劉飛玲，廖 珍，洪喜雄，彭睿智，肖花美*，李 飛

(1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西省作物生長發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西宜春 336000；2.浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所，杭州 310058；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095)

非編碼RNA (non-coding RNA,ncRNA)一度被認(rèn)為在生物體內(nèi)無功能，隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)ncRNA在生物體內(nèi)不可或缺，依據(jù)其生物起源、大小、長度和功能等，可將ncRNA分為microRNAs (miRNAs)、小干擾RNA (siRNAs)、piwi-RNAs (piRNAs)等，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、繁殖、病毒防御等生理生化過程(Setoetal.,2007;Ku and Lin,2014;Ponnusamyetal.,2017;Ozataetal.,2019)。Argonaute蛋白家族是RNA沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)的重要組成部分，在生物體內(nèi)高度保守(Carmelletal.,2002;Jamesetal.,2005;Hocketal.,2007)，其組織特異性和定向性決定了不同非編碼RNA的表達(dá)和功能(Ponnusamyetal.,2017)。依據(jù)不同物種間的序列同源性和功能區(qū)域，Argonaute蛋白家族可分為AGO亞家族(與擬南芥ArabidopsisthalianaAGO1同源)、PIWI亞家族(與黑腹果蠅DrosophilamelanogasterPiwi同源)和WAGO亞家族。在細(xì)胞質(zhì)中，AGO與miRNA和siRNA相互作用促進(jìn)轉(zhuǎn)錄后基因的沉默(Valdmanisetal.,2012;Volleretal.,2016)。而piRNA 3′端甲基化修飾的2′-氧基團(tuán)只與AGO家族的PIWI亞家族相結(jié)合，沉默轉(zhuǎn)錄元件(Coxetal.,1998;Girardetal.,2006;Klenovetal.,2011)，調(diào)控基因表達(dá)，在哺乳動(dòng)物中還可以抑制逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的表達(dá)(Ponnusamyetal.,2017)。piRNA與PIWI在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核(Saitoetal.,2010)，形成的復(fù)合體根據(jù)定位以及伴侶蛋白的不同而產(chǎn)生不同的功能(Ponnusamyetal.,2017)，對(duì)于受精(Dingetal.,2013;Rooversetal.,2015)、維持生殖干細(xì)胞自我更新(Peteretal.,2005;Palakodetietal.,2008)、胚胎發(fā)育(Manietal.,2014;Navarroetal.,2015;Rooversetal.,2015)、神經(jīng)突觸可塑性(Rajasethupathyetal.,2012)、代謝過程(Jonesetal.,2016;Henaouietal.,2017)、組織修復(fù)及再生(Rinkevichetal.,2010;Rizzoetal.,2014)等過程具有重要作用。

PIWI結(jié)構(gòu)域是Argonaute蛋白中重要的功能結(jié)構(gòu)域，位于Argonaute蛋白的羧基端，由400～600個(gè)氨基酸殘基組成。在哺乳動(dòng)物(Aravinetal.,2006;Girardetal.,2006;Grivnaetal.,2006;Lauetal.,2006)、線蟲Caenorhabditiselegans(Batistaetal.,2008;Dasetal.,2008)、斑馬魚Daniorerio(Houwingetal.,2007)和昆蟲的性腺(Saitoetal.,2006;Vaginetal.,2006)中均能檢測(cè)到piRNA和PIWI，在哺乳動(dòng)物的肺、心臟、肝、腎、腦、胰腺、卵巢、精巢中均有PIWI的表達(dá)(Setoetal.,2007;Ku and Lin,2014;Ponnusamyetal.,2017;Ozataetal.,2019)。在細(xì)胞質(zhì)中，PIWI可以不通過piRNA的輔助，直接與受體或信號(hào)分子相互作用，調(diào)控轉(zhuǎn)錄后修飾進(jìn)而調(diào)控靶標(biāo)蛋白的生物功能(Zhangetal.,2012;Ponnusamyetal.,2017;Sivagurunathanetal.,2017;Tanetal.,2017)。Houwing等(2007)通過原位雜交發(fā)現(xiàn)，斑馬魚中的Piwi亞家族成員只在雌性成魚的生殖細(xì)胞中有表達(dá)，在不含有生殖細(xì)胞的睪丸中無Piwi亞家族的成員的表達(dá)。Williams和Rubin等(2002)發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中3個(gè)Piwi亞家族成員(Piwi、Aub、Ago3)也只在生殖細(xì)胞中表達(dá)，此外，Saito等(2006)通過Western blot等相關(guān)實(shí)驗(yàn)也同樣證明黑腹果蠅中的3個(gè)Piwi亞家族蛋白只在精巢、卵巢和胚胎中表達(dá)，而在S2細(xì)胞中無表達(dá)。

目前對(duì)Piwi亞家族蛋白的研究主要集中于哺乳動(dòng)物或模式生物，如黑腹果蠅、線蟲等。昆蟲占已知?jiǎng)游锓N類的60%以上，影響涉及醫(yī)學(xué)、經(jīng)濟(jì)、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域。但昆蟲Piwi亞家族基因的生物學(xué)研究大多局限于黑腹果蠅(Lin and Spradling,1997;Setoetal.,2007;Ewen-Campenetal.,2013;Ku and Lin,2014;Ponnusamyetal.,2017;Ozataetal.,2019)。本文克隆了家蠶BombyxmoriPiwi亞家族蛋白基因全長，并對(duì)全長轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；研究了Piwi亞家族蛋白基因在家蠶各個(gè)發(fā)育階段和組織中的表達(dá)情況，為家蠶Piwi亞家族蛋白功能及piRNA的研究奠定基礎(chǔ)，為理解家蠶piRNA和Piwi互作對(duì)家蠶生殖調(diào)控提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蟲源：家蠶(品系：7091)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供，在溫度26±1℃，相對(duì)濕度60%～75%，光周期16 L ∶8 D的條件下采用人工飼料及桑葉交替飼養(yǎng)。人工飼料購自山東省蠶業(yè)研究所煙臺(tái)綠寶蠶用飼料廠。

試劑：RNA提取試劑TRIzol?Reagent，RACE反應(yīng)試劑GeneRacer Kit購自Invitrogen (美國)；Marker、Ex Taq DNA聚合酶、r-Taq DNA聚合酶、oligo (dT) 18、EcoRI限制性內(nèi)切酶、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)、Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0以及熒光定量試劑盒SYBR?Premix Ex Taq(Prefect Real Time) (TakaRa,中國北京)均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；Plasmid Mini Kit I購自O(shè)mega Bio-Tek (美國)；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit購自Axygen (美國)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和pGEM-T easy載體購自Promega (美國)；PCR引物及3′RACE接頭由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1Piwi亞家族蛋白的預(yù)測(cè)

從家蠶基因組數(shù)據(jù)庫SilkDB下載家蠶的基因組序列，利用BioEdit軟件建立本地家蠶基因組數(shù)據(jù)庫。以“piwi mRNA,complete cds”為條件檢索NCBI核酸數(shù)據(jù)庫，篩選所有符合條件的序列并獲取相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列，通過在線blastp檢測(cè)相似度。將13個(gè)已知的Piwi蛋白序列(BAA93706、BAA93705、AAN75583、NP_899181、ACH96370、XP_344106、AAC97371、BAC81341、BAC81343、BAC81342、AAD08705、ABO26294、NP_476734)作為檢索序列，采用TBLASTN分別同源搜索家蠶基因組，參數(shù)保持缺省，E值小于1E-20。搜索家蠶EST序列時(shí)，匹配的序列必須滿足如下的標(biāo)準(zhǔn)：(1)序列相似性超過95%；(2)匹配的序列長度必須大于160 bp。

1.2.2總RNA提取及cDNA第1鏈的合成

取25～30 mg家蠶卵(產(chǎn)下6 h內(nèi))、新蛻皮1～5齡幼蟲、蛹和成蟲；解剖5齡幼蟲的精巢、卵巢、馬氏管、絲腺、頭和中腸共6種組織，每組樣本準(zhǔn)備3個(gè)重復(fù)。5 min液氮速凍后在預(yù)冷的勻漿器中迅速研磨至粉末狀，采用TRIzol?Reagent，依據(jù)說明書提取總RNA?？俁NA的濃度及純度用分光光度計(jì)(Eppendorf公司，德國)檢測(cè)，完整性經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。參照Reverse Transcriptase M-MLV方法合成cDNA第一鏈。參照GeneRacer Kit試劑盒合成5′-RACE-Ready cDNA；參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄方法，用3′RACE接頭替換oligo (dT) 18，合成3′-RACE-Ready cDNA第一鏈，3′RACE接頭序列同SMART RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒中3′RACE接頭序列(由上海生工合成)。

1.2.3引物設(shè)計(jì)

依據(jù)預(yù)測(cè)的家蠶Piwi蛋白基因序列，利用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。5′RACE的引物根據(jù)GeneRacer kit要求設(shè)計(jì)；3′RACE的引物根據(jù)SMART RACE cDNA Amplification Kit要求設(shè)計(jì)。本實(shí)驗(yàn)中所用引物序列詳見表1。

1.2.4家蠶siwi1和siwi2中間片段的克隆

依據(jù)預(yù)測(cè)的家蠶Piwi蛋白序列，利用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)進(jìn)行cDNA片段克隆，以1.2.2中反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，使用ExTaqDNA聚合酶進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，50 μL反應(yīng)體系：10 ×ExTaq Buffer 5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，上下游引物(10 mmol/L)各2 μL，cDNA 0.5 μL，Taq酶0.25 μL，ddH2O 32.25 μL。siwi1RT-PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；35 cycles×【94℃ 50 s，55℃ 50 s，72℃ 2 min】；72℃ 10 min。siwi2RT-PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；3 cycles (每降1度) ×【94℃ 50 s，65℃～53℃梯度退火50 s，72℃ 2 min】；20 cycles ×【94℃ 50 s，50℃ 50 s，72℃ 2 min】；72℃ 10 min。siwi1全長PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；35 cycles ×【94℃ 50 s，53℃ 50 s，72℃ 3 min】；72℃ 10 min。產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，再對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行回收，采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit純化回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒，酶切和測(cè)序雙檢測(cè)，確定目的基因正確插入質(zhì)粒并表達(dá)，克隆產(chǎn)物送往南京博亞公司測(cè)序。

1.2.5家蠶siwi1和siwi2末端序列的RACE擴(kuò)增

依據(jù)獲得siwi1和siwi2中間片段信息，設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，進(jìn)行RACE擴(kuò)增，50 μL反應(yīng)體系：10×ExTaq Buffer 5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，Mg2+(25 mol/L) 4 μL，UPM(通用引物，Universal Primer) 3 μL，GSP (10 mmol/L) (基因特異性引物，Gene-specific primer)1 μL,RACE cDNA 2 μL，Taq酶0.25 μL，ddH2O 30.75 μL。RACE PCR參照GeneRacer Kit試劑盒，RACE巢式PCR反應(yīng)體系同前，僅將UPM換為nupm，GSP換為ngsp，反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍作為模板。PCR產(chǎn)物回收純化后，按照1.2.4中方法進(jìn)行克隆測(cè)序。

表1 引物列表Table 1 List of the primers

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取新生卵(Egg，產(chǎn)下6 h內(nèi))、初孵1齡幼蟲(1 L)、新蛻皮2～5齡幼蟲(2 L、3 L、4 L、5 L)、蛹和成蟲共8個(gè)時(shí)期，以5齡期家蠶Piwi蛋白基因表達(dá)量為參照；取精巢、卵巢、馬氏管、絲腺、頭和中腸共6種組織，以絲腺中siwi2基因的表達(dá)量為參照。在1次反應(yīng)中，重復(fù)3次；制備2套cDNA模板進(jìn)行2個(gè)獨(dú)立的熒光定量PCR反應(yīng)。參照SYBR?Premix Ex Taq (Prefect Real Time)試劑盒，按照95℃預(yù)變性10 s；95℃變性5 s，60℃復(fù)性延伸31 s，40個(gè)循環(huán)進(jìn)行定量反應(yīng)。

1.2.7基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域

通過NCBI中的ORFfinder分析克隆獲得的Piwi亞家族蛋白基因的開放閱讀框，并用Gene-Explorer軟件推導(dǎo)其氨基酸序列；將Piwi亞家族蛋白基因的核酸序列與家蠶基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，分析其基因結(jié)構(gòu)；利用推導(dǎo)的氨基酸序列搜索NCBI蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，預(yù)測(cè)Piwi亞家族蛋白中保守的結(jié)構(gòu)域。利用在線版的InterPro軟件(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)對(duì)蛋白序列進(jìn)行分析(Mitchelletal.,2019)。

1.2.8進(jìn)化分析

利用“Piwi”為關(guān)鍵詞搜索NCBI，搜集已知的所有物種Piwi蛋白及其類似物Piwil，采用MEGA 7.0.26軟件對(duì)獲取的蛋白序列進(jìn)行ClustalW序列比對(duì)，參數(shù)為默認(rèn)值。根據(jù)鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，選擇Poisson Correction(泊松修正)模型，自舉檢驗(yàn)Bootstrap重復(fù)1 000次。利用在線軟件iTOL (Interactive Tree Of Life) (http://itol.embl.de/index.shtml)對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行優(yōu)化處理。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用2-ΔΔCT法對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶Piwi亞家族蛋白基因的預(yù)測(cè)與克隆

利用13個(gè)已知的Piwi亞家族蛋白在家蠶基因組中進(jìn)行同源搜索，發(fā)現(xiàn)2個(gè)Piwi蛋白基因，分別命名為siwi1和siwi2。siwi1共1 482 bp；siwi2共1 530 bp。依據(jù)預(yù)測(cè)的siwi1和siwi2的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2%瓊脂糖凝膠電泳獲得2條PCR產(chǎn)物條帶大小，其中1條約1 800 bp，另1條約600 bp，測(cè)序結(jié)果與預(yù)測(cè)的siwi1和siwi2基因序列比較分析發(fā)現(xiàn)，siwi1條帶長度為1 835 bp，與預(yù)測(cè)大小相似，siwi2條帶長度為581 bp，與預(yù)測(cè)結(jié)果差異較大(圖1)。

圖1 家蠶兩個(gè)Piwi亞家族蛋白基因的克隆Fig.1 Cloning of two Piwi subfamily genes from Bombyx mori

2.2 家蠶Piwi亞家族基因全長克隆

合成siwi1和siwi2的5′及3′RACE模板，采用持家基因ActinA3進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)模板質(zhì)量。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，5′及3′RACE模板均能擴(kuò)增獲得ActinA3的陽性克隆產(chǎn)物(圖2-A)，表明模板質(zhì)量可行。依據(jù)克隆獲得的基因片段，利用RACE技術(shù)分別擴(kuò)增siwi1和siwi2的5′和3′末端，2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果以及測(cè)序分析結(jié)果表明，成功克隆獲得了siwi1和siwi2基因的3′末端cDNA，siwi1 3′末端cDNA序列長度為1 444 bp，siwi2 3′末端cDNA序列長度為305 bp，而僅有基因上游特異引物gsp或ngsp、僅有3′RACE下游通用引物upm或nupm以及沒有模板的陰性對(duì)照blank中均不能檢測(cè)到條帶(圖2-B，C)。但多次試驗(yàn)后仍不能克隆獲得siwi1和siwi2的5′端序列，可能是合成的5′RACE模板中，siwi1和siwi2基因的表達(dá)豐度不高。將克隆獲得的siwi1和siwi2基因序列與RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得的siwi1和siwi2序列分別進(jìn)行拼接，拼接后的siwi1序列長度為2 746 bp，siwi2序列長度為823 bp。為獲取siwi1基因cDNA序列全長，利用已知Piwi亞家族蛋白搜索家蠶EST序列，找出所有可能的siwi1基因的EST序列，再將拼接獲得的siwi1序列與搜索出來的EST序列比對(duì)，拼接出siwi1基因cDNA序列全長。最后，對(duì)獲得的siwi1基因序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，測(cè)序分析結(jié)果顯示該條帶為目標(biāo)基因siwi1，而只有單引物F和R以及無模板的陰性對(duì)照中均不能檢測(cè)到相同條帶(圖2-D)，該基因cDNA全長3 277 bp (GenBank登錄號(hào)：MH780859)，包含部分5′UTR、編碼899個(gè)氨基酸的完整開放閱讀框和一段576 bp的3′UTR，其中3′UTR包含一段由40個(gè)腺苷酸組成的poly A尾巴，比對(duì)NCBI發(fā)現(xiàn)該基因?yàn)锽mPiwi。而siwi2基因，僅獲得了823 bp的轉(zhuǎn)錄本序列，編碼239個(gè)氨基酸，其中3′UTR區(qū)共103 bp，含有一段由30個(gè)腺苷酸組成的poly A尾巴，比對(duì)NCBI發(fā)現(xiàn)該基因?yàn)锽mAgo3。

2.3 家蠶Piwi亞家族蛋白的特征分析

與家蠶基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，BmPiwi基因含有18個(gè)外顯子和17個(gè)內(nèi)含子，其中第2個(gè)內(nèi)含子跨度最大，共3 828 bp(表2)。通過搜索NCBI蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，BmPiwi含有Argonaute蛋白家族特征性的保守結(jié)構(gòu)域：PAZ(位于氨基酸序列的316～451殘基)和PIWI(位于氨基酸序列的437～879殘基)(圖2-E)，在PAZ結(jié)構(gòu)域中包含小RNA3′位點(diǎn)，PIWI結(jié)構(gòu)域中包含5′RNA引導(dǎo)鏈錨定位點(diǎn)和剪切三聯(lián)體活性位點(diǎn)(DDH：Asp-Asp-Asp/His/Glu/Lys)。

表2 BmPiwi在染色體上的定位Table 2 Chromosome locations ofBmPiwi

圖2 家蠶2個(gè)Piwi亞家族蛋白基因的全長克隆及結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Full lengthcloning and structure analyzing of two Piwi subfamily genes from Bombyx mori注：(A)，PCR擴(kuò)增持家基因Actin A3檢測(cè)模板質(zhì)量；(B)，RACE擴(kuò)增BmPiwi 3′末端；(C)，RACE擴(kuò)增BmAgo3 3′末端，分別以精巢、卵、3齡幼蟲、4齡幼蟲的3′RACE模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；(D)，PCR擴(kuò)增BmPiwi全長；(E)，BmPiwi結(jié)構(gòu)與分析。Te，精巢；L，幼蟲；-1，第一組；-2，第二組；M，Marker；blank，不含模板的陰性對(duì)照；gsp/ngsp，單上游基因特異引物；upm/nupm，單下游3′RACE通用引物；F，上游引物；R，下游引物；金黃色小三角代表核酸給合位點(diǎn)，綠色小三角代表5′RNA引導(dǎo)鏈錨定位點(diǎn)，藍(lán)色小三角代表剪切三聯(lián)體活性位點(diǎn)(DDH：Asp-Asp-Asp/His/Glu/Lys)。Note:(A),Check the RACE templates with housekeeping gene Actin A3 by PCR;(B),3′RACE PCR of BmPiwi;(C),3′RACE PCR of BmAgo3,RT-PCR performed with 3′RACE templates of testis,egg,3rd instar larvae and 4th instar larvae,respectively;(D),PCR amplification of BmPiwi full-length;(E),Structure analysis of BmPiwi. Te,Testis;L,Larvae;-1,First group;-2,Second group;M,Marker;blank,Negative control without template;gsp/ngsp,Single upstream gene-specific primer;upm/nupm,Single downstream 3′RACE universal primer;F,Upstream primer;R,Downstream primer;Golden yellow triangles represented nucleic acid binding sites;Green triangles represented 5′NA guiding strand anchoring sites;Blue triangles represented shear triplet activity site (DDH:Asp-Asp-sp/His/Glu/Lys).

2.4 家蠶Piwi亞家族蛋白的進(jìn)化分析

構(gòu)建不同物種PIWI亞家族蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹，進(jìn)化分析結(jié)果(圖3)顯示，PIWI亞家族蛋白在進(jìn)化過程中高度保守，PIWI亞家族蛋白依據(jù)不同家族類別進(jìn)行聚集，在脊椎動(dòng)物中尤為明顯。PIWI亞家族蛋白主要存在于脊椎動(dòng)物中，約占已知PIWI蛋白的一半，在魚類和哺乳動(dòng)物中存在多種不同類型的PIWI-like蛋白(Piwil)，如人Homosapiens和猴子Macacamulatta中發(fā)現(xiàn)4種Piwil蛋白。昆蟲已知的PIWI蛋白數(shù)僅次于脊椎動(dòng)物。家蠶Piwi亞家族蛋白與乳草長蝽Oncopeltusfasciatus、黑腹果蠅、柑橘小實(shí)蠅Bactroceradorsalis、優(yōu)雅蟈螽Gampsocleisgratiosa、斯氏按蚊Anophelesstephensi、褐飛虱Nilaparvatalugens的PIWI蛋白以及東亞飛蝗Locustamigratoria的PIWI2和PIWI3蛋白親緣關(guān)系最近，和三疣梭子蟹Portunustrituberculatus的PIWI2和PIWI3同為一支，與脊椎動(dòng)物的PIWIL2和刺胞動(dòng)物的PIWI相似性也較高(圖3)。

家蠶AGO3蛋白與小菜蛾AGO3親緣關(guān)系最近，與西方玉米根蟲Diabroticavirgiferavirgifera、白蠟窄吉丁Agrilusplanipennis的AGO3及東亞飛蝗Locustamigratoria的PIWI1同屬一支，與橘小實(shí)蠅的AGO3同屬一總支；與海綿動(dòng)物和刺胞動(dòng)物的PIWI蛋白以及櫛水母門動(dòng)物的海醋栗Pleurobrachiabachei的PIWI蛋白相似性也較高(圖3)。AGO蛋白的種類明顯多于PIWI蛋白，丹參Salviamiltiorrhiza中AGO蛋白總數(shù)可達(dá)10種之多，塵螨Dermatophagoidesfarinae和番茄Solanumlycopersicum中的AGO蛋白也有8種，陸生植物AGO蛋白種類普遍較多。同一類型的AGO蛋白呈同一聚簇，與PIWI蛋白呈現(xiàn)明顯的分支，但家蠶AGO3蛋白以及錐蟲屬的AGO1蛋白卻與PIWI蛋白同屬一支(圖3)。

圖3 已知Piwi和Ago亞家族成員系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree of known Piwi and Ago subfamily members注：Piwil,Piwi like protein,Piwi類似蛋白。Note:Piwil represented Piwi like protein.

2.5 家蠶Piwi亞家族蛋白基因的時(shí)空表達(dá)譜

2.5.1家蠶Piwi亞家族蛋白基因的組織表達(dá)情況

采用持家基因ActinA3進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)模板質(zhì)量，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖4-A)顯示樣品無基因組污染，模板質(zhì)量可行，BmPiwi和BmAgo3基因在卵巢中條帶稍暗，在精巢中的條帶明顯亮于其他組織，表明家蠶2個(gè)Piwi亞家族蛋白基因在卵巢中的表達(dá)弱于精巢組織，在精巢組織中高表達(dá)。此外，在家蠶的消化道、頭部也能檢測(cè)到BmPiwi的表達(dá)，但在馬氏管和絲腺中表達(dá)量較低。在家蠶頭部中也能檢測(cè)到BmAgo3基因的表達(dá)。

熒光定量PCR結(jié)果(圖4-B)顯示，在選取的不同組織中，BmPiwi基因的表達(dá)量都明顯高于BmAgo3基因(4～13倍)。BmPiwi和BmAgo3兩個(gè)基因在絲腺中的表達(dá)量最低，在消化道中的表達(dá)量略高于絲腺，但略低于馬氏管；在精巢中的表達(dá)明顯高于其他組織，是絲腺中的10倍；在卵巢中表達(dá)僅次于精巢，是絲腺中的6倍。BmPiwi在頭部的表達(dá)量略低于卵巢，高于絲腺、馬氏管和消化道，但BmAgo3基因在頭部表達(dá)豐度最高。

2.5.2家蠶Piwi亞家族蛋白基因不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)情況

熒光定量PCR檢測(cè)家蠶2個(gè)Piwi亞家族蛋白基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)(以5齡家蠶Piwi表達(dá)量作為參照)，結(jié)果(圖4-C)顯示，家蠶2個(gè)Piwi亞家族蛋白基因在新生卵(產(chǎn)下6 h內(nèi))中表達(dá)量最高，分別是5齡期的44倍(BmPiwi)和32倍(BmAgo3)。進(jìn)入幼蟲期，其表達(dá)量迅速下降，整個(gè)幼蟲期均維持低表達(dá)狀態(tài)，蛹期開始表達(dá)量迅速上升。BmPiwi在4齡期表達(dá)量最低，5齡開始表達(dá)量略微回升，成蟲期表達(dá)量上升至5齡期的15倍，達(dá)到不同發(fā)育階段BmPiwi表達(dá)量的第2高點(diǎn)。BmAgo3與BmPiwi表達(dá)趨勢(shì)大體相同，但不同于BmPiwi的是，BmAgo3在2齡期表達(dá)量明顯高于1齡期，且在5齡期表達(dá)量達(dá)到最低。此外，BmAgo3在蛹期表達(dá)量為5齡期14倍，并持續(xù)該狀態(tài)至成蟲期。

圖4 家蠶兩個(gè)Piwi亞家族蛋白基因在不同組織和不同發(fā)育階段的表達(dá)Fig.4 Detection of BmPiwi and BmAgo3 expression in different tissues and different developmental stages of silkworm注：(A)，RT-PCR檢測(cè)BmPiwi和BmAgo3在家蠶不同組織中的表達(dá)情況；(B)，定量PCR檢測(cè)BmPiwi和BmAgo3在家蠶不同組織中的表達(dá)情況；(C)，定量PCR檢測(cè)BmPiwi和BmAgo3在家蠶不同發(fā)育階段的表達(dá)情況。MT，馬氏管；AT，消化道；SG，絲腺；He，頭；Te，精巢；Ov，卵巢；L，幼蟲。Note:(A),Detection of BmPiwi and BmAgo3 expression in different tissues of silkworm by RT-PCR;(B),Expression profile of BmPiwi and BmAgo3 expression in different tissues of silkworm by quantitative real time PCR;(C),Expression profile of BmPiwi and BmAgo3 in different developmental stages of silkworm by quantitative real time PCR.MT,Malpighian tube;AT,Alimentary tract;SG,Silk gland;He,Head;Te,Testis;Ov,Ovary;L,Larvae.

3 結(jié)論與討論

1997年在果蠅卵巢中發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)Piwi亞家族蛋白(Lin and Spradling,1997)，此后發(fā)現(xiàn)Piwi亞家族蛋白與小RNA結(jié)合形成piRNA，作為沉默復(fù)合體的核心蛋白而行使功能(Aravinetal.,2006)。研究表明PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域是該家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，PIWI結(jié)構(gòu)域具有與RNaseH相似的結(jié)構(gòu)特征(Parkeretal.,2004;Songetal.,2004;Rivasetal.,2005;Rashidetal.,2007)。小鼠Musmusculus神經(jīng)元中的PIWIL1結(jié)構(gòu)域分析表明，PIWIL1中的RNA結(jié)合PAZ結(jié)構(gòu)域和RNA加工PIWI結(jié)構(gòu)域?qū)ζ湓谏窠?jīng)元遷移中不可或缺(Zhaoetal.,2015)。本研究克隆獲得了BmPiwi基因的全長，分析發(fā)現(xiàn)其包含PAZ和Piwi結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，BmPiwi與BmAgo3在不同物種中高度保守，但不同類型的Piwi及Piwi類似物Piwil聚集在不同的分支中，可能是因?yàn)镻iwi亞家族蛋白具有功能多樣性。例如生殖干細(xì)胞Piwil2的異位表達(dá)與腫瘤干細(xì)胞的發(fā)育相關(guān)，同時(shí)也是修復(fù)各種遺傳毒物誘導(dǎo)的DNA損傷過程所必需的(Yinetal.,2011)；Piwil3在各種癌癥中過表達(dá)，可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增值、轉(zhuǎn)移和侵襲；在生殖細(xì)胞中表達(dá)的PIWIL4，在精子發(fā)生的第一階段起重要作用，同時(shí)也是轉(zhuǎn)錄沉默所必需的(Munozetal.,2014)。BmPiwi與BmAgo3在進(jìn)化樹中處于不同分支，距離相對(duì)較遠(yuǎn)，推測(cè)可能是由于功能不同所致。

早期研究表明PIWI蛋白在生殖細(xì)胞中表達(dá)，并參與生殖細(xì)胞的發(fā)育、維持、分裂和分化(Coxetal.,1998)。Piwi突變可以導(dǎo)致果蠅雌雄生殖干細(xì)胞的增殖能力消失(Lin and Spradling,1997)。近期研究顯示，Piwi可以通過激活表觀遺傳的調(diào)節(jié)、沉默轉(zhuǎn)座子和維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來保護(hù)生殖細(xì)胞，同時(shí)也參與包括細(xì)胞增殖、分化和生存在內(nèi)的許多重要生物過程(Ponnusamyetal.,2017)。本研究檢測(cè)了家蠶BmPiwi與BmAgo3的發(fā)育表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)BmPiwi與BmAgo3在新生卵中高表達(dá)，在1齡幼蟲中表達(dá)量都顯著下降，BmPiwi表達(dá)量維持下降趨勢(shì)至4齡幼蟲達(dá)到最低值，而BmAgo3在2齡時(shí)表達(dá)量出現(xiàn)回升，但3齡開始表達(dá)量再次下降，到5齡達(dá)到最低值。與Alfons Navarro等人(Navarroetal.,2015)對(duì)人肺胚胎發(fā)生階段的Piwil mRNA表達(dá)分析結(jié)果相似，PIWIL1在7周胚胎中高表達(dá)，并在隨后的6～13周表達(dá)量顯著下調(diào)，而PIWIL2在8周時(shí)表達(dá)水平出現(xiàn)回升持續(xù)到10周后再次下降。Zhao等(Zhaoetal.,2015)利用原位雜交實(shí)驗(yàn)分析發(fā)育中的小鼠腦中PIWIL1 mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示PIWIL1在胚胎13周高表達(dá)，隨后表達(dá)量顯著下調(diào)。對(duì)果蠅的相關(guān)研究顯示，Piwi是果蠅卵巢生殖干細(xì)胞維持和分化必須的核糖核蛋白，PIWI可以通過抑制體細(xì)胞小生境(由臨近生殖干細(xì)胞的細(xì)胞組成)中的c-FOS的表達(dá)從而調(diào)控生殖干細(xì)胞功能和卵巢體細(xì)胞的細(xì)胞組織，組織形態(tài)和產(chǎn)卵(Coxetal.,1998;Kleinetal.,2016)。由此推測(cè)家蠶piwi亞家族蛋白基因在卵期高表達(dá)對(duì)細(xì)胞的分裂分化具有重要作用。

PIWI/piRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式對(duì)于哺乳動(dòng)物卵子發(fā)生以及早期胚胎發(fā)生都有著顯著的影響，但即使在相同器官中，發(fā)揮功能的Piwi也不盡相同。例如，PIWIL1和PIWIL2在成人卵巢卵母細(xì)胞中高表達(dá)，胚胎卵母細(xì)胞中只有PIWIL2高表達(dá)(Rooversetal.,2015)，而牛卵巢僅表達(dá)PIWIL1，但是在提取的牛卵泡卵母細(xì)胞中卻發(fā)現(xiàn)成熟的卵母細(xì)胞特異性強(qiáng)烈表達(dá)PIWIL3(Rooversetal.,2015)。此外，小鼠MIWI在新生卵巢中高表達(dá)，隨著卵巢的成熟表達(dá)量下調(diào)，而在成年小鼠的初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡以及卵母細(xì)胞中都可以檢測(cè)到MIWI的表達(dá)，表明Piwi在卵細(xì)胞中高表達(dá)，且與卵母細(xì)胞的成熟與激活息息相關(guān)(Dingetal.,2013)。本研究在家蠶卵巢中檢測(cè)到BmPiwi與BmAgo3的高表達(dá)，BmPiwi表達(dá)量顯著高于BmAgo3，推測(cè)是由于BmPiwi在家蠶卵巢中起主要作用。PIWI對(duì)于雄性生殖也具有重要作用，對(duì)突發(fā)性非梗阻性無精子癥患者的研究證實(shí)HIWI2 (PIWIL4)是正常精子發(fā)生第一時(shí)期所必須的，HIWI2基因遺傳多態(tài)性與精子形成和男性不育密切相關(guān)(Zeeba Kamaliyanetal.,2017;Rewiczetal.,2018)。對(duì)家蠶精巢Piwi基因的檢測(cè)顯示，BmPiwi的表達(dá)量明顯高于BmAgo3，推測(cè)其在精巢中起主要作用。

除生殖器官精巢和卵巢，Piwi基因在多個(gè)器官中均有分布，包括腦、心臟、肺、肝臟、腎臟、胰腺、胃等，除病理情況，Piwi在生殖器官中表達(dá)量普遍偏高。本研究發(fā)現(xiàn)BmPiwi在家蠶頭部的表達(dá)量僅次于卵巢，而BmAgo3在頭部表達(dá)量最高，在家蠶預(yù)蛹期階段，BmAgo3的表達(dá)量明顯高于BmPiwi，家蠶的發(fā)育受激素和神經(jīng)雙重調(diào)控，而頭部是昆蟲感覺中心，故BmPiwi和BmAgo3在頭部高表達(dá)。研究顯示，小鼠PIWIL1可以通過調(diào)控微管相關(guān)蛋白來調(diào)控神經(jīng)元的極化與遷移(Zhaoetal.,2015)，因此，BmAgo3很可能對(duì)家蠶神經(jīng)元起調(diào)控作用。此外，在家蠶消化道、絲腺、馬氏管均檢測(cè)到BmPiwi和BmAgo3基因的表達(dá)，馬氏管中的表達(dá)量略高于消化道和絲腺，但在家蠶幼蟲期BmPiwi和BmAgo3的表達(dá)量均不高。已有文獻(xiàn)報(bào)道，Piwi家族成員參與代謝活動(dòng)，例如，果蠅中Piwi和piRNA參與脂肪代謝過程(Jonesetal.,2016)，小鼠Piwi蛋白及其相關(guān)的piRNA通過控制β細(xì)胞調(diào)控糖類代謝(Henaouietal.,2017)，但對(duì)于消化道、絲腺和馬氏管，Piwi基因可能并不發(fā)揮主要調(diào)控作用。Kawaoka等對(duì)家蠶Piwi情況進(jìn)行了探究，但其主要關(guān)注于精子發(fā)生和卵子形成，且采用的是芯片數(shù)據(jù)分析Piwi家族的表達(dá)譜，未進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證(Kawaokaetal.,2008)。本研究補(bǔ)充了家蠶Piwi亞家族基因從卵至成蟲時(shí)期表達(dá)情況，并探究了Piwi基因在各個(gè)組織中的表達(dá)情況，對(duì)家蠶的后續(xù)研究具有指導(dǎo)作用。