李媛媛，德力格爾，張 博，林 晨，石 凱*

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028043；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，呼和浩特 010022)

傘裙追寄蠅Exoristacivilis隸屬于雙翅目寄蠅科，在我國北京、內(nèi)蒙古、河北等地區(qū)都有分布(趙洪有等,1985)，是一種牧草優(yōu)勢寄生性天敵，能寄生于多種鱗翅目害蟲。但是該天敵產(chǎn)品的存放時(shí)間較短，并且運(yùn)輸也會對天敵產(chǎn)品造成一定的傷害。為了減少對天敵產(chǎn)品的損害，延長產(chǎn)品的貨架期，人工誘導(dǎo)天敵滯育是解決以上問題的重要方式，能夠幫助昆蟲度過不利環(huán)境，維持個體生存，保證種群繁衍(徐衛(wèi)華,2008)。滯育是一種應(yīng)對不利環(huán)境出現(xiàn)之前的一種遺傳性適應(yīng)，滯育的發(fā)生受外界和內(nèi)部環(huán)境因子的調(diào)控，固定在某一蟲態(tài)發(fā)育停滯的現(xiàn)象，一旦昆蟲進(jìn)入滯育狀態(tài)，即使給以適生條件亦不復(fù)蘇(Denlinger and Armbruster,2014)。滯育為昆蟲提供了巨大的適應(yīng)性優(yōu)勢，允許昆蟲在不適合的季節(jié)性環(huán)境中繼續(xù)生存，使其生命周期與適合生長、發(fā)育和繁殖的周期同步，有助于發(fā)揮生物防治在害蟲管控中的作用(Handetal.,2016)。滯育過程包括誘導(dǎo)、準(zhǔn)備、啟動、維持、終止以及滯育后發(fā)育這6個階段(Kostal,2006)。關(guān)于傘裙追寄蠅滯育調(diào)控，目前開展的研究主要集中于：滯育誘導(dǎo)的溫光周期、低溫貯藏條件、主要物質(zhì)變化含量以及滯育關(guān)聯(lián)蛋白等方面。韓海斌等對傘裙追寄蠅滯育誘導(dǎo)的溫光周期、低溫貯藏條件進(jìn)行了相關(guān)研究，明確了傘裙追寄蠅的滯育蟲態(tài)是蛹，溫度11±1℃，光周期L ∶D=8 ∶16(韓海斌等,2018)。孫程鵬等對傘裙追寄蠅滯育期間的主要物質(zhì)變化做了研究，比較分析了滯育與非滯育蟲態(tài)的糖原、海藻糖、蛋白質(zhì)、甘油含量變化，認(rèn)為糖原是滯育期間的主要抗寒物質(zhì)(孫程鵬等,2017)。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA水平研究基因表達(dá)的情況，是研究細(xì)胞功能的重要手段(Griffiths and Wang,2009)；代謝組學(xué)作為其延伸，是通過小分子代謝物的變化得出的規(guī)律來揭示其參與生命活動的機(jī)制。代謝組學(xué)為轉(zhuǎn)錄組學(xué)提供了更加表觀顯著的數(shù)據(jù)支持(Dunnetal.,2011)。對兩者進(jìn)行聯(lián)合分析，是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的生命活動由基因、蛋白質(zhì)、以及小分子代謝產(chǎn)物來共同承擔(dān)，大分子的功能性變化最終會體現(xiàn)于代謝層面，基因表達(dá)在功能水平上的微小變化會在代謝物上得到放大，從而使檢測更容易(Tengetal.,2009)。除此之外，許多基因的非功能性變化不會在代謝物上反映出來，看不到上游信息向下游信息傳遞過程中的功能性變化。

目前對家蠶Bombyxmori、七星瓢蟲Coccinellaseptempunctata、大豆食心蟲Leguminivoraglycinivorella、白紋伊蚊Aedesalbopictus、蔥蠅Deliaantigua等昆蟲均開展了滯育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究(Qietal.,2015;蔣濤,2017;任爽,2018;胡甜,2019;李新暢,2020;陳艷榮等,2021)，而利用代謝組學(xué)開展的滯育研究相對較少，主要包括柑橘大實(shí)蠅Bactroceraminax、麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis(李玉艷,2015;王攀,2020)，但是尚缺乏結(jié)合多種組學(xué)對昆蟲進(jìn)行滯育的研究。本文通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組對傘裙追寄蠅滯育蛹和非滯育蛹的差異表達(dá)基因和差異代謝物進(jìn)行聯(lián)合分析，為明確其滯育的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

傘裙追寄蠅是在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所沙爾沁基地采集獲得的，以20%蜂蜜水喂養(yǎng)；寄主粘蟲Mythimnaseparata為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原所實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，以人工飼料喂食，其幼蟲主要在長為20 cm，高為10 cm的塑料養(yǎng)蟲盒中飼養(yǎng)，待粘蟲長至5齡，轉(zhuǎn)入長為35 cm，寬為30 cm，高為10 cm亞克力養(yǎng)蟲盒飼養(yǎng)，同時(shí)放入交配好的寄蠅。每盒粘蟲與交配后的寄蠅的釋放比例為50 ∶1，在溫度25±1℃，相對濕度70%±1%，光周期16 L ∶8 D的環(huán)境條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，在亞克力盒中放入適量人工飼料，在盒中懸掛20%蜂蜜水的棉球。待寄蠅成功寄生后，將獲得寄生的末齡粘蟲放入裝有滅菌土的養(yǎng)蟲圓盒中飼養(yǎng)，每日噴清水，保持滅菌土的水分。

1.2 樣品收集

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期的研究基礎(chǔ)，獲得了傘裙追寄蠅滯育誘導(dǎo)的溫度11±1℃、光周期8 L ∶16 D、滯育的敏感蟲態(tài)為蛹。寄蠅成功寄生粘蟲后，在溫度25±1℃，光周期16 L ∶8 D，相對濕度 70%±10%環(huán)境條件下飼養(yǎng)，直至寄蠅3齡幼蟲出現(xiàn)。將一定量的寄蠅3齡幼蟲放入設(shè)置條件：溫度11±1℃，光周期8 L ∶16 D，相對濕度 70%±10%、光照強(qiáng)度為8 800 Lx人工氣候箱中持續(xù)誘導(dǎo)40 d獲得滯育蛹，將滯育蛹經(jīng)過液氮處理，放入-80℃冰箱保存；將另一部分寄蠅3齡幼蟲放入：溫度25±1℃，光周期16 L ∶8 D，相對濕度70%±10%條件繼續(xù)飼養(yǎng)，直至傘裙追寄蠅蛹出現(xiàn)，收集非滯育蛹作為對照組，將非滯育蛹經(jīng)過液氮處理，放入-80℃冰箱保存。

1.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序及差異表達(dá)基因的篩選

傘裙追寄蠅非滯育和滯育蛹的轉(zhuǎn)錄組測序工作由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。采用3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)以2頭蛹為樣本。本研究為無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析，測序完成后，過濾raw reads，去掉低質(zhì)量的reads后，將獲得的clean reads采用Trinity(Grabherretal.,2011)拼接成轉(zhuǎn)錄本，利用Corset程序?qū)D(zhuǎn)錄本進(jìn)行層次聚類，獲得最長的cluster序列進(jìn)行后續(xù)的分析(Davidson and Oshlack,2014)。

采用DESeq2對輸入的read count數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，設(shè)置篩選域值為：(1)padj<0.05；(2)|log2 FoldChange|>1；對大量的基因進(jìn)行獨(dú)立的統(tǒng)計(jì)假設(shè)檢驗(yàn)，得到的Pvalue進(jìn)行校正，P-adjusted為校正后的Pvalue，最后獲得轉(zhuǎn)錄組測序中的差異基因，P-adjusted越小，表示基因表達(dá)差異越顯著。

1.4 代謝組學(xué)檢測及差異代謝物的篩選

傘裙追寄蠅非滯育和滯育蛹的代謝組測序采用6個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)以2頭蛹為樣本。基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)研究，基于質(zhì)譜檢測得到的Raw文件，先將原始文件導(dǎo)入CD軟件中，進(jìn)行譜圖處理并進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索，然后對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控保證數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確度、可靠性，代謝物分子式預(yù)測使用mzCloud數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。代謝物主要進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析包括主成分分析(Principal component analysis，PCA)、偏最小二乘法分析(PLS-DA)等揭示不同比對組別代謝物組成的差異。利用層次聚類和代謝物-代謝物相關(guān)性分析揭示了代謝物和樣本之間的關(guān)系。最后，通過代謝通路等功能分析發(fā)現(xiàn)代謝物相關(guān)的生物學(xué)意義。

采用PLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(Variable Importance in theProjection，VIP)值，并結(jié)合T-test的P值來尋找差異性表達(dá)代謝物，設(shè)置閾值為VIP>1.0，差異倍數(shù)FC>2.0或FC<0.5且Pvalue<0.05。

1.5 轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析

1.5.1差異基因和差異代謝物的相關(guān)性分析

基于皮爾森相關(guān)系數(shù)對傘裙追寄蠅顯著差異基因、差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析，以此來衡量差異基因與代謝物之間的關(guān)聯(lián)程度。當(dāng)相關(guān)系數(shù)<0時(shí)，為負(fù)相關(guān)；當(dāng)相關(guān)系數(shù)>0時(shí)，為正相關(guān)。展示Top 50的差異代謝物(按Pvalue從小到大排序)和Top 100的差異基因(按Pvalue 從小到大排序)；若差異代謝物數(shù)目<50或差異基因數(shù)目<100，則展示所有的差異代謝物或所有的差異基因。

1.5.2差異基因與差異代謝物的KEGG數(shù)據(jù)庫映射

將所有差異表達(dá)基因與差異表達(dá)代謝物同時(shí)向KEGG映射，獲得兩者共同的pathway信息，明確差異表達(dá)基因與差異代謝物共同參與的主要生化途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序與組裝

滯育組中的原始序列為176 530 572，非滯育組中的原始序列為169 609 048；過濾后，獲得滯育組171 785 530 clean reads，獲得非滯育組165 045 546 clean reads。經(jīng)過拼接，共獲得137 725轉(zhuǎn)錄本，其平均長度為1 367 bp，然后轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過進(jìn)一步組裝，共獲得58 050 unigenes(如圖1)。

圖1 拼接轉(zhuǎn)錄本與基因序列長度分布圖Fig.1 Transcripts with unigenes sequence length distribution

2.2 差異表達(dá)基因的篩選

通過篩選條件padj<0.05且|log2FoldChange|>1，確定了傘裙追寄蠅滯育蛹和非滯育蛹的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)個數(shù)為7 513個，其中4 355個上調(diào)表達(dá)，3 158個下調(diào)表達(dá)(圖2)。而經(jīng)過KEGG數(shù)據(jù)庫注釋成功的基因共有2 642個，映射到223條通路中，被分成代謝、遺傳信息加工、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程和有機(jī)體系統(tǒng)這5個類別。

圖2 傘裙追寄蠅滯育和非滯育蛹的差異表達(dá)基因火山圖Fig.2 Volcanoplot of differentially expressed gene between D and ND pupaes of Exorista civilis

2.3 樣品檢測及差異代謝物篩選

經(jīng)檢測，傘裙追寄蠅非滯育(non-diapause,ND)與滯育(diapause,D)蛹的總樣品，無論在正離子模式下還是在負(fù)離子模式下，在PCA圖上，合格的質(zhì)量控制(quality control,QC)樣本，用于測定進(jìn)樣前儀器狀態(tài)及平衡色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)，并用于評價(jià)整個實(shí)驗(yàn)過程中系統(tǒng)穩(wěn)定性。差異較小，呈現(xiàn)聚集分布，說明對傘裙追寄蠅非滯育、滯育蛹樣品的分析方法穩(wěn)定性較好，數(shù)據(jù)質(zhì)量較高(圖3-A,B)。

圖3 傘裙追寄蠅非滯育與滯育蛹總樣品的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of total samples of non-diapause and diapause pupae of Exorista civilis 注：A，負(fù)離子模式；B，正離子模式。圖中橫坐標(biāo)PC1和縱坐標(biāo)PC2分別表示排名第一和第二的主成分的得分，散點(diǎn)顏色表示樣本的實(shí)驗(yàn)分組，置信橢圓為95%。Note:A,Negative model;B,Positive model.In the figure,the abscissa PC1 and the ordinate PC2 represented the scores of the first and second principal components respectively,and the color of the scatter indicated the experimental groups of the samples,with a confidence ellipse of 95%.

在兩種模式下共檢測獲得差異代謝物501個，在負(fù)離子模式下，篩選出差異代謝物169個，其中99個上調(diào)，70個下調(diào)。在正離子模式下，篩選出332個差異代謝物，其中268個上調(diào)，64個下調(diào)。

2.4 差異基因與差異代謝物表達(dá)相關(guān)性分析

圖4中聚類枝越短表示差異表達(dá)基因或差異代謝物的相似性越高。藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)，紅色表示正相關(guān)。通過分析發(fā)現(xiàn)基因與代謝物是正相關(guān)的是：在負(fù)離子模式下，注釋為肌動蛋白β/γ1，肌球蛋白重鏈，丙烯基硫酸酶B，原肌球蛋白1等80個差異基因與注釋為L-組氨酸等22個差異代謝物呈正相關(guān)，注釋為酪氨酸酶，乙酰膽堿酯酶等20個差異基因和注釋為2-羥基戊二酸、6-胍基己酸、N-乙酰-DL-谷氨酸、高肌肽、肌肽等28個差異代謝物呈正相關(guān)。注釋為肌動蛋白β/γ1，肌球蛋白重鏈，丙烯基硫酸酶B，原肌球蛋白1等80個差異基因和注釋為2-羥基戊二酸、6-胍基己酸、N-乙酰-DL-谷氨酸、高肌肽、肌肽等28個差異代謝物呈負(fù)相關(guān)，注釋為酪氨酸酶，乙酰膽堿酯酶20個差異基因和注釋為2-羥基戊二酸、6-胍基己酸、N-乙酰-DL-谷氨酸、高肌肽、肌肽等28個差異代謝物呈負(fù)相關(guān)。

圖4 傘裙追寄蠅滯育和非滯育蛹差異基因與差異代謝物表達(dá)相關(guān)性分析熱圖Fig.4 Heat map of correlation analysis between DEMs and DEGs of Exorista civilis注：A，負(fù)離子模式；B，正離子模式?？v向表示差異表達(dá)基因的聚類，橫向表示差異代謝物的聚類。Note:A,Negative ion mode;B,Positive ion mode.Vertical axis indicated clustering of differentially expressed genes and horizontal axis indicated clustering of differential metabolites.

在正離子模式下，肌球蛋白重鏈、丙烯基硫酸酶B、肌動蛋白β/γ1，鈣調(diào)蛋白等80個差異基因和注釋為L-苯丙氨酸、5-甲基胞嘧啶、D-(+)-脯氨酸、1-甲基-L-組氨酸等39個差異代謝物呈正相關(guān)，酪氨酸酶，乙酰膽堿酯酶等20個差異基因和DL-二棕櫚酰磷脂酰膽堿等11個差異代謝物呈正相關(guān)，酪氨酸酶，乙酰膽堿酯酶等20個差異基因和L-苯丙氨酸、5-甲基胞嘧啶、D-(+)-脯氨酸、1-甲基-L-組氨酸等39個差異代謝物呈負(fù)相關(guān)，80個差異基因和DL-二棕櫚酰磷脂酰膽堿等11個差異代謝物呈負(fù)相關(guān)。

2.5 差異基因與差異代謝物pathway分析

在負(fù)離子模式下，差異表達(dá)基因與差異代謝物在氨基酸代謝、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)方面關(guān)聯(lián)性較高，差異表達(dá)基因和差異表達(dá)代謝物共富集到31條通路，其中差異基因和代謝物富集個數(shù)在2種以上的通路為16條，富集的差異代謝物主要為：UDP-N-乙酰葡糖胺、D-葡糖胺-6-磷酸鹽、肌肽、L-組氨酸、組胺、花生四烯酸、順式烏頭酸、檸檬酸、高肌肽、4-氧代脯氨酸、磷酸精氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、赤蘚糖醇、UDP-N-乙酰葡萄糖胺、D-氨基葡萄糖6-磷酸。其中，檸檬酸循環(huán)中，富集到28個差異表達(dá)基因，2種差異代謝物；在氨基糖和核苷酸糖代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)中，富集到17個差異表達(dá)基因，2種差異代謝物；在精氨酸和脯氨酸代謝(Arginine and proline metabolism)中，富集到21個差異表達(dá)基因，5種差異代謝物。

在正離子模式下，差異表達(dá)基因與差異代謝物在消化系統(tǒng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)聯(lián)性較高。DEGs和DEMs共富集到39條通路，其中差異基因和代謝物富集個數(shù)在2種以上的通路為15條。富集的差異代謝物主要為：L-苯丙氨酸、鈣三醇、L-組氨酸、L-酪氨酸、乙酰膽堿、腺苷-5′-單磷酸鹽、1-甲基組氨酸、苯甲酸。在兩種離子模式下，差異代謝物為氨基酸所占的比重最多。其中，在叉頭轉(zhuǎn)錄因子通路中，富集了11差異表達(dá)基因，1種差異代謝物；在cAMP信號通路中，富集到31個差異表達(dá)基因，1種差異代謝物(如圖5)。

圖5 傘裙追寄蠅差異基因與差異代謝物KEGG通路關(guān)聯(lián)分析Fig.5 Association analysis of differential genes and differential metabolite KEGG pathway in Exorista civilis注：A，負(fù)離子模式；B，正離子模式。橫坐標(biāo)為該通路中富集到的差異代謝物或差異基因與該通路中注釋到的代謝物或基因個數(shù)的比值(Ratio)，縱坐標(biāo)為代謝組-轉(zhuǎn)錄組共同富集到的KEGG通路。數(shù)量，通路中富集的代謝物或基因的個數(shù)。Note:A,Negative ion mode;B,Positive ion mode.The horizontal coordinate was the ratio of differential metabolites or differential genes enriched in the pathway to the number of metabolites or genes annotated in the pathway,and the vertical coordinate was the metabolome-transcriptome co-enriched to the KEGG pathway.Count,the number of metabolites or genes enriched in the pathway.

通過對傘裙追寄蠅滯育關(guān)聯(lián)基因和滯育關(guān)聯(lián)代謝物的聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，cAMP通路包括的31個DEGs，其中22個DEGs上調(diào)表達(dá)，主要有蛋白激酶A、鈣調(diào)蛋白；9個DEGs下調(diào)表達(dá)，主要有RAC1。DEMs主要為腺苷-5′-單磷酸，乙酰膽堿。差異代謝物腺苷-5′-單磷酸(Adenosine 5′-monophosphate,AMP)還參與調(diào)控胰島素信號途徑、FOXO信號通路、糖酵解，進(jìn)而影響到鈣調(diào)蛋白、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)的表達(dá)(如圖6)。在負(fù)離子模式下，發(fā)現(xiàn)檸檬酸循環(huán)中，獲得KEGG成功注釋的差異表達(dá)基因?yàn)?8個，上調(diào)的差異表達(dá)基因?yàn)?7個，下調(diào)表達(dá)的差異基因?yàn)?個，即PEPCK，下調(diào)倍數(shù)為9.43倍，在代謝組學(xué)中發(fā)現(xiàn)滯育關(guān)聯(lián)代謝物為檸檬酸，下調(diào)表達(dá)2.97倍。

圖6 傘裙追寄蠅滯育關(guān)聯(lián)基因和滯育關(guān)聯(lián)代謝物富集通圖Fig.6 Enrichment pathways for diapause-associated genes and diapause-associated metabolites of Exorista civilis注：紅方框表示差異基因上調(diào)，綠方框表示差異基因下調(diào)，紅色橢圓表示差異代謝物上調(diào)。Note:Red boxes indicated differential gene up-regulated,green boxes indicated differential gene down-regulated,and red ovals indicated differential metabolite up-regulated.

在氨酰-tRNA的生物合成中，苯丙氨酸在正、負(fù)離子兩種模式下均表達(dá)上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)最高約為2.80倍，苯丙氨酰-tRNA合成酶α鏈(phenylalanyl-tRNA synthetase alpha chain,pheS)表達(dá)上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)為2.37倍；另外在正離子模式下，酪氨酸表達(dá)上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)2.44倍。

但是在兩種離子模式下，未發(fā)現(xiàn)同時(shí)在轉(zhuǎn)錄組和代謝組中顯著富集的通路，在轉(zhuǎn)錄組和代謝組中任一存在顯著性富集的通路見表1。在負(fù)離子模式下，顯著性富集的通路主要有檸檬酸循環(huán)、礦物質(zhì)吸收、癌癥的中樞碳代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、蛋白質(zhì)的消化和吸收、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子、組氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝，在正離子模式下，主要有氨基乙酰-tRNA的生物合成、組氨酸代謝、癌癥的中樞碳代謝。

3 結(jié)論與討論

在雙翅目昆蟲體內(nèi)，蛻皮激素的合成不以cAMP為第二信使，而是依賴于鈣離子，鈣離子和鈣調(diào)蛋白結(jié)合，在家蠶、煙草天蛾Manducasexta的研究中發(fā)現(xiàn)，cAMP是活化PTTH的第二信使(Hua and Koolman,1995)，導(dǎo)致依賴于cAMP的蛋白激酶活化，最終導(dǎo)致蛻皮激素的合成和分泌的增加(王蔭長等,2004)。在正離子模式下，在傘裙追寄蠅cAMP信號途徑中，cAMP轉(zhuǎn)化為差異代謝物AMP，AMP上調(diào)表達(dá)，其作為中間產(chǎn)物參與胰島素信號途徑、FoXO信號通路、糖酵解途經(jīng)的代謝過程。本研究中AMP通過調(diào)控FoXO，F(xiàn)oXO作為糖酵解的上游基因，對PEPCK產(chǎn)生影響，PEPCK活性主要反映在轉(zhuǎn)錄組水平上，其表達(dá)水平直接對糖異生產(chǎn)生影響，在調(diào)控機(jī)體代謝中發(fā)揮著重要的作用(Hanson and Reshef,1997)。研究表明胰島素信號途徑主要通過促進(jìn)糖原或海藻糖的合成，抑制糖異生的作用(彭竹清和郝友進(jìn),2019)。在傘裙追寄蠅的轉(zhuǎn)錄組測序中，確實(shí)發(fā)現(xiàn)PEPCK表達(dá)下調(diào)，作為糖異生重要限速酶，抑制了糖異生的第一步，說明糖異生途徑受到抑制。但與之不同的是肉蠅Sarcophagaperegrina和果蠅Drosophilamelanogaster在滯育期間，PEPCK基因的表達(dá)顯著增強(qiáng)；滯育解除后，其表達(dá)量明顯下降(Hahn and Denlinger,2011)。在蘋果實(shí)蠅Rhagoletispomonella滯育后期，代謝由抑制狀態(tài)恢復(fù)的24 h內(nèi)，PEPCK表達(dá)量下降(Raglandetal.,2011)。并且與白紋伊蚊、麻蠅Sarcophagacrassipalpis滯育期間的PEPCK表達(dá)趨勢也不同，其PEPCK在滯育期間表達(dá)量較為豐富(Raglandetal.,2010;Poelchauetal.,2011)。然而傘裙追寄蠅PEPCK表達(dá)結(jié)果與麗蠅蛹集金小蜂在滯育期間的表達(dá)趨勢相同(高飛等,2020)。胰島素作為重要的內(nèi)分泌激素，其通路還能夠參與果蠅等一些昆蟲的滯育誘導(dǎo)調(diào)控。Tatar等(2001)干擾果蠅胰島素信號后，發(fā)現(xiàn)果蠅繁殖停止、體內(nèi)能量儲備開始增加。在尖音庫蚊Culexpipiens、家蠶滯育的研究中發(fā)現(xiàn)，胰島素信號通路不獨(dú)立對昆蟲滯育調(diào)控產(chǎn)生作用，而是作為中介接受上游通路信號，或是將信號傳遞給下游內(nèi)分泌通路(梁瀚清等,2014)。這些結(jié)果與本研究胰島素信號通路參與的滯育調(diào)控方式具有一致性。

在負(fù)離子模式下，檸檬酸循環(huán)中，除了PEPCK表達(dá)下調(diào)外，其他差異表達(dá)基因均表達(dá)上調(diào)，在糖酵解中，己糖激酶表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)6-磷酸葡萄糖進(jìn)入糖酵解，通過上調(diào)表達(dá)的丙酮酸脫氫酶促進(jìn)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，從而進(jìn)入TCA循環(huán)。在該通路中，差異代謝物順式烏頭酸、檸檬酸均為表達(dá)下調(diào)，這個下調(diào)表達(dá)趨勢與差異表達(dá)基因PEPCK一致，雖然不能明確其下調(diào)原因，但是可以推測PEPCK對糖異生起著抑制的作用，而糖酵解途徑是被激活的。

組成蛋白質(zhì)分子的20種氨基酸在合成蛋白質(zhì)之前，均必須活化以獲取能量?；罨磻?yīng)是在專門的氨酰-tRNA合成酶催化下進(jìn)行的。在氨酰-tRNA的生物合成中，苯丙氨酸表達(dá)上調(diào)，在西藏飛蝗Locustamigratoriatibetensis抗寒物質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)，低溫馴化和短光照條件下，其苯丙氨酸也出現(xiàn)累積的情況(朱昱翰,2014)，這與傘裙追寄蠅滯育期間苯丙氨酸的代謝組結(jié)果具有一致性。另外，黑色素源于酪氨酸，苯丙氨酸是合成酪氨酸的前體物質(zhì)，傘裙追寄蠅滯育期間酪氨酸表達(dá)上調(diào)，表明傘裙追寄蠅滯育期間與苯丙氨酸相關(guān)的蛋白質(zhì)合成在活化過程中是較為活躍的。在家蠶幼蟲斑紋黑色素合成的主要來源是苯丙氨酸羥化酶催化苯丙氨酸生成的酪氨酸(陳萍,2011)，推測苯丙氨酸以及相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，可能對傘裙追寄蠅滯育期間蛹表皮的黑色素沉積有著重要的影響。

然而目前對于傘裙追寄蠅滯育過程，即誘導(dǎo)、準(zhǔn)備、啟動、維持、終止時(shí)期，起到關(guān)鍵作用的特異性表達(dá)基因仍不清楚，滯育中某一過程的滯育關(guān)聯(lián)基因有待于進(jìn)一步研究。