和小鼠，大鼠的大小更適于在單體進行分析，并且致敏激發(fā)后能產生與人類相似的過敏癥狀[36]。BN大鼠是高免疫球蛋白應答品系，常作為研究花粉過敏和食物過敏的動物模型。梯牧草花粉與水接觸后會釋放出含有過敏原的淀粉顆粒，Motta等[37]以此淀粉顆粒溶液作為過敏原，用滴鼻法對BN大鼠進行氣管內致敏，滴鼻激發(fā)后采集血液和支氣管淋巴結。采用酶聯(lián)免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）對大鼠血清中的梯牧草抗原特異性IgE進行檢測，結果顯示，特異性IgE表達增高，并且花粉顆?？烧T導淋巴細胞增殖。朱慶齡等[38]采用卵清蛋白作為過敏原，在無佐劑條件下對BN大鼠經口灌胃，建立BN大鼠食物過敏模型。結果顯示，與對照組相比，過敏組大鼠血清OVA-IgE和血漿組胺水平顯著增高，致敏率為90%。Sun等[39]比較了BN和Wistar大鼠口服卵清蛋白后的過敏反應和臨床表現，結果顯示，兩種品系的大鼠表現出不同的過敏反應和臨床表現，并且過敏反應與臨床表現之間沒有相關性，這些結果表明這兩種品系大鼠的免疫學機制可能存在不同。

3.3 基于豚鼠模型的蜂花粉致敏性評價與機制研究

豚鼠具有易感性，是目前常用的過敏動物之一。楊瓊梁等[40]用楊樹花粉激發(fā)豚鼠過敏建立過敏模型，對Dunkin Hartley雄性豚鼠腹腔注射致敏3次后，通過霧化吸入激發(fā)。結果顯示，模型組豚鼠的鼻黏膜、支氣管肺泡灌洗液和肺組織存在炎癥細胞浸潤，白細胞介素4免疫反應上升，干擾素γ免疫反應下降，血清中IgE、組胺、白三烯B4含量增加。向軍儉等[41]以海蝦浸提液為過敏原，氫氧化鋁為免疫佐劑，建立豚鼠過敏模型。結果顯示，豚鼠血清中海蝦過敏原的血清IgE和IgG水平顯著上升。

盡管利用敏感品系動物構建蜂花粉食源性致敏的動物模型及其機制研究目前尚不健全，但上述花粉及食物致敏的動物模型建立為后續(xù)蜂花粉食源致敏性研究奠定了基礎，各致敏指標的測定也為蜂花粉致敏機制的探究提供了技術支持。

4 改善蜂花粉致敏性的加工控制技術

4.1 超高壓技術

超高壓技術可在常溫或低溫環(huán)境下使用，在改變抗原蛋白空間構象的同時，對食品營養(yǎng)成分和風味物質的影響較小，在食品脫敏加工領域應用廣泛[42]。例如，大豆中的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是主要過敏原，Tang等[43]研究發(fā)現，在較高的壓力（400 MPa或600 MPa）條件下，大豆球蛋白的構象會發(fā)生變化。牛β-乳球蛋白是一種重要的牛奶過敏原，Meng等[44]使用高壓處理牛β-乳球蛋白，結果表明，其構象因高壓處理而改變，致敏性顯著下降。

4.2 熱處理

熱處理可使蛋白質發(fā)生共價或非共價相互作用，如交聯(lián)、聚合、變形和二硫鍵重排等，在一定程度上破壞了蛋白質的過敏原表位，從而降低致敏性。Burks等[45]在80℃和120℃條件下處理大豆樣品60 min，通過ELISA法檢驗大豆蛋白7S和11S片段的致敏性，發(fā)現加熱能顯著降低7S和11S蛋白結合IgE的能力。Kasera等[46]研究了熱處理對豆類蛋白致敏性的改變，結果顯示，蕓豆、黑豆和花生的可溶性蛋白以及不溶性蛋白的特異性IgE結合能力顯著降低。然而，單熱處理存在不確定性，在加熱過程中可能生成一些新的過敏原表位、蛋白質分子內部的過敏原表位可能暴露，從而可能會增加致敏性。并且，熱處理對于食物中的熱不穩(wěn)定性營養(yǎng)成分（如維生素、不飽和脂肪酸等）會產生破壞，相比非熱脫敏技術存在一定的弊端。

4.3 輻照

輻照處理可使蛋白質的二硫鍵、氫鍵等發(fā)生斷裂，使蛋白質二級、三級結構發(fā)生變化，甚至導致蛋白質脫氫、脫氨，使一級結構發(fā)生變化。輻照還可使蛋白質分子內或分子間發(fā)生交聯(lián)，從而降低致敏蛋白質的致敏性[47]。Vaz等[48]用γ-輻射處理小麥胚芽凝集素（wheat germ agglutinin，WGA），發(fā)現WGA的過敏性抗原表位在高劑量輻射后活躍性降低，同時也發(fā)現經10 kGy處理后的小麥胚芽凝集素的結構發(fā)生了變化，其呈折疊且無定形聚合狀態(tài)，證明γ-輻射可降低小麥的致敏性。然而，目前消費者對輻照食品存在排斥心理，輻照食品的食用安全性也存在爭議，因此開發(fā)新型、高效、安全的脫敏技術十分必要。

4.4 生物法

4.4.1 酶法

蛋白酶催化蛋白質水解，可破壞具有過敏原表位的片段，從而顯著降低過敏原蛋白的致敏性。Lakshman等[49]從紅曲菌中提純出兩種酸蛋白酶，采用單一酶法和復合酶法酶促制備乳清蛋白濃縮物的水解產物。結果表明，紅曲霉酸蛋白酶能夠有效地水解兩個主要的牛乳過敏原，降低牛乳乳清蛋白的致敏性。李育強等[50]建立了一種花粉和蜂花粉破壁、脫敏、提取水溶性成分的方法，使用糖苷酶、蛋白酶和肽酶處理，在脫敏同時能保留更多的營養(yǎng)成分并改善口感。

4.4.2 發(fā)酵法

微生物作用可使蛋白質分解變性，從而達到降低過敏性的目的。相比于其它方法，發(fā)酵處理后的食品中的蛋白質被分解，有助于吸收，同時對其它營養(yǎng)成分影響較小[51]。Biscola等[52]研究評估了蛋白水解菌株糞腸球菌VB43水解豆?jié){中存在的主要致敏蛋白的能力，結果表明，β-伴大豆球蛋白被完全水解，大豆球蛋白被水解為酸性多肽。

生物法包括酶法和發(fā)酵法，相比超高壓技術、熱處理和輻照而言，更加高效、安全，在花粉和蜂花粉產品開發(fā)領域已有所應用，然而目前尚缺少對酶或發(fā)酵處理后蜂花粉致敏性評價的科學手段，因此對于處理參數條件的優(yōu)化和控制無法標準化實施。健全蜂花粉致敏性評價體系、開發(fā)標準化脫敏方法是亟需解決的問題。

5 結語

蜂花粉是良好的膳食補充劑，有較大的開發(fā)潛力，隨著需求的增加，有關其致敏性的研究和評估機制也亟需完善。對于蜂花粉過敏原的研究，可以從根本上建立健全蜂花粉的安全性評估機制，為生產所需的各種脫敏技術手段打好理論基礎，也對蜂花粉進一步地開發(fā)利用具有重要意義。