武亞南，石玉祥，張永英，劉冠慧，宋偉光，鐘翠紅，王永霞

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，邯鄲 056038;2.晨光生物科技有限公司，邯鄲 056038)

由于自身生理特點(diǎn)及現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖模式，肉雞極易發(fā)生熱應(yīng)激。熱應(yīng)激可引發(fā)肉雞心肌細(xì)胞氧化損傷,影響肉雞心臟的正常功能，降低肉雞生產(chǎn)性能，增加肉雞猝死綜合征和肉雞腹水綜合征的發(fā)病率，給肉雞養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。肉雞在高溫環(huán)境中，血液循環(huán)加快，心臟負(fù)擔(dān)加重，心肌細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)等代謝酶受高溫影響活性下降，引起氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡[3]。過(guò)量的氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，導(dǎo)致脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)大量積累，損傷線粒體膜和細(xì)胞膜[4]。此外，在熱應(yīng)激狀態(tài)下，心肌細(xì)胞線粒體的氧化磷酸化效率逐漸降低，鈣-腺苷三磷酸酶活性和鈣含量也降低，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換改變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì),激活凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3),引起心肌細(xì)胞損傷[5]。血紅素氧合酶-1(HO-1)過(guò)表達(dá)可通過(guò)穩(wěn)定線粒體膜和減少氧化產(chǎn)物生成緩解H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷[6]。陳洪博等[7]研究表明，熱應(yīng)激引起肉雞心肌細(xì)胞MDA含量增加，細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活性增強(qiáng),SOD活性顯著降低，心肌細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷。

核因子紅系2相關(guān)因子2(Nrf2)信號(hào)通路在細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮中樞調(diào)控作用[8],是治療心肌疾病、心功能障礙及抗心肌細(xì)胞氧化損傷的重要藥物靶點(diǎn)[9]。SIRT1(sirtuins家族中負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞蛋白質(zhì)去乙酰化的酶)通過(guò)調(diào)控Nrf2蛋白去乙?；せ頝rf2信號(hào)通路，促進(jìn)通路下游HO-1和NAD(P)H∶醌氧化還原酶1(NQO1)的表達(dá)，提高心肌細(xì)胞的抗氧化能力，減少LDH的釋放，減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧所造成的氧化損傷[10]。近年來(lái)，Nrf2信號(hào)通路調(diào)控?zé)釕?yīng)激誘導(dǎo)畜禽氧化損傷機(jī)制的研究也越來(lái)越多[11-12]。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn),姜黃素可通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路上調(diào)熱應(yīng)激肉雞肝臟中谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCLC)和HO-1基因的轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)肉雞抵抗熱應(yīng)激損傷的能力。王換換等[14]研究表明，高溫可激活奶牛肝臟Nrf2信號(hào)通路，上調(diào)HO-1、GCLC和NQO1基因表達(dá)，從而頡頏熱應(yīng)激誘導(dǎo)的奶牛肝臟氧化損傷。但鮮見(jiàn)有關(guān)激活Nrf2信號(hào)通路是否能夠緩解熱應(yīng)激誘導(dǎo)的肉雞心肌細(xì)胞氧化損傷的報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建肉雞心肌細(xì)胞熱應(yīng)激氧化損傷模型，用Nrf2特異性激活劑叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)預(yù)活化Nrf2，探索激活Nrf2信號(hào)通路對(duì)熱應(yīng)激肉雞心肌細(xì)胞氧化損傷的緩解作用，旨在為預(yù)防家禽熱應(yīng)激提供新思路和有效分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM/F12、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司；Ⅱ型膠原酶購(gòu)自上海源葉有限公司；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Brdu)、雙抗(青、鏈霉素)、TBHQ、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SOD、LDH、MDA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Nrf2和HO-1多克隆抗體購(gòu)自Proteintech Group,Inc.；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自Abcam公司；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒、HiScript Ⅲ型RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 原代心肌細(xì)胞的制備

參照秦士貞[15]方法制備肉雞原代心肌細(xì)胞。無(wú)菌取出10日齡肉雞雞胚的心臟，冷D-PBS洗3～5次，眼科剪剪碎心臟組織后，用冷D-PBS洗滌至透明。棄上清液，加約5倍體積于心臟組織的0.12%膠原酶Ⅱ，于37 ℃水浴鍋中消化8 min，第一次消化液棄之不用。再次加入消化液在同等條件下繼續(xù)消化8 min，將消化液轉(zhuǎn)移至另一無(wú)菌試管中并加入等量培養(yǎng)基終止消化。按照前述方法重復(fù)消化5～6次直至沒(méi)有明顯的組織塊。用500目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾2次，去除組織塊。收集所有消化液，800 r/min離心10 min，棄上清液，用培養(yǎng)基重懸。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行2次差速貼壁培養(yǎng)(差速貼壁時(shí)間為1.5 h)，去除成纖維細(xì)胞。用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞濃度。用含有5-Brdu的細(xì)胞培養(yǎng)基將心肌細(xì)胞稀釋至2.5×106/mL和2.5×104/mL(5-Brdu的終濃度是0.1 mmol/L，其作用是抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng))，分別接種于6孔板和96孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后換為不含5-Brdu的正常培養(yǎng)液，24 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液備用。

1.3 模型構(gòu)建

以43 ℃作為熱應(yīng)激溫度[16]，將接種于96孔板的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為5組，分別培養(yǎng)0、2、4、6、8 h，采用MTT法檢測(cè)肉雞心肌細(xì)胞相對(duì)活力，確定構(gòu)建熱應(yīng)激模型的時(shí)間。

1.4 試驗(yàn)分組與處理

另取生長(zhǎng)于96孔板和6孔板中的原代心肌細(xì)胞分別隨機(jī)分成3組：對(duì)照組，心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)不做處理；Nrf2激活劑+HS組(TBHQ+HS組)，棄去96孔板和6孔板中的舊培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，加入50 μmol/L TBHQ(以0.075%DMSO為溶劑，已驗(yàn)證DMSO<0.01%時(shí)對(duì)心肌細(xì)胞活力無(wú)影響[17])在正常培養(yǎng)條件下預(yù)處理12 h，然后同熱應(yīng)激組(HS)組同時(shí)轉(zhuǎn)移至43 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h。每組6個(gè)重復(fù)。96孔板用于心肌細(xì)胞相對(duì)活力測(cè)定，6孔板用于其余指標(biāo)的測(cè)定。

1.5 測(cè)定指標(biāo)

1.5.1 原代心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡下觀察比較各組心肌細(xì)胞形態(tài)。

1.5.2 原代心肌細(xì)胞相對(duì)活力 應(yīng)用MTT法檢測(cè)各組原代心肌細(xì)胞相對(duì)活力，于96孔板中小心吸取上清，加入90 μL新鮮培養(yǎng)基，再加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄上清，每孔加入110 μL DMSO，低速震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。用Thermo Scientific Multiskan Spectrum全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)490 nm處各孔的吸光值，計(jì)算公式如下：

細(xì)胞相對(duì)活力=(樣品D490 nm-本底D490 nm)/(對(duì)照D490 nm-本底D490 nm)

1.5.3 原代心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和氧化損傷指標(biāo) 用移液槍將孔中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至1.5 mL無(wú)菌離心管中，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，吸取培養(yǎng)液上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，用于測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH活性。PBS清洗3遍細(xì)胞，用細(xì)胞刮板刮取孔內(nèi)心肌細(xì)胞，再加入200 μL PBS，用超聲波破碎心肌細(xì)胞，用于測(cè)定心肌細(xì)胞SOD活性和MDA含量。

1.5.4 Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1 mRNA表達(dá)量 吸棄6孔板中的培養(yǎng)液，在孔內(nèi)加入Trizol提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)核酸測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度及純度，提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見(jiàn)表1。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

表1 引物信息

1.5.5 Nrf2總蛋白和HO-1蛋白表達(dá)水平 棄去6孔板中的培養(yǎng)液,加入裂解液在冰上裂解細(xì)胞，提取蛋白，以BCA法測(cè)定蛋白濃度。細(xì)胞樣品在100 ℃水浴中加熱4 min，以充分變性蛋白。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，Western Blotting檢測(cè)Nrf2總蛋白和HO-1蛋白表達(dá)水平：每孔上樣10 μg總蛋白，在SDS-PAGE中進(jìn)行電泳分離，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上；用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h后，加入一抗(Nrf2/HO-1多克隆抗體，1∶500)，室溫孵育1 h后，4 ℃過(guò)夜；用TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶10 000)室溫孵育1 h；TBST洗膜后，用ECL發(fā)光液檢測(cè)目標(biāo)蛋白條帶的光密度，采用ImageJ圖像分析軟件對(duì)樣品中目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析考查不同熱應(yīng)激時(shí)間對(duì)肉雞心肌細(xì)胞活力的影響及TBHQ對(duì)熱應(yīng)激肉雞原代心肌細(xì)胞活力、抗氧化能力及Nrf2信號(hào)通路相關(guān)抗氧化基因和蛋白表達(dá)的影響，差異顯著時(shí)進(jìn)行LSD多重比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 熱應(yīng)激作用時(shí)間對(duì)肉雞原代心肌細(xì)胞相對(duì)活力的影響

由圖1可知，高溫極顯著抑制肉雞原代心肌細(xì)胞活力(P<0.01)，熱應(yīng)激2 h可作為構(gòu)建熱應(yīng)激模型的最佳時(shí)間點(diǎn)。

**，與0 h相比差異極顯著(P<0.01)

2.2 TBHQ預(yù)處理對(duì)熱應(yīng)激肉雞原代心肌細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力和氧化損傷的影響

2.2.1 細(xì)胞形態(tài) 由圖2可知，對(duì)照組心肌細(xì)胞呈正常梭形(圖2A)，細(xì)胞密度較大；HS組心肌細(xì)胞體積變大且出現(xiàn)空泡網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖2C)，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少；TBHQ+HS組心肌細(xì)胞空泡網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯少于熱應(yīng)激組，大部分細(xì)胞形態(tài)呈正常梭形(圖2B)。

①A，對(duì)照組；B，TBHQ+HS組；C，HS組。②a1、a2、b1，正常梭形的心肌細(xì)胞；c1、c2、b2，有空泡網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的心肌細(xì)胞

2.2.2 原代心肌細(xì)胞相對(duì)活力 由圖3可知，與對(duì)照組相比，HS組心肌細(xì)胞相對(duì)活力極顯著下降(P<0.01)；與HS組相比，TBHQ+HS組心肌細(xì)胞相對(duì)活力顯著升高(P<0.05)。

與對(duì)照組相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。與HS組相比，#，差異顯著(P<0.05)；##，差異極顯著(P<0.01)。無(wú)標(biāo)記，差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2.3 原代心肌細(xì)胞SOD活性、MDA含量和細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性 由圖4可知，與對(duì)照組相比，HS組心肌細(xì)胞SOD活性極顯著降低(P<0.01)，MDA含量極顯著升高(P<0.01)，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性極顯著上升(P<0.01)；與HS組比較，TBHQ+HS組心肌細(xì)胞SOD活性極顯著升高(P<0.01)，MDA含量顯著下降(P<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性極顯著下降(P<0.01)。

圖4 各組肉雞原代心肌細(xì)胞SOD活性、MDA含量和細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性

2.3 TBHQ預(yù)處理對(duì)熱應(yīng)激肉雞原代心肌細(xì)胞Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1基因表達(dá)水平的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，HS組肉雞原代心肌細(xì)胞中Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與HS組比較，TBHQ+HS組肉雞原代心肌細(xì)胞中Nrf2 mRNA(P<0.05)和HO-1 mRNA的表達(dá)量極顯著增加(P<0.01)，而且Nrf2通路下游GCLC和NQO1 mRNA的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。

表2 各組心肌細(xì)胞Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1 mRNA表達(dá)量

2.4 TBHQ預(yù)處理對(duì)熱應(yīng)激肉雞原代心肌細(xì)胞Nrf2總蛋白和HO-1蛋白表達(dá)量的影響

由圖5可知，與對(duì)照組相比，HS組心肌細(xì)胞Nrf2總蛋白和HO-1蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)；與HS組比較，TBHQ+HS組心肌細(xì)胞Nrf2總蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，HO-1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。

圖5 各組心肌細(xì)胞Nrf2總蛋白和HO-1蛋白表達(dá)量

3 討 論

肉雞的正常體溫為39～40 ℃，但本研究所用原代心肌細(xì)胞取自10日齡肉雞雞胚，該日齡雞胚的最適孵化溫度為37～38 ℃，而且Xu等[18]研究表明，肉雞心肌細(xì)胞40 ℃熱應(yīng)激1 h即可在電鏡下觀察到自噬體，因此40 ℃不適合肉雞原代心肌細(xì)胞正常生長(zhǎng)，因此將37 ℃作為肉雞原代心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的最適溫度[19]。

持續(xù)高溫可誘導(dǎo)肉雞心肌細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，顯著降低心臟的細(xì)胞活力[20]。為確認(rèn)Nrf2通路預(yù)活化對(duì)熱應(yīng)激肉雞心肌細(xì)胞活力的作用，在細(xì)胞熱應(yīng)激之前加入TBHQ進(jìn)行預(yù)處理。結(jié)果顯示，相比于熱應(yīng)激組，TBHQ預(yù)處理可顯著提高熱應(yīng)激心肌細(xì)胞的活力。心肌細(xì)胞在持續(xù)熱應(yīng)激作用下會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的腫脹、變性[21]。本研究通過(guò)對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激不僅可導(dǎo)致肉雞原代心肌細(xì)胞腫脹，還會(huì)出現(xiàn)大量空泡網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而TBHQ預(yù)處理可顯著減少熱應(yīng)激心肌細(xì)胞中空泡網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

MDA是氧自由基引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物之一,可在一定程度上反映氧自由基對(duì)機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷程度[22]。SOD為機(jī)體內(nèi)抗氧化酶，能夠有效清除體內(nèi)的氧自由基，減輕氧自由基對(duì)心肌細(xì)胞膜的損傷[23]。LDH是心肌細(xì)胞損傷的標(biāo)志酶，是糖酵解途徑中重要的氧化還原酶，當(dāng)心肌細(xì)胞遭受氧化損傷后，細(xì)胞膜通透性改變，LDH從細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞外液中LDH活性顯著增強(qiáng)[24]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組心肌細(xì)胞MDA含量顯著增加，細(xì)胞外液LDH活性增加，SOD活性顯著降低，證明肉雞心肌細(xì)胞熱應(yīng)激氧化損傷模型構(gòu)建成功[25]。與熱應(yīng)激模型組相比，TBHQ預(yù)處理能顯著提高熱應(yīng)激心肌細(xì)胞SOD活性，減少M(fèi)DA含量，減輕心肌細(xì)胞內(nèi)LDH的外流，從而減輕熱應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的氧化損傷。劉輝等[17]研究表明，通過(guò)TBHQ激活Nrf2信號(hào)通路可以頡頏氯化鈷誘發(fā)的化學(xué)性缺氧對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，提高心肌細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力。本研究與其結(jié)果基本一致，不同之處在于心肌細(xì)胞種屬不同，氧化損傷的誘因不同。

Nrf2是一種核轉(zhuǎn)錄因子，負(fù)責(zé)調(diào)控動(dòng)物抗氧化酶類(lèi)的轉(zhuǎn)錄表達(dá),屬于CNC(Cap‘n’Collar)-bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族。Keap1是一種富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，被錨定于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。抗氧化反應(yīng)元件(ARE)是一種介導(dǎo)HO-1、NQO1、GCLC等酶類(lèi)的順式轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。在正常情況下，Keap1與Nrf2形成異二聚體并促進(jìn)泛素-蛋白酶對(duì)Nrf2的降解作用，因此細(xì)胞內(nèi)游離Nrf2含量很低。在親電試劑或應(yīng)激原刺激下，Keap1蛋白的半胱氨酸殘基被修飾而構(gòu)象改變，Nrf2從Keap1釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與ARE結(jié)合并激活靶基因HO-1、GCLC、NQO1及Nrf2自身的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制[26-27]。HO-1蛋白即熱休克蛋白32[28]，是Nrf2信號(hào)通路調(diào)控的下游抗氧化酶之一，可將血紅素降解為膽綠素、一氧化碳(CO)和亞鐵，隨后膽綠素被進(jìn)一步還原為膽紅素，膽綠素與膽紅素是機(jī)體內(nèi)源性的強(qiáng)抗氧化劑，可抑制細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，清除氧自由基，直接發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的效應(yīng)[29-30]。以上研究結(jié)果說(shuō)明，靶向調(diào)控Nrf2蛋白及下游抗氧化酶HO-1也許能減輕熱應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷。

TBHQ是一種人工合成的酚型強(qiáng)抗氧化劑和Nrf2激活劑，可通過(guò)自身抗氧化性和誘導(dǎo)Nrf2通路下游抗氧化酶的合成來(lái)減輕氧自由基對(duì)機(jī)體造成的損傷。目前認(rèn)為T(mén)BHQ的抗氧化作用主要通過(guò)以下兩種途徑實(shí)現(xiàn):①TBHQ本身可在體內(nèi)通過(guò)醌促或非醌促氧化反應(yīng)形成半醌，再轉(zhuǎn)化成醌，通過(guò)氧化還原循環(huán)來(lái)降低體內(nèi)氧自由基的含量[31];②TBHQ是經(jīng)典內(nèi)源性抗氧化Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路的特異性激活劑，其機(jī)制為T(mén)BHQ修飾Keap1的CYS 151半胱氨酸殘基，改變Keap1-Nrf2二聚體的構(gòu)象，使Nrf2免受Keap1介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體降解，Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中富集，多余的Nrf2在核輸入蛋白的引導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)胞核與ARE啟動(dòng)子結(jié)合，啟動(dòng)抗氧化基因和解毒酶基因及Nrf2自身的轉(zhuǎn)錄翻譯[32]。TBHQ作為公認(rèn)的Nrf2激活劑，通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路上調(diào)通路下游抗氧化酶HO-1等基因的表達(dá)緩解亞砷酸鈉致胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[33]，還可激活人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Nrf2/ARE信號(hào)通路，上調(diào)通路下游NQO1的表達(dá)，進(jìn)而增加SOD的活性，降低MDA含量，緩解尿毒癥患者主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[34]，以及調(diào)控牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)，頡頏氧化應(yīng)激[35]。以上研究結(jié)果均表明，TBHQ主要是通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用。這提示TBHQ對(duì)熱應(yīng)激肉雞原代心肌細(xì)胞的保護(hù)作用可能也是通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路進(jìn)而上調(diào)下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。本研究的實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激可上調(diào)Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)水平，但Nrf2總蛋白和HO-1蛋白表達(dá)無(wú)顯著增加，不足以頡頏熱應(yīng)激誘導(dǎo)的氧化損傷。與熱應(yīng)激組相比，用TBHQ預(yù)處理后再進(jìn)行熱應(yīng)激，肉雞心肌細(xì)胞GCLC、NQO1、Nrf2、HO-1 mRNA呈一致性誘導(dǎo)表達(dá)增多，且Nrf2總蛋白和HO-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，表明TBHQ預(yù)處理可增加熱應(yīng)激肉雞原代心肌細(xì)胞中Nrf2的含量和活性，使處于熱應(yīng)激狀態(tài)的肉雞原代心肌細(xì)胞有足夠的Nrf2蛋白進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與抗氧化基因的ARE啟動(dòng)子結(jié)合，啟動(dòng)抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)，頡頏熱應(yīng)激誘導(dǎo)的肉雞心肌細(xì)胞氧化損傷，提示Nrf2可能是調(diào)節(jié)肉雞心臟抗氧化損傷的關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)[36]。

綜上所述，Nrf2激活劑TBHQ可通過(guò)激活肉雞心肌細(xì)胞Nrf2/ARE信號(hào)通路使Nrf2蛋白表達(dá)增加，進(jìn)而上調(diào)Nrf2信號(hào)通路下游抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄活性及抗氧化HO-1蛋白表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)肉雞心肌細(xì)胞遭受熱應(yīng)激時(shí)的抗氧化能力，緩解熱應(yīng)激誘導(dǎo)的肉雞心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激，頡頏心肌細(xì)胞氧化損傷。

本研究初步探索了活化Nrf2/ARE信號(hào)通路緩解熱應(yīng)激肉雞心肌細(xì)胞氧化損傷的相關(guān)分子靶點(diǎn)，有利于更好地認(rèn)識(shí)肉雞心臟抗氧化損傷機(jī)制，為預(yù)防熱應(yīng)激致肉雞心臟損傷提供了理論依據(jù)。但應(yīng)認(rèn)識(shí)到Nrf2的持續(xù)激活也可能會(huì)對(duì)機(jī)體造成不良后果，且信號(hào)通路并不是單獨(dú)發(fā)揮作用，各信號(hào)通路之間會(huì)交叉串?dāng)_，例如Nrf2/ARE信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路。綜合考慮各信號(hào)通路對(duì)抗氧化機(jī)制的影響是未來(lái)畜禽熱應(yīng)激防控研究的方向。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，熱應(yīng)激可激活肉雞心肌細(xì)胞抗氧化損傷機(jī)制Nrf2/ARE信號(hào)通路，但不足以頡頏熱應(yīng)激誘導(dǎo)的氧化損傷。采用Nrf2激活劑TBHQ增加心肌細(xì)胞Nrf2總蛋白含量可以上調(diào)Nrf2/ARE信號(hào)通路下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄及抗氧化蛋白的表達(dá)，顯著降低氧化損傷指標(biāo)，進(jìn)一步提高肉雞心肌抗氧化能力。因此，采取措施適當(dāng)增加Nrf2蛋白的表達(dá)能起到保護(hù)肉雞心臟、緩解熱應(yīng)激致肉雞心臟氧化損傷的作用。本試驗(yàn)結(jié)果可為預(yù)防肉雞熱應(yīng)激提供新的思路和有效分子靶點(diǎn)。