李新宇，馬衛(wèi)華，杜亞麗，徐 凱，姜玉鎖

(1.山東輕工職業(yè)學(xué)院，山東淄博 255300；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太原 030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；4.吉林省養(yǎng)蜂研究所，吉林吉林 132001；5.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801)

溫度是影響昆蟲生理狀況和生存狀態(tài)的重要非生物因素。蜜蜂屬于變溫動物，其個體保持和調(diào)節(jié)體溫的能力不強，外界環(huán)境溫度的變化會對蜜蜂生理代謝產(chǎn)生影響，如導(dǎo)致蜜蜂的應(yīng)激反應(yīng)、改變生理代謝、影響成蟲的存活、幼蟲的發(fā)育等(Kiuchietal.,2008;Bauerfeind and Fischer,2013;Colinetetal.,2018)。當(dāng)外界環(huán)境溫度超過蜜蜂所能承受的范圍時，蜜蜂的各項生命活動和體內(nèi)的生理代謝都會受到嚴(yán)重的干擾。

高溫可以改變細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，對細(xì)胞骨架造成損傷，還會影響蛋白質(zhì)的合成過程(杜堯等,2007)。蜜蜂在長期的進(jìn)化過程中進(jìn)化出了一系列措施來應(yīng)對溫度脅迫，如調(diào)整自身代謝，合成保護(hù)蛋白等，以減緩或者修復(fù)高溫脅迫對機(jī)體造成的傷害。其中最顯著的機(jī)體響應(yīng)就是抗逆蛋白的誘導(dǎo)產(chǎn)生，目前來說，在眾多抗逆基因中，熱激蛋白基因家族發(fā)揮著極其重要的作用，它是生物細(xì)胞在面臨多種應(yīng)激條件下所產(chǎn)生的一類維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)平衡的蛋白(Feder and Hofmann,1999)。熱激蛋白具有能夠維持細(xì)胞骨架穩(wěn)定、抑制蛋白質(zhì)變性、恢復(fù)變性蛋白原有的空間結(jié)構(gòu)和生物活性的生物功能。目前的研究發(fā)現(xiàn)了很多參與昆蟲抗逆的基因，其中以熱激蛋白基因為主(Huangetal.,2007)，其次還包括鋅指蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶等(Krupaetal.,2004;Duanetal.,2008)。

鋅指蛋白(Zinc finger proteins，ZFPs)通常是指蛋白結(jié)構(gòu)中含有一段自身折疊形成的手指狀結(jié)構(gòu)，且常與Zn2+結(jié)合的一類蛋白質(zhì)。最早的鋅指蛋白是在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的(Frankel and Pabo,1988)，之后，許多其他鋅指蛋白又被陸續(xù)鑒定出來。鋅指蛋白在真核生物中廣泛分布，通常由半胱氨酸和組氨酸組成，通過與Zn2+結(jié)合來維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；其結(jié)構(gòu)非常多樣，其中絕大多數(shù)鋅指蛋白為類C2H2鋅指、高音譜號鋅指、鋼卷尺狀鋅指(趙楠等,2009)。鋅指蛋白具有許多不同的功能，包括轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡的調(diào)控、蛋白質(zhì)折疊和組裝以及脂質(zhì)結(jié)合等。隨著對鋅指結(jié)構(gòu)研究的深入，許多具有新型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的鋅指蛋白逐漸被人們認(rèn)識到，這些發(fā)現(xiàn)可幫助進(jìn)一步了解鋅指蛋白的生物學(xué)功能。例如，通過對經(jīng)典的C2H2結(jié)構(gòu)的鋅指蛋白的深入研究使人們對其與DNA結(jié)合的機(jī)制有了新的認(rèn)識(Johnetal.,2001)。鋅指蛋白作為一類轉(zhuǎn)錄因子，不僅可以調(diào)控基因的表達(dá)和細(xì)胞的分化，還在動植物抗逆方面發(fā)揮重要作用。鋅指蛋白能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控，是由于它能與生物大分子結(jié)合，或者通過鋅指蛋白間的結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。Zn2+是影響鋅指蛋白功能的關(guān)鍵因素，可以通過鋅指結(jié)構(gòu)，使激活子蛋白與增強子序列特異性結(jié)合而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。鋅指蛋白參與生物體應(yīng)對多種生物或非生物因素脅迫的抗逆機(jī)制(Girietal.,2011)，在機(jī)體應(yīng)對高溫脅迫時，多個鋅指蛋白基因在其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用(Drolletal.,2013)。

ZFP37是C2H2型鋅指蛋白家族中的一員，被認(rèn)為在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，ZFP37主要在成年小鼠睪丸和大腦中表達(dá)，這表明其可能在控制小鼠精子生成中發(fā)揮潛在的作用(Payenetal.,1998)。同樣的，ZFP37也被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡(Zhangetal.,2019)?，F(xiàn)階段，對于ZFP37的生物功能的研究多集中在小鼠和哺乳動物的生殖代謝上，在昆蟲中的作用鮮見報道。

中華蜜蜂Apisceranacerana是我國本土蜂種，其生活習(xí)性適應(yīng)了我國多變的自然環(huán)境，對于維持我國生態(tài)平衡起著重要作用(Zhangetal.,2014)，相比其他常見蜂種，中華蜜蜂具有抗逆性和抗螨能力強等優(yōu)勢(曾志將等,2002;Yang,2005)。本試驗根據(jù)之前的研究結(jié)果，選取中華蜜蜂在高溫脅迫下響應(yīng)較強的一個基因ZFP37，對其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，研究脅迫溫度和脅迫時間對其表達(dá)的影響，以探究中華蜜蜂在遭受熱脅迫時ZFP37可能發(fā)揮的生理功能，為蜜蜂抗熱機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

試驗所需中華蜜蜂由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院實驗蜂場提供，選取健康無病蜂群3群。每群各選取1～2張老熟的封蓋子脾，置于34℃±0.5℃和RH 75%～80%條件下孵育。待幼蜂大量出房后，收集出房幼蜂并標(biāo)記(N=500/群)，將標(biāo)記的幼蜂放回原蜂群飼養(yǎng)，采集20日齡的標(biāo)記蜜蜂作為試驗樣品。

1.2 溫度脅迫

從每群隨機(jī)選取300頭標(biāo)記的20日齡工蜂，將蜜蜂隨機(jī)分為若干組，置于15 mL離心管中，每管放置1頭蜜蜂，離心管上扎有小孔，確保蜜蜂處于設(shè)置的溫濕度條件下，之后將試驗蜜蜂放入恒溫恒濕箱中，濕度設(shè)置為RH 30%，溫度分別為25℃、30℃、35℃、40℃和45℃，脅迫2 h。高溫不同脅迫時間的處理為：在45℃，RH 30%條件下分別脅迫處理0.5 h、1 h、1.5 h和2 h，其中0 h 處理組的蜜蜂直接采自蜂箱中的標(biāo)記蜜蜂。處理完成后，隨機(jī)選擇5頭蜜蜂作為1個生物學(xué)重復(fù)用于提取RNA，每個處理組包括3個生物學(xué)重復(fù)，立即將蜜蜂投入液氮中，于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

Trizol試劑盒(Ambion)，PrimeScriptTM RT-PCR reagent Kit試劑盒(TaKaRa)，SYBR Premix Ex Taq TM 試劑盒(TaKaRa)，HWS0358恒溫恒濕箱(江南儀器廠)，Veriti?96 well梯度PCR儀(ABI)，7500熒光定量PCR儀(ABI)，ND-1000核酸蛋白測定儀(Nanodrop)，紫外凝膠成像儀(BIO-RAD)，DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀，5810R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)。

1.4 RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

使用Trizol試劑盒提取不同樣品總RNA，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析提取的RNA質(zhì)量，最后將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.5 引物設(shè)計

通過東方蜜蜂全基因組測序數(shù)據(jù)(NC_014295.1)，查找中華蜜蜂ZFP37基因序列，根據(jù)所得序列的CDS區(qū)使用Primer 3軟件設(shè)計RT-qPCR引物。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.6 RT-qPCR反應(yīng)

將cDNA模板稀釋備用，使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系總體積為10 μL，其中包括5 μL SYBR Premix Ex TaqTMII，1 μL cDNA，0.2 μL ROX Reference Dye II (50×)，上、下游引物各0.4 μL，無菌水 3 μL。qRT-PCR熱循環(huán)程序如下：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火及延伸34 s，45個循環(huán)。用β-actin作為內(nèi)標(biāo)基因，每個組織樣本重復(fù)測定3次。

1.7 序列分析

通過多種生物信息學(xué)軟件對中華蜜蜂ZFP37的序列進(jìn)行預(yù)測分析，所用各軟件如表2。

表2 生物信息學(xué)分析所用軟件Table 2 Software for bioinformatics analysis

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

對于qRT-PCR試驗結(jié)果，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及熒光曲線的Ct值，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。運用SPSS 21軟件中的單因素ANOVA方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(P<0.05)，正態(tài)性檢驗，方差齊性檢驗，對于未通過這些檢驗的數(shù)據(jù)，使用Kruskal-Wallis H檢驗(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華蜜蜂ZFP37編碼蛋白分析

分析中華蜜蜂ZFP37基因序列后發(fā)現(xiàn)，其開放閱讀框(ORF)全長1 413 bp。該基因編碼123個氨基酸，分子量為13.7 kDa，其中包含19種常見氨基酸，不含Trp；Lys含量最高(8.1%)，Tyr含量最低(1.6%)，等電點為8.72，脂溶指數(shù)為53.09，平均親水力為-0.737，不穩(wěn)定系數(shù)為39.41。

2.2 中華蜜蜂ZFP37的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、糖基化位點、磷酸化位點預(yù)測

中華蜜蜂ZFP37信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，其全部氨基酸的S值均在閾值以下，表明其無信號肽區(qū)域(圖1)?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示中華蜜蜂ZFP37各氨基酸的預(yù)測值均大于閾值1，說明蛋白全部在膜外，無跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于膜蛋白(圖2)。

圖1 中蜂ZFP37信號肽結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.1 Predicted signal peptide of AcerZFP37

圖2 中蜂ZFP37跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.2 Predicted transmembrane regions of AcerZFP37

蛋白糖基化位點預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白Thr60的O糖基潛力值高于閾值0.5達(dá)到0.756，說明中華蜜蜂ZFP37存在O糖基化位點；N-糖基化位點預(yù)測顯示所有位點潛力值均小于閾值，未預(yù)測到帶相應(yīng)的N糖基化位點(圖3)。蛋白磷酸化位點預(yù)測結(jié)果表明：中華蜜蜂ZFP37存在磷酸化位點，且出現(xiàn)在絲氨酸Ser、蘇氨酸Thr以及酪氨酸Tyr這 3種氨基酸殘基上。包含12個磷酸化位點，分別是Ser20、Thr21、Ser29、Thr39、Thr60、Ser67、Ser68、Tyr69、Ser70、Tyr78、Ser83、Ser107(圖4)。

圖3 中蜂ZFP37糖基化位點的預(yù)測Fig.3 Predicted glycosylation of AcerZFP37

圖4 中蜂ZFP37磷酸化位點的預(yù)測Fig.4 Predicted phosphorylation sites of AcerZFP37

2.3 中華蜜蜂ZFP37蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

中華蜜蜂ZFP37蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果顯示：中華蜜蜂ZFP37的二級結(jié)構(gòu)主要包括3種結(jié)構(gòu)：α螺旋、股和環(huán)，所占比例分別為8.13%、10.57%和81.3%。而三級結(jié)構(gòu)中主要包括α螺旋和β折疊(圖5)。

圖5 中蜂ZFP37二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.5 Predicted secondary and tertiary structure of AcerZFP37注：A，中蜂ZFP37的二級結(jié)構(gòu)；B，中蜂ZFP37的三級結(jié)構(gòu)。Note:A,Secondary structure of AcerZFP37;B,Tertiary structure of the AcerZFP37.

2.4 中華蜜蜂ZFP37的進(jìn)化樹分析

根據(jù)NCBI Blast檢索到若干膜翅目昆蟲ZFP37氨基酸序列，并利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建包含中蜂在內(nèi)的系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果如圖6，結(jié)果顯示：構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹所用的昆蟲聚類主要分為3個分支，第一分支由中華蜜蜂、大蜜蜂Apisdorsata、迴條蜂Habropodalaboriosal、駝切葉蟻Cyphomyrmexcostatus和切葉蟻Acromyrmexechinatior組成，第二分支為小蜜蜂Apisflorea和美洲東部熊蜂Bombusimpatiens，而第三分支則為佛羅里達(dá)弓背蟻Camponotusfloridanus、歐洲熊蜂Bombusterrestris和西方蜜蜂Apismellifera。其中，中華蜜蜂ZFP37序列與大蜜蜂的相似性最高，而與其他膜翅目昆蟲的相似性存在差異，表明其具有較高的變異性。

圖6 不同昆蟲ZFP37氨基酸序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of ZFP37 from different insect species based on amino acid sequences注：中華蜜蜂，Apis cerana cerana，PBC34093.1；西方蜜蜂，Apis mellifera，XP 006562781.1；小蜜蜂，Apis florea，XP 003694613.1；大蜜蜂，Apis dorsata，XP 031367390.1；歐洲熊蜂，Bombus terrestris，XP 012166515.1；美洲東部熊蜂，Bombus impatiens，XP 003492637.1；佛羅里達(dá)弓背蟻，Camponotus floridanus，XP 025268432.1；迴條蜂，Habropoda laboriosal，KOC69890.1；駝切葉蟻，Cyphomyrmex costatus，KYN01212.1；切葉蟻，Acromyrmex echinatior，EGI62930.1。

2.5 不同溫度脅迫對中華蜜蜂ZFP37表達(dá)的影響

中華蜜蜂(20日齡成蜂)暴露于不同溫度下(25℃、30℃、35℃、40℃和45℃)2 h，ZFP37在不同溫度下的mRNA相對表達(dá)量會受高溫脅迫的影響，不同溫度處理間的表達(dá)存在顯著差異(P<0.05)，ZFP37的表達(dá)模式，從25℃至45℃間總體上表現(xiàn)出前低后高的趨勢，高溫處理能使ZFP37表達(dá)上調(diào)，尤其是45℃處理組。ZFP37在45℃時表達(dá)量最高，且顯著高于其他處理組(P<0.05)。

圖7 中華蜜蜂ZFP37在不同溫度下的mRNA相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of ZFP37 mRNA in response to different temperature treatments注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同的字母表示不同溫度處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同。Note:Data were mean±SE.Different letters above bars indicated significant difference at the 0.05 level between different temperature treatments.Same below.

2.6 不同脅迫時間對中華蜜蜂ZFP37表達(dá)的影響

中華蜜蜂(20日齡成蜂)暴露于45℃不同處理時間下(0 h、0.5 h、1 h、1.5 h和2 h)，ZFP37在不同處理時間下的mRNA相對表達(dá)量會受高溫脅迫時間的影響，不同脅迫時間處理組的表達(dá)存在顯著差異(P<0.05)，ZFP37的表達(dá)模式從0 h至2 h間總體上表現(xiàn)出前低后高的趨勢，說明處理時間的延長能使ZFP37表達(dá)上調(diào)。ZFP37在1.5 h表達(dá)水平最高，顯著高于0 h和1 h處理組(P<0.05)，0 h表達(dá)量最低，且顯著低于其他處理組(P<0.05)。

圖8 中華蜜蜂 ZFP37在不同脅迫時間下的mRNA相對表達(dá)量Fig.8 Relative expression levels of ZFP37 mRNA in response to different process time

3 結(jié)論與討論

鋅指蛋白作為一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子在真核生物中分布十分廣泛，在動植物、酵母等真菌中都有發(fā)現(xiàn)(Caoetal.,2016;Yuanetal.,2018)。鋅指蛋白參與生命調(diào)控的方式主要是與DNA、RNA或蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，之后在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平上對相關(guān)生命活動進(jìn)行調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白能夠參與到生物的基因調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)等生命過程(Nakashimaetal.,2002;Jangetal.,2016;Imbeaultetal.,2017)。動植物在環(huán)境壓力脅迫下，其體內(nèi)多個調(diào)控蛋白的基因會表達(dá)增加，進(jìn)而調(diào)控下游效應(yīng)基因，改變機(jī)體的生理代謝并引發(fā)相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，幫助生物體應(yīng)對環(huán)境脅迫(Hranitzetal.,2010;kerletal.,2010;Liuetal.,2012;Guanetal.,2016)。本研究發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂ZFP37無跨膜結(jié)構(gòu)域，不屬于膜蛋白，這一結(jié)果也與其轉(zhuǎn)錄因子的身份相對應(yīng)。通過序列比對發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂ZFP37的序列與蜜蜂科昆蟲的相似性最高，而與其他膜翅目昆蟲相似性存在差異，這可能與昆蟲的生活環(huán)境和習(xí)性有關(guān)。

蜜蜂在面對各種環(huán)境脅迫時會作出相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，其中合成抗逆蛋白是最主要的抗逆方式，常見的抗逆蛋白主要有熱激蛋白和鋅指蛋白等。而研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲遭受溫度脅迫后，一些抗逆基因的高表達(dá)能提高昆蟲耐受性，在眾多抗逆基因中，熱激蛋白基因家族發(fā)揮著極其重要的作用，在多種應(yīng)激條件下機(jī)體產(chǎn)生的熱激蛋白可以顯著提高生物的耐受性(Huangetal.,2007)。鋅指蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用在昆蟲響應(yīng)環(huán)境脅迫中發(fā)揮重要作用(Andrewetal.,2006)，因此，鋅指蛋白是幫助生物體應(yīng)對各類脅迫的重要抗逆蛋白，在生物體抗逆過程中的調(diào)控作用一直受到研究者的關(guān)注。

本研究結(jié)果表明ZFP37在不同溫度下的表達(dá)模式存在顯著差異，在45℃處理下表達(dá)水平最高，說明高溫能顯著提高ZFP37的表達(dá)水平，中華蜜蜂ZFP37的表達(dá)受高溫脅迫的誘導(dǎo)，ZFP37能對高溫脅迫做出快速的響應(yīng)。同樣的，高溫下不同脅迫時間的處理結(jié)果顯示，中華蜜蜂ZFP37的表達(dá)受脅迫時間的誘導(dǎo)，長時間的高溫脅迫可以導(dǎo)致ZFP37表達(dá)增加。因此在高溫脅迫下，多個鋅指蛋白基因被激活，其中既有表達(dá)上調(diào)的，也有表達(dá)下調(diào)的，推斷ZFP37的活化可能是蜜蜂調(diào)節(jié)耐受性的一項重要機(jī)制。參考對意大利蜜蜂ApismelliferaligusticaZFP37的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩者ZFP37的氨基酸組成及蛋白各項理化性質(zhì)非常相似，中華蜜蜂和意大利蜜蜂的ZFP37均無信號肽區(qū)域，都屬于無跨膜結(jié)構(gòu)的膜外蛋白，都含有相應(yīng)的O糖基化位點和磷酸化位點，且兩者的二、三級結(jié)構(gòu)也較為相似，這一結(jié)果也與兩者親緣關(guān)系較近這一情況相對應(yīng)。本研究認(rèn)為ZFP37在中華蜜蜂和意大利蜜蜂體內(nèi)的作用是相似的，都可能參與了蜜蜂抗逆過程的代謝調(diào)節(jié)。蜜蜂調(diào)節(jié)耐受性的一項重要機(jī)制鋅指蛋白對蜜蜂的耐熱性具有重要的調(diào)節(jié)作用，但其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚，還需要進(jìn)一步的深入研究。