趙澤 左禧萌 汪唐順 劉潔麗 楊臻瑞 高爽 孫萍 馮雪 王玉坤 史曉光

肉芽腫小葉性乳腺炎為一種發(fā)病原因不明的乳腺良性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為突發(fā)的乳房紅腫熱痛、迅速破潰流膿，形成竇道，且反復(fù)遷延不愈，難以治療。這種疾病的病理臨床表現(xiàn)主要為以乳腺小葉為中心的非干酪樣壞死，主要病理變化為生成肉芽腫病灶[1]。該疾病的主要治療方式目前為激素[2]治療、免疫抑制劑[3]治療及手術(shù)[4]治療等，但療效參差不齊且均存在一定副作用，尋找更為合適的治療方式仍為研究重點(diǎn)。中醫(yī)藥盡管作用時間相較糖皮質(zhì)激素及手術(shù)治療更長，且具有副作用小、減少乳房損毀等優(yōu)點(diǎn)，但針對肉芽腫小葉性乳腺炎的中醫(yī)理論繁多[5-7]，且藥物各異。因此，從現(xiàn)有中醫(yī)藥中篩選合適的藥物參與對肉芽腫小葉性乳腺炎的治療仍具有必要性。

托里透膿湯出自《醫(yī)宗金鑒》卷六十三，為托毒潰膿之劑，主治正虛不能托毒、內(nèi)已成膿、外不易潰、漫腫無頭之癰瘍，為外科托法中的著名方劑。由補(bǔ)益氣血和透膿的藥物組成，在既往研究中被廣泛應(yīng)用于難治性褥瘡[8]、肛周膿腫[9]、坐骨直腸窩膿腫[10]等難治性瘡瘍上?？紤]到該病臨床表現(xiàn)符合托里透膿湯適用證型，且在既往臨床肉芽腫小葉性乳腺炎治療中有一定療效[11]，本研究擬通過動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雌性SD大鼠20只，體質(zhì)量350～450 g，周齡不限，有孕產(chǎn)史，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，常規(guī)飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院動物倫理委員會審批許可，倫理號：20-48。

1.2 藥物與試劑

托里透膿湯，處方：人參10 g、白術(shù)10 g、王不留行15 g、白芷10 g、升麻10 g、甘草 6 g、當(dāng)歸10 g、黃芪15 g、皂角刺10 g、醋青皮6 g。以上中藥采用北京康仁堂藥業(yè)有限公司制備的配方顆粒劑型。

完全弗氏佐劑(sigma，美國)，IL-18酶聯(lián)免疫吸附測定(ezyme linted immunosorbent assay, elisa)試劑盒(proteintech，中國)，caspase-1兔一抗、GSDMD兔一抗、IL-18兔一抗、IL-1β兔一抗、a-tublin兔一抗、山羊抗兔IgG(H+L)(SA00001-2，proteintech，中國)，蛋白酶抑制劑cocktail、RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、5×loading buffer(索萊寶，中國)，10 %SDS-PAGE凝膠試劑盒(雅酶，中國)。

1.3 造模與分組

參照《肉芽腫小葉性乳腺炎動物模型初探討》中方式構(gòu)建動物模型：將人肉芽腫小葉性乳腺炎標(biāo)本組織稱重、人工研磨至無明顯大顆粒，置于于冰上，與生理鹽水比例為1∶3進(jìn)行超聲勻漿。勻漿12000 r/min離心，取上清液與完全弗氏佐劑按1∶1體積乳化備用[12]。3%戊巴比妥溶液，30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。麻醉后固定于木板上，第3、4對乳房剔除毛發(fā)，用75%酒精消毒皮膚。鑷子提起乳頭，用接種注射器，將制備好的油包乳混懸液、生理鹽水各0.2 mL分組沿乳頭注入大鼠第3對、4對乳腺內(nèi)，即可完成人工種植包埋過程。次日進(jìn)入給藥流程。

空白組、模型組、西藥組(糖皮質(zhì)激素組)、托里透膿湯組，每組各五只。除空白組外，其余大鼠均進(jìn)行肉芽腫小葉性乳腺炎造模。

1.4 給藥劑量

造模完成后第二日開始給藥流程。托里透膿湯用量按人鼠體表面積換算為成人一日劑量的6倍，蒸餾水配制為終濃度10 mg/mL，灌胃2 mL，每日一次；西藥即醋酸潑尼松，按人鼠體表面積換算為10 mg/kg灌胃，每日一次；模型組及空白組灌服等量蒸餾水，每日一次。給藥21日后取材。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 組織病理學(xué)檢測 頸椎脫臼處死所有大鼠，將大鼠第3、4對乳腺組織及乳腺周圍皮膚剝離，取其中1個乳腺福爾馬林溶液固定。常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片厚度為4 μm，運(yùn)用HE染色及雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)免疫組化染色。

1.5.2 炎癥因子檢測 腹主動脈取血常溫凝血15分鐘，3000 r/分鐘，離心15分鐘，取上層血清。Elisa法進(jìn)行白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-18檢測。

1.5.3 組織勻漿檢測 組織稱重后加入含蛋白酶抑制劑cocktail的RIPA裂解液，組織∶裂解液=1∶10，剪碎至無明顯大顆粒，超聲儀超聲10秒，冰上裂解30分鐘。12000 r/分鐘離心裂解液收集上清，BCA法蛋白定量后將蛋白濃度調(diào)至5 μg/uL，加5× loading buffer，沸水煮10分鐘。SDS-PAGE凝膠電泳(100 V，1小時30分鐘)，每泳道上樣50 μg，轉(zhuǎn)膜至NC膜(200 mA，1小時30分鐘)。5%脫脂牛奶室溫封閉1小時，一抗4℃孵育過夜，濃度：IL-18(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)、半胱胺蛋白酶-1(caspase-1，1∶1 000)、消皮素-D(Gasdermin-D，GSDMD，1∶1 0000)。隔日室溫下二抗(1∶10 000)，孵育1小時，用 Image QuantTmlAS-4000Mini Imager攝圖，ImageJ 180量化。

1.5.4 其他一般指標(biāo)檢測 使用游標(biāo)卡尺測量大鼠第3對、第4對乳腺直徑，并測量大鼠體重，每日一次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 托里透膿湯對肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠一般體征的影響

給藥第21天，與空白組比較，肉芽腫小葉性乳腺炎模型組的乳腺直徑顯著增加(P<0.001)，體質(zhì)量無明顯變化，提示肉芽腫小葉性乳腺炎使乳腺組織總體積增加；與模型組相比，西藥組及托里透膿湯組乳腺直徑顯著減小(P<0.001)，西藥組體質(zhì)量無明顯變化，托里透膿湯組體質(zhì)量明顯增加(P<0.01)，具體見表1～2。

表1 不同時間糖皮質(zhì)激素及托里透膿湯對肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠乳腺直徑的影響

2.2 托里透膿湯對肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠乳腺組織病理學(xué)的影響

空白組乳腺小葉結(jié)構(gòu)清晰，組織結(jié)構(gòu)層次完整，可見乳腺大導(dǎo)管的上皮樣增生，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤及其他改變；模型組可見大量嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤，導(dǎo)管內(nèi)大量物質(zhì)潴留，乳腺小葉結(jié)構(gòu)消失，伴膿腫形成及大量脂質(zhì)空泡，邊界不清；西藥組可見乳腺小葉結(jié)構(gòu)存在，炎細(xì)胞浸潤不明顯；托里透膿湯組可見膿腫邊界清晰，膿腫內(nèi)主要成分為多核巨細(xì)胞，膿腫外較模型組炎癥細(xì)胞浸潤較少。見圖1。

注：A空白組，B模型組，C西藥組，D托里透膿湯組。

2.3 托里透膿湯對肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠乳腺組織ER、PR表達(dá)的影響

與模型組相比，空白組、西藥組、托里透膿湯組相較模型組乳腺組織的ER表達(dá)增加，棕黃色陽性染色面積更高，其主要原因?yàn)橥暾橄俳M織量的不同；空白組、托里透膿湯組相較模型組PR表達(dá)增加，棕黃色陽性染色面積更高。見表3、圖2。

表2 不同時間糖皮質(zhì)激素及托里透膿湯對肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠體重的影響

表3 各組肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠ER、PR面積陽性占比的比較

注：A空白組陰性對照，B空白組ER，C空白組PR；D模型組陰性對照，E模型組ER，F(xiàn)模型組PR；H西藥組陰性對照，I西藥組ER，J西藥組PR；K托里透膿湯組陰性對照，L托里透膿湯組ER，M托里透膿湯組PR。

2.4 托里透膿湯對肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠炎性因子及細(xì)胞焦亡相關(guān)性指標(biāo)的影響

與模型組比較，西藥組及托里透膿湯組血清IL-18含量降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4；組織勻漿中caspase-1、GSDMD-n、IL-1β、cleaved IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5、圖4。

注：A空白對照組；B模型組；C西藥組；D托里透膿湯組。

表4 各組肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠血清IL-18含量的比較

表5 托里透膿湯對肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠細(xì)胞焦亡相關(guān)指標(biāo)的影響

3 討論

課題組經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，認(rèn)為托里透膿湯治療肉芽腫小葉性乳腺炎的關(guān)鍵成分主要為黃酮類化合物槲皮素、山奈酚、芒柄花素、柚皮素、異鼠李素，人參皂苷類化合物人參皂苷Rh2與芍藥苷等[13]；且認(rèn)為其主要作用靶點(diǎn)為IL-1β、IL-6、TNF、CCL2、CXCL8，主要作用為抑制細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的作用、抗炎作用、類激素作用及免疫調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示托里透膿湯能使肉芽腫小葉性乳腺炎大鼠的病灶局限化、降低血清中IL-18水平及組織IL-1β水平，增加乳腺組織局部ER及PR的表達(dá)，體現(xiàn)其類激素作用及抗炎作用。caspase-1/GSDMD信號通路為細(xì)胞焦亡的典型信號通路，其主要過程為活化的caspase-1切割GSDMD，形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段即GSDMD-n，使細(xì)胞膜穿孔水解，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞破裂，釋放細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[14]；除此之外，活化的caspase-1切割I(lǐng)L-1β及IL-18并釋放到胞外，募集炎癥細(xì)胞聚集，使炎癥反應(yīng)迅速擴(kuò)大。該信號通路臨床表現(xiàn)主要為迅速擴(kuò)散的炎癥反應(yīng)，符合肉芽腫小葉性乳腺炎突發(fā)乳房腫塊、迅速紅腫破潰的臨床表現(xiàn)。當(dāng)GSDMD的水解降低，即GSDMD-n的表達(dá)降低時，細(xì)胞焦亡受到一定程度限制，但不影響IL-18及IL-1β的表達(dá)[14]。在本研究中，糖皮質(zhì)激素與托里透膿湯均可降低GSDMD-n的表達(dá)，因而可以認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素與托里透膿湯在傳統(tǒng)抗炎作用之上，具有一定程度抑制肉芽腫小葉性乳腺炎組織內(nèi)細(xì)胞焦亡的可能。在既往研究中，雌激素可以通過改變線粒體功能與減輕炎癥相關(guān)的細(xì)胞焦亡信號通路降低組織損傷[16]，同樣符合托里透膿湯的類激素作用及抗炎效果推測。

綜上所述，caspase-1/GSDMD信號通路可能在肉芽腫小葉性乳腺炎中存在異常表達(dá)現(xiàn)象，其主要誘導(dǎo)因素可能為乳腺導(dǎo)管內(nèi)某種抗原誘發(fā)的炎癥因子風(fēng)暴。托里透膿湯的主要作用機(jī)制為通過下調(diào)IL-1β及IL-18、caspase-1、GSDMD等細(xì)胞焦亡信號通路相關(guān)的炎癥因子以達(dá)到中止細(xì)胞焦亡在乳腺組織中誘發(fā)的連鎖反應(yīng)，并使炎癥反應(yīng)局限在局部，達(dá)到托里透膿、加快康復(fù)的目的。本實(shí)驗(yàn)的不足為：尚未對托里透膿湯給藥濃度進(jìn)行進(jìn)一步研究，且需進(jìn)一步探討該藥物對趨化因子的影響。