張 楠，楊澤眾，王富平，胡明鑫，王 芳，徐維紅，白義川，谷希樹，郭兆將，焦克龍，劉佰明*

(1.天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300392；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，天津 300384；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

煙粉虱Bemisiatabaci是重大外來入侵性害蟲，廣泛為害世界范圍內(nèi)600多種植物。主要通過直接取食、分泌蜜露導(dǎo)致煤污病、傳播超過100多種植物病毒等，給作物種植帶來巨大的經(jīng)濟損失(王恩東等,2020)。煙粉虱的防治目前仍嚴(yán)重依賴化學(xué)防治手段，其優(yōu)點是能夠快速殺死煙粉虱，但長期使用化學(xué)殺蟲劑，導(dǎo)致煙粉虱抗藥性增加，降低防治效果，且?guī)韲?yán)重的農(nóng)藥殘留問題(Zhangetal.,2020)。應(yīng)用環(huán)境友好型的生防天敵替代化學(xué)農(nóng)藥，具有安全、環(huán)保等優(yōu)點，其中寄生蜂作為一類有效的生防天敵，廣泛用于防治煙粉虱(王竹紅等,2010)。

粉虱寄生蜂主要有恩蚜小蜂屬Encarsia和槳角蚜小蜂屬Eretmocerus(孟祥鋒等,2006)，其中恩蚜小蜂屬的麗蚜小蜂Encarsiaformosa已經(jīng)可以商品化生產(chǎn)并大量應(yīng)用。但是前人研究發(fā)現(xiàn)，麗蚜小蜂偏好寄生于溫室白粉虱Trialeurodesvaporariorum，槳角蚜小蜂偏好寄生煙粉虱，并取食煙粉虱若蟲，對煙粉虱防治有顯著成效(戴鵬等,2014;尹園園等,2017)。槳角蚜小蜂是粉虱類害蟲的專性寄生蜂，因其觸角膨大成槳狀而與其它寄生蜂形成顯著區(qū)別。槳角蚜小蜂均可在粉虱類若蟲體內(nèi)產(chǎn)卵，最喜寄生煙粉虱2齡、3齡若蟲(竇文珺等,2020)。通常，單一的寄生蜂產(chǎn)品在不同地區(qū)應(yīng)用過程中，會產(chǎn)生環(huán)境不適應(yīng)現(xiàn)象。挖掘本地寄生蜂資源防治本地害蟲是國際通用的生物防治策略。天津地區(qū)煙粉虱寄生蜂資源豐富，本研究從天津5個地區(qū)初步調(diào)查發(fā)現(xiàn)天津煙粉虱寄生蜂以槳角蚜小蜂為主，但是粉虱寄生蜂個體較小，從形態(tài)上難于精確鑒定，為進(jìn)一步研究應(yīng)用造成很大障礙。

分子標(biāo)記技術(shù)可以快速準(zhǔn)確的鑒定寄生蜂種類，并進(jìn)一步明確其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(邱寶利等,2005)。利用分子標(biāo)記手段進(jìn)行寄生蜂鑒定大體分為核糖體 28S的D2和D3擴展區(qū)序列測定并進(jìn)行不同物種間的同源性比較(薛夏等,2012)、篩選寄生蜂特定引物的SCAR標(biāo)記技術(shù)(張銳銳等,2012)和基于線粒體mtDNACOI基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定不同地理種群(謝艷蘭等,2019)、利用線粒體mtDNACOI基因PCR方法擴增某一基因片段區(qū)別親緣關(guān)系較近的寄生蜂種類并鑒定寄生蜂發(fā)育情況(張曉曼等,2013)等幾類，其中線粒體mtDNACOI基因是應(yīng)用最普遍的分子標(biāo)記手段。De Barroetal.(2000)通過對COII、ITS1、ITS2、28S的D2和D3基因片段的研究結(jié)合形態(tài)學(xué)方法描述了澳大利亞寄生煙粉虱及溫室白粉虱的3種槳角蚜小蜂種群。Montietal.(2005)通過測序和PCR-RFLP兩種方法研究了線粒體mtDNACOI基因的1～900 bp區(qū)段DNA變異情況，成功鑒定了形態(tài)學(xué)上難于區(qū)分的Encarsiaformosa、Encarialuteola和來自巴基斯坦及西班牙的兩個Encarsiasophia種群。張毅波等(2016)基于線粒體mtDNACOI基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和種間雜交的方法成功鑒定了廊坊和新疆的槳角蚜小蜂種群，其中槳角蚜小蜂廊坊種群與古橋槳角蚜小蜂Eretmocerusfuruhashii聚為一支，槳角蚜小蜂新疆種群與海氏槳角蚜小蜂Eretmocerushayati聚為一支。通過雜交實驗得出，新疆種群與海氏槳角蚜小蜂無生殖隔離，可能屬于同一物種。

本研究利用線粒體mtDNACOI基因作為分子標(biāo)記，對天津市5個地區(qū)13個種群的粉虱寄生蜂COI基因進(jìn)行測序，在分子水平上分析槳角蚜小蜂種屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對天津槳角蚜小蜂的遺傳多樣性進(jìn)行研究及槳角蚜小蜂發(fā)生擴散提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步鑒定、開發(fā)應(yīng)用天津地區(qū)本地?zé)煼凼纳涮峁﹨⒖肌?/p>

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

于2020年8-9月在天津市薊州、寶坻、寧河、武清、西青5個地區(qū)采集了13個槳角蚜小蜂種群，用直徑5 mm長35 mm的小玻璃管采集植物葉片上槳角蚜小蜂成蟲，轉(zhuǎn)入盛有75%酒精的1.5 mL離心管中，標(biāo)明采集地點、寄主植物、經(jīng)緯度和采集時間等，保存于4℃冰箱內(nèi)備用。具體樣本信息見表1。

1.2 DNA提取

使用KAPA DNA提取試劑盒進(jìn)行單頭槳角蚜小蜂DNA提取。用昆蟲針挑取一頭寄生蜂至2 mL離心管中，加入2 mm研磨鋼珠，再加入KAPA DNA提取試劑盒體系30 μL(張鄧壯等,2020)，使用G100高通量組織破碎儀1 800 rpm研磨1 min，8 000 rpm離心30 S，吸28 μL上清至新PCR管中。反應(yīng)程序為：75℃裂解10 min，95℃ 5 min。

1.3 PCR擴增及序列

PCR擴增引物為：C1-J-2183：5′-CAACATTTA TTTTGATTTTTTGG-3′和L2-N-3014：5′-TCCAATG CACTAATCTGCCATATTA-3′。反應(yīng)體系為25 μL，其中超純水7 μL，2×緩沖液 10 μL(包含鎂離子)，每種引物1 μL，模板DNA 2 μL(Simonetal.,1994)。擴增程序為：95℃預(yù)變性7 min；35個循環(huán)：95℃ 30 S，55℃ 30 S，72℃ 1 min；最后72℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物為COI基因3′末端的部分序列，大小為840 bp左右。取4 μL PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增成功的PCR產(chǎn)物送往北京生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.4 序列分析

所得PCR擴增產(chǎn)物序列用MEGAX(Kumaretal.,2018)軟件進(jìn)行校對編輯和檢測，將整理后的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST搜索和比對。在MEGAX中的Clustal W進(jìn)行多重序列比對，計算堿基組成、變異位點和轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率等。用Kimura 2-Parameter(K2P)模型分別計算單倍型間的遺傳距離。利用DnaSP 5.10(Librado and Rozas,2009)計算槳角蚜小蜂mtDNACOI基因序列單倍型數(shù)目和出現(xiàn)頻率、單倍型多樣度Hd、核苷酸多樣度Pi、核苷酸平均差異數(shù)K并進(jìn)行錯配分布(Mismatch Distribution)分析。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用Blast在線比對，檢索測序結(jié)果。分別下載康尼氏槳角蚜小蜂EretmoceruscocoisEU017333等、海氏槳角蚜小蜂EretmocerushayatiKF859858、未命名槳角蚜小蜂WTT-2016Eretmocerussp.WTT-2016 KX714952和蒙氏槳角蚜小蜂EretmocerusmundusJN62721等序列。將下載序列與測序結(jié)果混合，并利用mafft軟件比對。利用Jmodeltest 2軟件計算最佳進(jìn)化模型。最后，根據(jù)計算得到的最佳進(jìn)化模型，利用Mrbayes 3.0構(gòu)建進(jìn)化樹(Fredriketal.,2003)。

2 結(jié)果與分析

2.1 天津地區(qū)槳角蚜小蜂資源調(diào)查結(jié)果

2020年8月至2020年9月在天津市5個區(qū)共采集到40頭槳角蚜小蜂。經(jīng)DNA基因提取和線粒體COI基因擴增測序后，成功得到40條線粒體mtDNACOI基因序列，通過NCBI比對發(fā)現(xiàn)采集到的樣品與蒙氏槳角蚜小蜂(Eretmocerusmundus，20頭)和未命名槳角蚜小蜂(Eretmocerussp.WTT-2016，20頭)親緣關(guān)系較近。蒙氏槳角蚜小蜂在武清區(qū)分布較多，薊州、寧河及西青區(qū)分布較少，寶坻區(qū)未發(fā)現(xiàn)；未命名槳角蚜小蜂在寧河區(qū)分布較多，薊州和寶坻區(qū)分布較少，武清和西青區(qū)未發(fā)現(xiàn)(表1)。

2.2 槳角蚜小蜂線粒體mtDNA COI基因的堿基組成及序列變異

蒙氏槳角蚜小蜂共20條線粒體mtDNACOI基因序列，比對后截齊兩端得到755 bp的對齊序列。所測序列中保守位點720個，變異位點35個，其中簡約信息位點4個，單一變異位點31個，總體轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率R值為3.3。所測序列中堿基A、T、G、C的含量分別為35.6%、42.7%、12.7%和9%；A+T含量占78.4%，表現(xiàn)較強的A/T偏倚。

未命名槳角蚜小蜂共20條線粒體mtDNACOI基因序列，比對后截齊兩端得到739 bp的對齊序列。所測序列中保守位點735個，變異位點4個，其中簡約信息位點1個，單一變異位點3個，總體轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率R值為6.8。所測序列中堿基A、T、G、C的含量分別為34.8%、43.8%、12%和9.4%；A+T含量占78.6%，表現(xiàn)較強的A/T偏倚。

2.3 槳角蚜小蜂mtDNA COI基因的單倍型系統(tǒng)發(fā)育分析

采用Mrbayes 3.0構(gòu)建進(jìn)化樹，Jmodeltest 2分析得出最佳進(jìn)化模型(GTR+I+G)。以麗蚜小蜂Encarsiaformosa線粒體mtDNACOI基因序列(登錄號：AY264337)作為外群為代表，包括淺黃恩蚜小蜂Encarsiasophia等蚜小蜂科為代表在NCBI中獲得登錄號。利用Mrbayes 3.0構(gòu)建10個槳角蚜小蜂單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)?？梢钥闯?，本研究中槳角蚜小蜂種群(MH1-MH5)與已知蒙氏槳角蚜小蜂種群聚為一大分支，利用MEGA X進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)兩種群內(nèi)的遺傳距離分別為0.02和0.01，種群間遺傳距離為0.02。本研究中另一槳角蚜小蜂種群(SPH1-SPH5)與Eretmocerussp.WTT-2016聚為一大支，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)兩種群內(nèi)的遺傳距離分別為0.00和0.00，種群間遺傳距離為0.00。

2.4 槳角蚜小蜂單倍型遺傳距離

遺傳距離的計算結(jié)果表明，蒙氏槳角蚜小蜂線粒體mtDNACOI基因5個單倍型間的遺傳距離為0.0013～0.0438(表2)，種內(nèi)平均遺傳距離為0.02。未命名槳角蚜小蜂線粒體mtDNACOI基因5個單倍型間的遺傳距離為0.0014～0.0041(表2)，種內(nèi)平均遺傳距離為0.00。

表2 蒙氏槳角蚜小蜂(下三角)和未命名槳角蚜小蜂(上三角)mtDNA COI基因5個不同單倍型間的遺傳距離Table 2 Genetic distance among 5 different haplotypes of mtDNA COI gene of Eretmocerus mundus(below the diagonal) and Eretmocerus sp.WTT-2016 (above the diagonal)

2.5 槳角蚜小蜂mtDNA COI基因的單倍型和遺傳多樣性分析

共享單倍型為種群內(nèi)大多數(shù)個體共有的單倍型，獨享單倍型為種群內(nèi)單獨個體有的單倍型。蒙氏槳角蚜小蜂種群中共獲得線粒體mtDNACOI基因的5個單倍型MH1-MH5，其中MH1為共享單倍型，MH2-MH5單倍型為相應(yīng)種群的獨享單倍型；共享單倍型MH1分布最廣占蒙氏槳角蚜小蜂檢測個體的70%。未命名槳角蚜小蜂種群中共獲得mtDNACOI基因的5個單倍型SPH1-SPH5，其中SPH1-SPH3為共享單倍型，SPH4、SPH5單倍型為相應(yīng)種群的獨享單倍型；共享單倍型中SPH1分布最廣占未命名槳角蚜小蜂檢測個體的60%。

利用DnaSP 5.10計算得出蒙氏槳角蚜小蜂群體單倍型遺傳多樣度Hd為0.368 ± 0.0185，核苷酸多樣度Pi為0.00557 ± 0.0000129，核苷酸平均差異數(shù)K為4.205。未命名槳角蚜小蜂群體單倍型遺傳多樣度Hd為0.616 ± 0.01132，核苷酸多樣度Pi為0.00106 ± 0.0000001，核苷酸平均差異數(shù)K為0.784。蒙氏槳角蚜小蜂單倍型遺傳多樣度Hd比未命名槳角蚜小蜂低，Pi和K比未命名槳角蚜小蜂高。

2.6 槳角蚜小蜂錯配分析

錯配分析(Mismatch Analysis)可以看出槳角蚜小蜂群體在天津發(fā)展的歷史動態(tài)，錯配分析圖為多峰曲線，表明此種群存在時間較長且近年來未出現(xiàn)擴張現(xiàn)象；錯配分析圖為單峰曲線，則表明此種群形成時間較短且出現(xiàn)擴張現(xiàn)象(Pengetal.,2017)。從錯配分析圖可以看出，多峰為蒙氏槳角蚜小蜂，單峰為未命名槳角蚜小蜂(圖2)。

圖2 基于mtDNA COI基因的蒙氏槳角蚜小蜂和未命名槳角蚜小蜂錯配分布分析Fig.2 Mismatch distribution analysis of populations of Eretmocerus mundus and Eretmocerus sp.WTT-2016 based on mtDNA COI gene

3 結(jié)論與討論

槳角蚜小蜂個體較小，形態(tài)相似，不易捕捉，一般的形態(tài)學(xué)方法難以區(qū)分近緣物種。分子生物學(xué)技術(shù)可以快速鑒定物種，Hebertetal.(2003)提出利用mtDNACOI基因分子標(biāo)記鑒定物種必須滿足兩個條件：即兩個物種的種間基因差異應(yīng)遠(yuǎn)大于種內(nèi)差異；同時種間差異小于0.02時，可以推斷兩者為同種。本研究通過構(gòu)建槳角蚜小蜂單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹，所有種形成明顯分支，槳角蚜小蜂種群(MH1-MH5)與蒙氏槳角蚜小蜂聚為一支，蒙氏槳角蚜小蜂種間遺傳距離為0.02，可初步推斷為同種。本研究中另一槳角蚜小蜂種群(SPH1-SPH5)與Eretmocerussp.WTT-2016聚為一支，未命名槳角蚜小蜂種間遺傳距離為0.00，可推斷為同種。

本研究獲得蒙氏槳角蚜小蜂Eretmocerusmundus和未命名槳角蚜小蜂Eretmocerussp.WTT-2016共40條線粒體mtDNACOI基因序列，堿基組成表現(xiàn)較強的A/T偏倚性，與典型的昆蟲線粒體堿基組成特點一致(趙樂等,2018)。蒙氏槳角蚜小蜂總的轉(zhuǎn)換/顛換(R)值為3.3，未命名槳角蚜小蜂R值為6.8，都屬于核苷酸轉(zhuǎn)換大于顛換，表明蒙氏槳角蚜小蜂不同地理種群親緣關(guān)系較近，未命名槳角蚜小蜂不同地理種群親緣關(guān)系較近(Simonetal.,1994)。此次序列分析定義了5種蒙氏槳角蚜小蜂單倍型和5種未命名槳角蚜小蜂單倍型，兩種小蜂單倍型中都是H1發(fā)生頻率最高、分布最廣，可認(rèn)為是較為原始、能夠適應(yīng)環(huán)境變化，并在種群中穩(wěn)定存在的優(yōu)勢單倍型。兩種槳角蚜小蜂都擁有共享單倍型和獨享單倍型，表明各個地理種群之間既有基因交流，又存在遺傳分化的現(xiàn)象(孫嵬等,2013;劉曉娜等,2016)。

本研究結(jié)果顯示蒙氏槳角蚜小蜂錯配分析圖為多峰曲線(圖2)，表明此種群存在時間較長且近年來未出現(xiàn)擴張現(xiàn)象；未命名槳角蚜小蜂為單峰曲線(圖2)，表明此種群形成時間較短且出現(xiàn)擴張現(xiàn)象(Pengetal.,2017)。蒙氏槳角蚜小蜂和未命名槳角蚜小蜂的總?cè)后w單倍型指數(shù)Hd分別為0.368和0.616，表明未命名槳角蚜小蜂比蒙氏槳角蚜小蜂線粒體mtDNACOI基因具有較高的多態(tài)性(謝艷藍(lán)等,2019)，綜上所述，可以推斷出蒙氏槳角蚜小蜂種群在天津地區(qū)穩(wěn)定存在，未命名槳角蚜小蜂種群存在時間較短且具有較強的適應(yīng)能力及遺傳變異能力。

本研究在天津各地區(qū)采樣地點和采集數(shù)量較少，初步調(diào)查發(fā)現(xiàn)天津市5個地區(qū)存在槳角蚜小蜂，西青區(qū)和寧河區(qū)發(fā)現(xiàn)少量恩蚜小蜂，后續(xù)應(yīng)增加采集數(shù)量及采樣點并檢測每年天津寄生蜂的種類變化。僅以線粒體mtDNACOI基因作為分子標(biāo)記并檢測，在種群遺傳多樣性和遺傳變異等分析上有偏差。天津槳角蚜小蜂的遺傳變異及種群多樣性應(yīng)分析深層原因，加大采樣點并結(jié)合更多分子標(biāo)記進(jìn)行系統(tǒng)深入研究。