張晴 楊素清 安月鵬

銀屑病是一種受多基因背景調(diào)控決定且由T淋巴細(xì)胞(thymus，T)介導(dǎo)的免疫性皮膚疾病[1]，隨著銀屑病機(jī)制研究的不斷深入，其相關(guān)T細(xì)胞機(jī)制的探索已從既往的輔助性T細(xì)胞1(helper T cell 1，Th1)/輔助性T細(xì)胞2(helper T cell 2，Th2)失衡逐漸轉(zhuǎn)向輔助性T細(xì)胞17(helper T cell 17，Th17)/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)失衡[2]，同時(shí)對(duì)于濾泡性輔助性T細(xì)胞(follicular helper T cell，Tfh)[3]及記憶性T細(xì)胞[4]等的研究亦不斷延伸。其中研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并受到Th17細(xì)胞的反饋調(diào)節(jié)作用，且銀屑病中以Th17細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)地位，Treg細(xì)胞占弱勢(shì)地位[5]。本次研究擬通過(guò)對(duì)Treg細(xì)胞表面血細(xì)胞簇分化抗原4(cluster differentiation 4，CD4+)、血細(xì)胞簇分化抗原25(cluster differentiation 25，CD25+)、叉頭框蛋白3(forkhead box p 3，F(xiàn)oxp3+)作為標(biāo)記物[6]，探索銀屑病模型鼠外周血中Treg細(xì)胞的表達(dá)情況，并檢測(cè)主要分泌因子白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)的水平，同時(shí)對(duì)其與模型鼠皮損指數(shù)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，從而發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方制劑蜈蚣敗毒飲的作用靶點(diǎn)，結(jié)合課題組前期對(duì)于Th17細(xì)胞的研究成果[7]，有助于挖掘Th17/Treg細(xì)胞平衡在銀屑病治療中的動(dòng)態(tài)作用，為基于中醫(yī)“毒”“瘀”理論的臨床辨治提供佐證和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠(雌雄各半，清潔級(jí)，4～6周，體質(zhì)量為120～160 g，鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK20190001)，實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)情況良好，溫度保持在20～25℃之間，相對(duì)濕度保持在40%～60%之間。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

甲氨蝶呤片(上海上藥信宜藥廠有限公司，批號(hào)：190510，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H31020644，規(guī)格2.5 mg×16片)；咪喹莫特乳膏62.5 mg(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：200611，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20030128，規(guī)格12.5 mg∶0.25 g)；生理鹽水(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)，批號(hào)：20101722，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H23023525，規(guī)格100 mL∶0.9g)；蜈蚣敗毒飲(蜈蚣3 g、紫草30 g、土茯苓30 g、鬼箭羽30 g、烏梢蛇20 g、甘草10 g、藥物來(lái)自于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診草藥局)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

低溫離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司，型號(hào)：ST8/8R)；電子天平(梅特勒-托利多公司，型號(hào)：ME104E)；呼吸麻醉機(jī)(上海玉研科學(xué)儀器公司，型號(hào)：Y1001410002)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)碧迪醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：FACSCalibur)；Flowjo10軟件(優(yōu)寧維公司，型號(hào)：V10)；血細(xì)胞簇分化抗原4(上海睿鉑賽生物科技有限公司，批號(hào)：B245875)；血細(xì)胞簇分化抗原25(上海睿鉑賽生物科技有限公司，批號(hào)：B228817)；叉頭框蛋白3(上海睿鉑賽生物科技有限公司，批號(hào)：B204163)；大鼠白細(xì)胞介素10酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：ML002813)；大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：ML002856)；紅細(xì)胞裂解液(美倫公司，批號(hào)：MA0207)；磷酸鹽平衡生理鹽水(美倫公司，批號(hào)：MA0016)；4%多聚甲醛(上海易匯生物科技有限公司，批號(hào)：BL539A)；聚氧乙烯單叔辛基苯基醚(上海橋星貿(mào)易有限公司，批號(hào)：1139ML100)；無(wú)菌去離子水(美倫公司，批號(hào)：MA0028)；肝素鈉(湖北鑫潤(rùn)德化工有限公司，批號(hào)：9041-08-1)。

1.4 藥液制備

中藥復(fù)方制劑蜈蚣敗毒飲以常規(guī)的煎煮方法煎煮兩次，將兩次煎煮好的藥液混勻，通過(guò)大鼠與成年人的體表面積等效劑量換算，形成最終濃度分別為0.554 g/mL、1.107 g/mL、2.214 g/mL的蜈蚣敗毒飲低劑量組、中劑量組、高劑量組的濃縮液，通過(guò)換算可知，其濃度分別相當(dāng)于70 kg成年人常規(guī)用量的0.5倍、1倍、2倍。西藥甲氨蝶呤片經(jīng)大鼠與成年人的體表面積等效劑量換算，甲氨蝶呤片最終配置成濃度為0.023 mg/mL的甲氨蝶呤混懸液，其濃度相當(dāng)于70 kg成年人常規(guī)用量的1倍。生理鹽水無(wú)需特殊制備。

1.5 分組、造模及給藥

將30只SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組5只，分別為空白組、模型組、甲氨蝶呤西藥對(duì)照組(西藥組)、蜈蚣敗毒飲中藥低劑量組(低劑量組)、蜈蚣敗毒飲中藥中劑量組(中劑量組)、蜈蚣敗毒飲中藥高劑量組(高劑量組)。除空白組外，其余各組大鼠均用動(dòng)物電推剪將其背部約2～3 cm區(qū)域的毛剔除備皮，每日局部涂抹5%的咪喹莫特乳膏62.5 mg，每日1次，連續(xù)8天。

各組大鼠分別在造模完成后進(jìn)行上述藥液灌胃，頻次和劑量均為2 mL/(200g·d)，分成每日早晚兩次灌胃。其中蜈蚣敗毒飲各劑量組以相應(yīng)濃度的蜈蚣敗毒飲濃縮液灌胃8天，空白組和模型組以生理鹽水灌胃8天，西藥組在灌胃時(shí)，前4天以甲氨蝶呤混懸液灌胃，后4天以生理鹽水灌胃(注：如此方法符合甲氨蝶呤藥物在臨床中的服用方法[8])。

1.6 皮損觀察

在國(guó)際公認(rèn)的人類銀屑病皮損面積和嚴(yán)重指數(shù)評(píng)分(psoriasis area and severity index，PASI)[9]的基礎(chǔ)上，結(jié)合大鼠與人類相比較獨(dú)特的尾部結(jié)構(gòu)及大鼠與人體各部位體表面積分布的不同，對(duì)PASI評(píng)分法進(jìn)行改良，形成評(píng)價(jià)銀屑病模型的鼠銀屑病皮損面積和嚴(yán)重指數(shù)評(píng)分(mice psoriasis area and severity index，MPASI)評(píng)分法，MPASI評(píng)分法將鼠分為頭部、上肢、軀干、下肢、尾部共5個(gè)部分，每個(gè)部分分別占總體表面積的20%、10%、50%、10%、10%，再通過(guò)類似于PASI的計(jì)算方法，以此來(lái)評(píng)價(jià)銀屑病鼠模型的皮損面積和嚴(yán)重指數(shù)。因此，課題組通過(guò)MPASI評(píng)分法對(duì)銀屑病鼠造模完成后即灌胃前的皮損指數(shù)，及灌胃后的皮損指數(shù)進(jìn)行分別觀察評(píng)價(jià)，并計(jì)算出在灌胃8天內(nèi)，除空白組外其余各銀屑病鼠的皮損指數(shù)變化量(△MPASI)?！鱉PASI=MPASI灌胃前-MPASI灌胃后。

1.7 含藥血清制備

在灌胃給藥及皮損指數(shù)觀察結(jié)束后，采用呼吸麻醉機(jī)對(duì)各大鼠進(jìn)行麻醉，而后將其固定在手術(shù)臺(tái)上，在無(wú)菌的環(huán)境中對(duì)大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血8 mL，血液置于肝素鈉的真空采血管當(dāng)中，經(jīng)混勻、離心后制備成含藥的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，部分血清于2小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)的檢測(cè)，余血清保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 血清指標(biāo)檢測(cè)

流式細(xì)胞法檢測(cè)Treg的表達(dá)時(shí)，各大鼠取新鮮的抗凝血后，以400～500 g離心5分鐘，離心后棄上清液；將10×紅細(xì)胞裂解液以離子水稀釋至1×的工作液，再加入6～10倍細(xì)胞體積的1×紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1～2分鐘；以400～500 g離心5分鐘，4℃離心后棄上清液；洗滌：加入磷酸鹽平衡生理鹽水(phosphate buffered saline，PBS)緩沖液，重懸沉淀，以400～500 g離心2～3分鐘，離心后棄上清液，重復(fù)1次，共洗滌2次；加入100 μL的PBS緩沖液，按照說(shuō)明書(shū)用量加入CD4+和CD25+抗體各5 μL，4℃避光孵育30分鐘；加入100 μL的4%多聚甲醛，重懸沉淀，經(jīng)室溫固定10分鐘，再以400～500 g離心2～3分鐘，離心后棄上清液；洗滌2次：加入100 μL的PBS緩沖液，重懸沉淀，以400～500 g離心2～3分鐘，離心后棄上清液；加入0.1%的聚氧乙烯單叔辛基苯基醚，重懸沉淀，破膜5分鐘，以400～500g離心2～3分鐘，離心后棄上清液；按照說(shuō)明書(shū)加入5 μL的Foxp3+抗體，以4℃避光染色30分鐘；向染色后的離心管中加入300 μL的PBS緩沖，混勻后進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)；以CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞表示Treg細(xì)胞數(shù)目，以CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比表示Treg細(xì)胞所占的比值，采用Flowjo10軟件進(jìn)行分析，從而對(duì)Treg的細(xì)胞表達(dá)情況進(jìn)行評(píng)估。酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)IL-10、TGF-β的含量時(shí)，將大鼠的全血樣本進(jìn)行離心，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，除空白組外加酶處理，分別進(jìn)行溫育、洗滌、顯色，最后終止反應(yīng)，以空白孔凋零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)定各個(gè)孔的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出各因子的濃度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 銀屑病鼠MPASI比較

灌胃后蜈蚣敗毒飲各劑量組及西藥組的皮損指數(shù)均有不同程度的下降(P<0.05)，尤以西藥組和高劑量組的下降程度最為顯著(P<0.05)，且二者的作用相似，具體見(jiàn)表1。

表1 銀屑病鼠灌胃前后皮損指數(shù)比較分)

2.2 銀屑病鼠外周血Treg細(xì)胞表達(dá)比較

不同組別銀屑病鼠外周血中Treg的細(xì)胞數(shù)均有不同程度的下降(P<0.05)，以模型組及低、中劑量組最為顯著，灌胃后西藥組和高劑量組外周血中Treg的細(xì)胞數(shù)相對(duì)較高，具體見(jiàn)表2及圖1。

注：A 空白組；B 模型組；C 西藥組；D 低劑量組；E 中劑量組；F 高劑量組；

表2 各組銀屑病鼠外周血Treg細(xì)胞表達(dá)比較

2.3 銀屑病鼠Treg細(xì)胞分泌因子IL-10、TGF-β比較

銀屑病模型組大鼠的IL-10、TGF-β含量明顯下降(P<0.05)，灌胃后西藥組和高劑量組可顯著上調(diào)二者的水平(P<0.05)，且低劑量組對(duì)TGF-β亦具有顯著的上調(diào)作用(P<0.05)，具體見(jiàn)表3。

表3 Treg細(xì)胞分泌因子IL-10、TGF-β含量比較

2.4 Treg細(xì)胞及分泌因子與△MPASI的相關(guān)性比較

通過(guò)對(duì)除空白組外的所有25只大鼠進(jìn)行整體評(píng)估，分析Treg細(xì)胞相關(guān)通路指標(biāo)與皮損情況的相關(guān)性，可以看出，灌胃后的大鼠Treg細(xì)胞數(shù)、IL-10含量、TGF-β含量與灌胃前后皮損指數(shù)變化量之間均存在正相關(guān)(P<0.05)，具體見(jiàn)表4及圖2～4。

表4 Treg細(xì)胞表達(dá)與△MPASI的相關(guān)性比較

圖2 Treg細(xì)胞與△MPASI的回歸曲線圖

3 討論

Treg細(xì)胞稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，于1995年被首次發(fā)現(xiàn)[10]，是一類能夠調(diào)控自身免疫反應(yīng)的T細(xì)胞亞群，其主要可以分為兩大類，其一為天然形成的自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，主要來(lái)源于胸腺；其二為通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，主要由外周成熟的T淋巴細(xì)胞在持續(xù)的抗原刺激誘導(dǎo)下所產(chǎn)生，二者均與人體的自身免疫性疾病密切相關(guān)[11]。Treg細(xì)胞的表面標(biāo)記物目前公認(rèn)的有CD4+、CD25+、Foxp3+，有學(xué)者認(rèn)為血細(xì)胞簇分化抗原127(cluster differentiation 127，CD127+)也可以作為區(qū)分Treg細(xì)胞的重要標(biāo)志物之一，其在Treg細(xì)胞表面不表達(dá)或弱表達(dá)[12]。Treg細(xì)胞主要經(jīng)T細(xì)胞受體和白細(xì)胞介素2(interleukin-2，IL-2)因子的刺激，在信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白5(signal transducer and activator of transcription 5，STAT5)和Foxp3的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用下，通過(guò)分泌IL-10、白細(xì)胞介素35(interleukin-35，IL-35)、TGF-β等細(xì)胞因子，減少相關(guān)炎癥因子的釋放，抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的活化和增殖等功能，從而下調(diào)機(jī)體對(duì)于各種外來(lái)抗原或自身抗原的應(yīng)答水平，發(fā)揮維持機(jī)體免疫耐受的功效[13-14]。有研究表明[15]，銀屑病患者外周血中的Treg細(xì)胞的數(shù)目和功能明顯低于正常人，且在一定程度上受腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞介素23(interleukin-23，IL-23)及趨化因子5(chemotactic cytokines receptor 5，CCR5)的調(diào)控作用，同時(shí)，Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞之間存在著動(dòng)態(tài)平衡作用，通過(guò)血細(xì)胞簇分化抗原18(cluster differentiation 18，CD18)、整合素等的調(diào)節(jié)，使得發(fā)生偏向于Th17細(xì)胞的失衡反應(yīng)，從而加重銀屑病患者的皮損狀態(tài)[16]。

圖3 IL-10與△MPASI的回歸曲線圖

圖4 TGF-β與△MPASI的回歸曲線圖

課題組前期應(yīng)用中藥制劑蜈蚣敗毒飲在臨床及圍繞Th1、Th2、Th17細(xì)胞等的實(shí)驗(yàn)研究方面取得了較為豐富的研究成果[17-18]，并且發(fā)現(xiàn)蜈蚣敗毒飲可以干預(yù)T細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡從而干預(yù)銀屑病的發(fā)生和發(fā)展。因此，本次研究將其應(yīng)用于T細(xì)胞的另一分支Treg細(xì)胞的機(jī)制研究中來(lái)，蜈蚣敗毒飲由蜈蚣、紫草、土茯苓、鬼箭羽、烏梢蛇、甘草等藥物組成，其立方依據(jù)體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)從“毒”和“瘀”辨治銀屑病的理論特色。蜈蚣、烏梢蛇，一者熄風(fēng)毒，化絡(luò)瘀，再者可發(fā)揮蟲(chóng)類藥以毒攻毒之效；紫草，清熱毒，散瘀血；土茯苓，除濕毒，利關(guān)節(jié)；鬼箭羽，化瘀毒，通經(jīng)絡(luò)；甘草，解百毒，和藥性。在組方配伍方面，充分體現(xiàn)了解毒化瘀法在銀屑病辨治中的有效性。

在本次實(shí)驗(yàn)研究中，分別圍繞銀屑病鼠模型的皮損指數(shù)和外周血中Treg及其分泌因子IL-10、TGF-β的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)對(duì)指標(biāo)與皮損之間相關(guān)性進(jìn)行了分析。在皮損指數(shù)方面，灌胃后各藥物組的皮損指數(shù)均有不同程度的下降，同時(shí)灌胃前后皮損指數(shù)的變化量亦表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，療效依次為西藥組≈高劑量組>中劑量組>低劑量組，呈現(xiàn)一定的量效依賴關(guān)系。在外周血Treg的表達(dá)方面，通過(guò)提取PBMC，以細(xì)胞標(biāo)記物CD4+CD25+Foxp3+進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，得出各組樣本中Treg細(xì)胞的數(shù)目和所占CD4+T細(xì)胞的百分比。從結(jié)果可以看出:經(jīng)咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病鼠模型血清中的Treg細(xì)胞數(shù)目均有不同程度的下降，以模型組、低劑量組、中劑量組下降程度最為顯著，而西藥組和高劑量組下降程度略低，說(shuō)明高劑量的中藥制劑可有效改善Treg細(xì)胞的低水平，在對(duì)Treg細(xì)胞主要分泌因子IL-10、TGF-β的檢測(cè)中也可以發(fā)現(xiàn)，高劑量組和西藥組可以顯著緩解因銀屑病所導(dǎo)致的因子抑制狀態(tài)，增加血清中兩種分泌因子的相對(duì)量。同時(shí)，通過(guò)對(duì)灌胃后Treg細(xì)胞數(shù)、IL-10、TGF-β與大鼠灌胃前后皮損指數(shù)變化量(△MPASI)進(jìn)行相關(guān)性分析可知，Treg細(xì)胞數(shù)目越高，IL-10和TGF-β的表達(dá)越高，△MPASI的值越大，說(shuō)明皮損緩解程度越好，反之，灌胃后的Treg細(xì)胞數(shù)目越低，IL-10和TGF-β的分泌量則越少，△MPASI的值越小，說(shuō)明皮損緩解程度越差，二者呈顯著的正相關(guān)。

可以看出，蜈蚣敗毒飲能夠調(diào)控外周血中Treg細(xì)胞，達(dá)到恢復(fù)Th17/Treg細(xì)胞平衡，緩解銀屑病皮損的目的，在微觀層面上揭示了中藥的作用機(jī)制，結(jié)合前期對(duì)于蜈蚣敗毒飲的研究，從而產(chǎn)生多靶點(diǎn)效應(yīng)的干預(yù)效應(yīng)[19]。后期可針對(duì)T細(xì)胞亞群間的多因子、多通路的細(xì)胞間機(jī)制進(jìn)一步探索，為基于“毒”“瘀”理論辨治銀屑病提供依據(jù)和佐證。