孫海紅， 董國強， 蔡 葵， 呂享華， 孫永紅， 薛魯燕， 張瑞巧， 王文嬌， 趙征宇， 石大川

(1.青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東青島 266100； 2.青島市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，山東青島 266100)

油茶(Abel)是山茶花中一種重要的木本食用油料樹種，它主要分布于我國的湖南、湖北、江西、廣西、浙江和福建等省份，是我國獨有的一種食用油料樹種，別稱楂木，通常為常綠灌木林，有時為小喬木，高度為3～4 m，極少數(shù)可達(dá) 8 m。油茶樹皮呈淡黃褐色，平滑但不裂；小枝微被短柔毛；單葉互生；葉柄長4～7 mm，有毛；葉片多為厚革質(zhì)，形狀為卵狀橢圓形或卵形，長度為3.5～9.0 cm，寬度多為1.8～4.2 cm，其頂點相對較鈍，基部呈楔形，邊緣多呈細(xì)鋸齒形，上部則呈亮綠色，通常為無毛或中脈有硬毛，下面中脈基部有毛或無毛，其側(cè)脈不明顯；花為兩性花，1～3朵生于枝頂或葉腋上，直徑達(dá)到3～5 cm，無梗；通常有5張萼片，形狀接近圓形，外表面有被絹毛；花瓣數(shù)一般為5～7瓣，花色為白色，花分離，形狀為倒卵形至披針形，長度多為2.5～4.5 cm，先端常有凹缺，外表面有毛；雄蕊更多，無毛外觀，外部花絲僅有基部連合；上部子房長有密集白色絲狀絨毛，花柱先頂三淺裂；蒴果形狀為近球形，直徑通常達(dá)到3～5 cm，其果皮較厚，為木質(zhì)，室背2～3裂；種子形狀為背圓腹扁形，長度達(dá)2.5 cm；花期為10、11月，果期在次年10月。油茶的栽培歷史較為悠久，分布區(qū)域很廣，栽培面積很大，用途較多，由于其具有收斂止血、解毒之功效，因此常常被用于治療鼻衄病、皮膚潰爛瘙癢、瘡疽等癥狀。此外，油茶具有較強的清除自由基、抗腫瘤、抗炎、降血脂的作用，在食品藥品、營養(yǎng)保健、日用化工等領(lǐng)域也具有良好的應(yīng)用價值。但是，目前油茶葉資源并未得到良好、可循環(huán)的利用，特別是在油茶整形修剪、低產(chǎn)油茶林的改造等不當(dāng)應(yīng)用下，大量油茶葉常被作為廢棄物丟棄，使其功能和使用價值大大降低，極大地浪費了資源。通過大量的研究發(fā)現(xiàn)，油茶葉中也含有多種不同的黃酮類化合物，黃酮類化合物常常具有良好的抗油脂氧化性能，并有報道指出，油茶提取物可用于治療一些無名腫毒病癥、犬咬或是火燒成瘡等疾病。油茶葉茶多糖是一類成分復(fù)雜的糖類混合物。此外，油茶多糖功效很多，具有抵抗各種輻射、增加人體內(nèi)白細(xì)胞的數(shù)量、提高人體免疫力的作用，還可以降低人體血糖。通過泡飲用油茶制成的粗茶來治糖尿病的嘗試和方法較為流行，原因可能是茶多糖發(fā)揮了作用。但是茶多糖的抗氧化能力較弱，在受到胞外真菌的寄生后，有關(guān)茶耳的理化性質(zhì)及其糖類成分的研究在我國和世界范圍內(nèi)還有待拓展，因此本研究旨在分析油茶葉可食用真菌在營養(yǎng)成分及體外抗氧化性方面的作用。

1 試驗方法

本試驗的總流程見圖1。

1.1 油茶和茶耳水提物及多糖的提取

油茶葉產(chǎn)自湖南省株洲市，采集時間為2018年4月。試驗時間為2018年5—6月，試驗地點為青島農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。將油茶葉葉片和茶耳葉片粉碎后按 1 g ∶30 mL的料液比加入蒸餾水，放入恒溫水浴鍋中于65 ℃提取2 h，分別抽濾得到油茶葉濾液(CF)、茶耳濾液(TF)。取一部分濾液旋蒸濃縮后按1 ∶4的體積比加入無水乙醇醇沉，將沉淀物在 4 ℃ 條件下靜置過夜，取其沉淀物放置于離心機內(nèi)并且于4 000 r/min離心15 min，將沉淀物再次溶解于蒸餾水后，用離心機離心以除去水中那些不溶性雜質(zhì)，使用流水透析72 h，將透析后的樣品經(jīng)冷凍干燥后，便可得到油茶粗多糖(CCP)、茶耳多糖(TCP)，進(jìn)而計算粗多糖產(chǎn)率。

1.2 理化形式分析

1.2.1 總糖含量的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。首先，在干燥的100 mL容量瓶中準(zhǔn)確稱量18.80 mg無水葡萄糖，加水溶解并稀釋至刻度處，充分搖勻，然后在50 mL容量瓶中準(zhǔn)確吸取10 mL葡萄糖溶液，加蒸餾水至刻度線標(biāo)記處，充分搖動，得到 0.037 6 mg/mL 無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別精確量取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mL葡萄糖參比溶液(濃度)于干燥的試管中，每管補加蒸餾水至0.5 mL。每管再加入300 μL 6%苯酚溶液，充分搖勻后再次加入1.5 mL濃硫酸溶液(濃度)，振蕩搖勻后在沸水浴中充分反應(yīng) 15 min，再取出混合物，并置于冰浴中冷卻至室溫，通過測定推導(dǎo)出回歸方程。

樣品的測定：將多種樣品配制成5 mg/mL水溶液備用，再精確移取0.2 mL水溶液，按上述操作分別測量樣品，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總糖含量。

1.2.2 還原糖含量的分析 將各種樣品制備成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的水溶液，分別精確移取1.0 mL水溶液轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。然后精確移取2.5 mL稀釋后的供試樣品溶液至容量瓶中，準(zhǔn)確加入2.5 mL DNS試劑，充分混勻，沸水浴加熱5 min后，用冷流水冷卻，將體積調(diào)節(jié)至標(biāo)記線處(25 mL)，以去離子水作為空白對照組，測量其在540 nm處的吸光度。以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出其還原糖含量。

1.2.3 總酚含量的分析 精確量取5 mL各種供試品溶液于干燥試管中，再加入5 mL福林酚試劑，搖勻后在室溫下放置3 min。再次加入5 mL 10%碳酸鈉溶液，充分搖勻后在室溫下顯示1 h(使用相應(yīng)試劑作為空白對照)，用紫外-可見分光光度法在 700 nm 處測量吸光度。以50 μg/mL沒食子酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，并根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出其總酚含量。

1.3 單糖組分分析

由于在測定單糖組成前首先需要將多糖降解為單糖后才能測定，因此試驗前準(zhǔn)確稱取5 mg已經(jīng)分離純化的油茶葉濾液、油茶葉粗多糖、茶耳濾液、茶耳粗多糖樣品，分別置于不同安瓿瓶中，加入 1 mL 濃度為2 mol/L的三氟乙酸(TFA)溶液，使用乙醇噴燈封閉瓶口，將密封的安瓿瓶放到溫度為110 ℃的烘箱內(nèi)進(jìn)行水解反應(yīng)(反應(yīng)8 h使反應(yīng)完全)。等待水解反應(yīng)完全后，將樣品用甲醇溶液(濃度100%)溶解并轉(zhuǎn)移到不同雞心瓶內(nèi)，用甲醇溶液旋蒸多次，直至除去所有樣品中的TFA，并轉(zhuǎn)移至EP管中供以后使用，最后放置于40 ℃烘箱內(nèi)烘干。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。分別準(zhǔn)確稱取干燥的甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、葡萄糖(Glc)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcuA)、半乳糖醛酸(GalUA)、乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)和巖藻糖(Fuc)的單糖標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色譜法對各種單糖標(biāo)準(zhǔn)品和油茶葉濾液、油茶葉粗多糖、茶耳濾液、茶耳多糖水解產(chǎn)物進(jìn)行衍生化，然后進(jìn)行高效液相色譜分析。

試驗條件：色譜柱為KP-C色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH值=6.7)-乙腈(體積比=82 ∶18)；流速為 1 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；檢測器為紫外檢測器；檢測波長為254 nm。

1.4 體外抗氧化能力的測定

DPPH自由基清除率的測定。將油茶葉多糖和茶耳多糖分別配制成濃度為0、2、4、6、8、10 mg/mL的水溶液。將油茶葉多糖(HE)、茶耳多糖(IE)水提液分別配制成0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/mL水溶液，然后吸取250 μL 0.02% DPPH-甲醇(DPPH為1，1-二苯基-2-硝基苯肼)溶液加到 1 mL 樣品水溶液中。在室溫下避光放置 30 min 后，以維生素C作為陽性對照，在517 nm處測量其混合物的吸光度。DPPH自由基清除率的計算公式如下：

DPPH自由基清除率=517 nm()-517 nm()/517 nm()×100%。

式中：517 nm()為樣品的吸光度；517 nm()為空白樣品的吸光度。

羥基自由基清除率的測定。將多糖分別配制成質(zhì)量濃度為0、2、4、6、8、10 mg/mL的水溶液。將水提液HE、IE分別配制成質(zhì)量濃度為0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/mL的水溶液，吸取1 mL 9 mmol/L FeSO溶液和1 mL 9 mmoL/L水楊酸-甲醇溶液加入1 mL樣品水溶液中。混合后，向混合物中加入 1 mL 9 mmoL/L HO溶液。在37 ℃避光30 min后，以維生素C作為陽性對照，在517 nm處測量混合物的吸光度。其對羥基自由基清除率的計算公式如下：

羥基自由基清除率=517 nm()-517 nm()/517 nm()×100%。

式中：517 nm()為樣品的吸光度；517 nm()為空白樣品的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶、茶耳水提物及多糖的提取

本試驗提取的油茶、茶耳水提物的顏色均為紅棕色，醇沉后的多糖為褐色粉末，油茶葉多糖的產(chǎn)率為16.9%，茶耳多糖的產(chǎn)率為10.24%，多糖的理化性質(zhì)分析結(jié)果見表1。通過分析健康油茶葉、被(shirai)Syd真菌寄生后油茶葉茶耳中多糖相關(guān)成分的性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，被感染葉片茶耳的總糖含量高于健康葉片，還原糖含量也顯著增加。由試驗結(jié)果可以看出，真菌的寄生可以促進(jìn)一些糖類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，使被真菌寄生的葉片的含糖量比健康葉片高。通過比較總酚含量發(fā)現(xiàn)，真菌的寄生可以提高葉片中的酚類物質(zhì)含量。

表1 油茶、茶耳水提物及其各多糖成分含量 %

2.2 油茶和茶耳水提物及多糖的單糖組成分析

分析圖2至圖6可知，油茶葉多糖由甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)5種單糖組成，由其相對峰面積比可以看出，5種單糖的含量比例為 2.96 ∶5.83 ∶22.28 ∶19.71 ∶15.99。分析圖3、圖6可知，油茶葉水提液由甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)5種單糖組成，由其相對峰面積比可以看出，5種單糖的含量比例為0.85 ∶9.80 ∶71.86 ∶4.10 ∶3.63。分析圖4、圖6可知，茶耳多糖由甘露糖(Man)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)4種單糖組成，由其相對峰面積比可以看出，4種單糖的含量比例為23.81 ∶20.71 ∶22.88 ∶6.74。分析圖5、圖6可以看出，茶耳水提液由甘露糖(Man)、氨基葡萄糖(GlcN)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)5種單糖組成，由其相對峰面積比可以看出，5種單糖的含量比例為 5.54 ∶3.80 ∶63.73 ∶6.83 ∶3.25。

通過比較茶耳多糖和油茶葉粗多糖的單糖組分發(fā)現(xiàn)，茶耳多糖的甘露糖含量明顯高于油茶葉多糖，并且茶耳多糖組分中沒有油茶葉多糖的氨基葡萄糖成分。

2.3 油茶和茶耳水提物及多糖的抗氧化活性

由圖7至圖10可以看出，油茶葉、茶耳水提取物具有良好的抗氧化活性。本研究分析了油茶葉、茶耳、油茶葉水提液和茶耳水提液對DPPH自由基的清除活性，并將其與陽性對照抗壞血酸進(jìn)行了比較。由結(jié)果可知，茶葉水提液、茶耳水提液對DPPH自由基的清除效果都明顯優(yōu)于多糖。茶葉提取物、茶耳提取物清除DPPH自由基的EC分別為0.07、0.03 mg/mL(圖8)。水提取物具有良好的抗氧化活性，可能與其內(nèi)部酚類物質(zhì)含量豐富有關(guān)。茶耳粗多糖、油茶葉粗多糖清除DPPH自由基的EC分別為4.7、3.4 mg/mL (圖7)。通過圖9、圖10比較茶葉水提液和茶耳水提液對羥自由基的清除活性，并與油茶葉多糖和茶耳多糖進(jìn)行了比較。由結(jié)果可知，油茶葉多糖、茶耳多糖具有弱的羥自由基清除作用。研究結(jié)果表明，真菌的寄生會提升葉片提取物的體外抗氧化能力。

3 結(jié)論

本試驗從油茶葉和茶耳中提取水提物與活性多糖，分析其單糖組成及化學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，真菌寄生后茶葉中的總糖、還原糖和總酚含量均有增加。本研究結(jié)果表明， 真菌可以將油茶葉片中的一些營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖類、酚類物質(zhì)。將茶葉水提液和茶耳水提液、茶葉多糖和茶耳多糖的體外抗氧化能力進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，真菌寄生后可以使葉片提取物的抗氧化能力顯著增強，可以為市場上油茶葉真菌污染問題提供一些解決方法，同時可對一些真菌污染后的油茶葉進(jìn)行處理以開發(fā)一些茶飲料，減少經(jīng)濟損失。