譚皓云，劉 茜，胡德寶，張林林，李 新，丁向彬，郭 宏，郭益文

(天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

肌肉系統(tǒng)是維持動物體生長發(fā)育的重要基礎(chǔ)。大量研究發(fā)現(xiàn)，許多長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)與肌肉生長發(fā)育相關(guān)，如lncMAR1[1]、lncMALAT1[2]、lncMAAT[3]等。lncRNA曾因為只有極少數(shù)序列編碼蛋白質(zhì)、絕大部分編碼非蛋白質(zhì)而一度被認為是基因組序列中累積的“垃圾產(chǎn)物”[4]。直到美國啟動ENCODE研究計劃后人們才發(fā)現(xiàn)在基因組序列中較大部分為長度>200 nt的lncRNAs[5]。研究表明，lncRNA具有調(diào)控肌肉生長發(fā)育的作用，是影響骨骼肌功能、疾病的關(guān)鍵因子[6]。目前對于lncRNA的研究主要集中在對生物體的調(diào)控作用或編碼小肽等方面[7-8]。此外，lncRNA還與肌肉發(fā)育相關(guān)，如在小鼠體內(nèi)過表達lncRNA MAR1可增加小鼠肌肉重量和強度，敲低后肌肉重量和強度降低[1]；干擾linc-RAM可抑制小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞分化過程，影響肌肉再生[9]；干擾lnc-mg可導(dǎo)致小鼠肌肉萎縮，過表達lnc-mg會造成小鼠肌肉肥大[10]。由于lncRNA作用機制復(fù)雜，方式多樣，在物種間保守性很低，使得不同種屬動物lncRNA之間作用關(guān)系不大，且目前研究多集中于人和小鼠等生物體內(nèi)，而對牛肌肉生長影響鮮有報道[11]。實驗室前期測序共發(fā)現(xiàn)13條差異表達的lncRNAs，其中l(wèi)nc23對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞具有調(diào)控作用[12]。鑒于此，本試驗選擇其中一條差異高表達的lnc721進行探究，深入分析lnc721干擾模型對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖與分化的調(diào)控作用，以期為研究lncRNA在牛肌肉中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 原代牛骨骼肌衛(wèi)星細胞來源于6月齡西門塔爾胎牛的腿臀肌、肩胛肌，均由天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室分離并凍存。

1.1.2 主要試劑及儀器 siRNA和Cell-LightTMEdU ApolloinvitroKit均購自廣州瑞博生物技術(shù)有限公司；Opti-MEM?Meduium、胎牛血清和馬血清均購自Life Technologies公司；DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司；ECL試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司；胰蛋白酶、RIPA Buffer和PMSF均購自北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；All-in-OneTMqPCR Mix購自GeneCopoeia公司；MyHC抗體購自DSHB公司；MyoG抗體、GAPDH抗體和Goat Anti-mouse IgG均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

細胞恒溫培養(yǎng)箱購自三洋電機公司；倒置顯微鏡購自Leica公司；Light Cycler?96熒光定量PCR儀購自上海羅氏制藥有限公司；PowerPac Basic電泳儀、Mini-Protean Tetra、MiniTyans-Blot Cell及電泳凝膠成像系統(tǒng)ChemiDocXRS+均購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 原代牛骨骼肌衛(wèi)星細胞復(fù)蘇后采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待細胞匯合度達80%左右時進行傳代，將細胞傳至合適大小的孔板中，加入含10% FBS的DMEM增殖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細胞全部貼壁后進行轉(zhuǎn)染處理，轉(zhuǎn)染時的細胞密度為50%～60%。收取增殖期細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分化期細胞需使用含2% HS培養(yǎng)基培養(yǎng)[12]。對增殖期及分化期第1、2、3天的牛骨骼肌衛(wèi)星細胞提取RNA，利用HiFiScript cDNA Synthesis Kit進行cDNA模板制備，反應(yīng)條件為：42 ℃ 15 min；85 ℃ 5 min。―20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 lnc721生物信息學(xué)分析與亞細胞定位 根據(jù)牛全基因組序列比對，在NCBI中查詢lnc721序列信息及上、下游基因，初步搜索潛在的靶基因；使用CPC網(wǎng)站預(yù)測lnc721編碼能力。牛骨骼肌衛(wèi)星細胞誘導(dǎo)分化48 h后，采用NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents Kit進行核質(zhì)分離試驗，確定亞細胞定位。通過實時熒光定量PCR對lnc721進行亞細胞定位分析[13]，以GAPDH和Pre-GAPDH分別作為細胞質(zhì)(cyt)和細胞核(nuc)的標(biāo)志基因，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×All-in-OneTMqPCR Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)。結(jié)果采用2―ΔΔCt方法計算。

1.2.3 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞轉(zhuǎn)染 3個lnc721 siRNAs干擾序列均由廣州瑞博生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成：ASO-bta-lnc721_001(si-1)：5′-TTTCAAGCAGCCAGACAAAG-3′；ASO-bta-lnc721_002(si-2)：5′-AGGATGTCGCT-GTCTGTATA-3′；ASO-bta-lnc721_003(si-3)：5′-GGATCACAG-CCTGCCAACAC-3′。將牛骨骼肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)至可轉(zhuǎn)染狀態(tài)，分別將合成的3個干擾序列及對照(NC)轉(zhuǎn)染進肌衛(wèi)星細胞中，每組3個生物學(xué)重復(fù)。提取增殖期細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行實時熒光定量PCR試驗。以GAPDH為內(nèi)參基因檢測干擾效果，選用效果最佳的siRNA進行下一步試驗。引物序列見表1，PCR反應(yīng)體系及程序同1.2.2。

1.2.4 EdU檢測 將細胞接種至96孔板中，設(shè)置試驗組和對照組，各3個生物學(xué)重復(fù)，試驗操作按照Cell-LightTMEdU ApolloinvitroKit說明書進行。通過熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果，每孔拍照并計數(shù)，推算出EdU標(biāo)記指數(shù)。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細胞標(biāo)志因子mRNA表達量 將牛骨骼肌衛(wèi)星細胞傳代至24孔板中，待細胞貼壁后進行siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后6 h換液處理，24 h后收取增殖期RNA，分化期細胞需更換成分化培養(yǎng)基，并定期觀察細胞分化狀態(tài)。于分化第3天收取細胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，采用實時熒光定量PCR檢測細胞增殖標(biāo)志因子(Ki-67和Pax7)及分化標(biāo)志因子(MyHC和MyoG)的mRNA表達水平，引物序列見表1，PCR反應(yīng)體系及程序同1.2.2。

1.2.6 Western blotting檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細胞標(biāo)志因子蛋白水平表達量 采用RIPA蛋白裂解液提取細胞蛋白，采用BCA方法確定蛋白質(zhì)濃度，使用酶標(biāo)儀檢測蛋白質(zhì)量。SDS-PAGE參數(shù)：80 V 30 min，120 V 45 min；轉(zhuǎn)膜條件：300 mA 2 h。采用Western blotting檢測Pax7、Ki-67、MyHC、MyoG及內(nèi)參蛋白水平表達量，先將待測條帶裝入含有一抗的雜交袋中，4 ℃過夜孵育，取出后清洗5次，每次5 min，隨后孵育對應(yīng)二抗1 h，再次清洗5次，每次5 min，使用ECL發(fā)光液上機曝光[14-16]。

1.2.7 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，實時熒光定量PCR及Western blotting結(jié)果采用t檢驗進行分析，EdU染色結(jié)果采用卡方檢驗進行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 lnc721在牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化前后的表達量

收集增殖期、分化期第1、2、3天的牛骨骼肌衛(wèi)星細胞并提取RNA，通過實時熒光定量PCR分別檢測lnc721的時間序列表達量情況，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著時間的推進，lnc721的表達量逐漸升高，在分化期第2天，lnc721在牛骨骼肌衛(wèi)星細胞中的表達量開始極顯著升高(P<0.01)；在分化期第3天，表達量相較增殖期升高約4倍(P<0.01)。

①GM,牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖期；DM1、DM2、DM3,牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化1、2、3 d。②與GM期相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；ns，差異不顯著(P>0.05)

2.2 lnc721生物信息學(xué)分析及亞細胞定位

通過NCBI比對發(fā)現(xiàn)，lnc721位于18號染色體上，為未報道的lncRNA。CPC網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)，lnc721編碼潛能為―1.33129(圖2)。核質(zhì)分離試驗表明，lnc721在細胞核和細胞質(zhì)內(nèi)均有分布，主要位于細胞質(zhì)內(nèi)(圖3)。

圖2 CPC網(wǎng)站lnc721蛋白編碼能力預(yù)測

圖3 lnc721亞細胞定位檢測

2.3 干擾lnc721表達對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響

將lnc721的siRNAs(si-1、si-2、si-3)轉(zhuǎn)染進牛骨骼肌衛(wèi)星細胞中，收取增殖期細胞，通過實時熒光定量PCR檢測干擾lnc721在增殖期的表達量，結(jié)果見圖4。由圖4可知，與對照組相比，si-1、si-2、si-3均極顯著降低了lnc721的表達(P<0.01)，其中si-1效果最明顯。

與對照組(NC)相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；ns,差異不顯著(P>0.05)。下同

將lnc721的si-1轉(zhuǎn)染進牛骨骼肌衛(wèi)星細胞中，分別提取增殖期和分化期RNA進行實時熒光定量定量PCR檢測，結(jié)果見圖5。由圖5可知，si-1在細胞增殖期和分化期均極顯著或顯著下調(diào)了lnc721表達量(P<0.01；P<0.05)。進一步采用EdU染色試驗檢測增殖期細胞數(shù)量變化，結(jié)果見圖6。由圖6可知，與對照組相比，試驗組細胞數(shù)量明顯增多，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，EdU陽性細胞率顯著高于對照組(P<0.05)。采用實時熒光定量PCR和Western blotting方法檢測干擾lnc721對增殖標(biāo)志因子Ki-67和Pax7基因在mRNA及蛋白水平表達的影響，結(jié)果見圖7、8。由圖7、8可知，干擾lnc721后，Ki-67和Pax7基因mRNA表達量均極顯著上調(diào)(P<0.01)；Ki-67蛋白表達量變化不顯著(P>0.05)，Pax7蛋白表達量極顯著升高(P<0.01)。表明干擾lnc721可促進牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖。

圖5 siRNA對lnc721表達量的影響

A,EdU染色圖；B,EdU陽性細胞率統(tǒng)計圖

圖7 細胞增殖標(biāo)志因子mRNA表達水平

A，Western blotting曝光圖；B，Western blotting量化結(jié)果。圖10同

2.4 干擾lnc721表達對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化影響

將骨骼肌衛(wèi)星細胞進行成肌誘導(dǎo)分化，檢測干擾lnc721后對分化標(biāo)志因子MyHC和MyoG在mRNA及蛋白水平表達的影響，實時熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，干擾lnc721后MyHC和MyoG基因表達量均極顯著降低(P<0.01，圖9)；MyoG蛋白表達量變化不顯著(P>0.05)，但MyHC蛋白表達量極顯著降低(P<0.01，圖10)。提示干擾lnc721可以顯著抑制肌衛(wèi)星細胞的成肌分化進程。

圖9 細胞分化標(biāo)志因子mRNA表達水平

圖10 Western blotting檢測細胞分化標(biāo)志因子蛋白表達水平

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，許多l(xiāng)ncRNAs參與調(diào)控肌肉的生長發(fā)育，是影響骨骼肌功能的關(guān)鍵因子，而這些lncRNAs常常在骨骼肌細胞分化期內(nèi)展示出時序上升表達趨勢，如linc-MD1[17]、lncMyoD[18]、lncRNA-133a[19]等。本研究通過時序表達譜發(fā)現(xiàn)，在骨骼肌細胞分化第3天，lnc721表達量與增殖期相比高達4倍以上，故選取分化期第3天的細胞進行后續(xù)干擾試驗，且經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)分化期第3天的lnc721干擾模型對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化具有顯著的抑制作用。

亞細胞定位是決定lncRNA功能的關(guān)鍵，定位于細胞質(zhì)和細胞核中l(wèi)ncRNA發(fā)揮的功能大不相同。相較于細胞核定位的lncRNA,位于細胞質(zhì)中的lncRNA可影響mRNA的穩(wěn)定性[20-21]。另外，細胞質(zhì)定位的lncRNA通常吸附miRNA形成ceRNA以調(diào)節(jié)它們的活性和水平，影響蛋白質(zhì)翻譯后修飾等功能[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，lnc721在細胞核與細胞質(zhì)中均有分布，但主要定位于細胞質(zhì)中。Zhai等[25]研究發(fā)現(xiàn)，大部分的linc-RAM存在于肌肉細胞的細胞質(zhì)中，可通過調(diào)節(jié)PYGM活性促進肌肉細胞分化；Tan等[26]研究報道，定位于細胞質(zhì)的lncRNAG1430可作為ceRNA海綿吸附ssc_miR-133a-3p，從而促進豬的成肌細胞分化并抑制細胞增殖。本研究中的lnc721與以上研究的lncRNA亞細胞定位相同，推測lnc721可能發(fā)揮了某種細胞質(zhì)lncRNA功能，參與了對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的正調(diào)控及對其分化的負調(diào)控。

研究表明，設(shè)計過表達及干擾模型可檢測lncRNA在細胞增殖期和分化期的表達量水平[27]，而通過不同時期標(biāo)志因子的表達量檢測可以間接反映出目的基因?qū)ε９趋兰⌒l(wèi)星細胞的調(diào)控情況。如Ki-67、Pax7基因在細胞增殖期大量表達，可將其作為細胞增殖期標(biāo)志因子[28-29]。本研究中，干擾lnc721后發(fā)現(xiàn)，Ki-67、Pax7基因的表達量在轉(zhuǎn)錄組水平上均顯著上調(diào)，這與Chen等[12]發(fā)現(xiàn)的在干擾lnc23后可正調(diào)控牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的作用相一致；而在細胞周期退出、分化開始時期，MRFs家族基因發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其中MyoG基因參與調(diào)控肌細胞融合；MyHC基因作為骨骼肌內(nèi)粗肌絲的主要成分，在細胞分化后期大量表達[30-31]。本研究在干擾lnc721后，MyHC和MyoG基因表達量在轉(zhuǎn)錄組水平上均極顯著降低；在蛋白水平上MyHC表達量極顯著下調(diào)，即在牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化期呈現(xiàn)出的負調(diào)控作用，與Chen等[12]研究的干擾lnc23可抑制牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化的調(diào)控作用相一致，但與張俊星等[32]研究的干擾lncRNA135494可正調(diào)控牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化作用相反，推測其原因是由于不同基因具有不同的調(diào)控表達所致。此外，在對增殖標(biāo)志因子Ki-67和分化標(biāo)志因子MyoG的蛋白水平檢測時均出現(xiàn)了表達量變化不顯著的情況，其原因可能與這些標(biāo)志因子自身表達特性的影響相關(guān)，在基因翻譯階段受其他因素影響所致，但根據(jù)Pax7及MyHC蛋白水平的表達量結(jié)果可以看出，干擾lnc721具有促進牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖并抑制其分化的作用。

4 結(jié) 論

本研究通過轉(zhuǎn)染siRNA對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞中l(wèi)nc721進行干擾發(fā)現(xiàn)，干擾lnc721表達可以促進牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖并抑制其成肌分化過程，驗證了干擾lnc721表達在調(diào)控肌肉發(fā)育分化中的生物功能。