曾 婷，雷向陽，白曉蘇

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的主要組織學(xué)特征為彌漫性肝細胞脂肪變和脂質(zhì)過量沉積于肝臟部位[1]。學(xué)術(shù)界普遍認為，NAFLD的發(fā)病與肥胖、超重和糖尿病等基礎(chǔ)疾病有關(guān)。隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，NAFLD、肥胖和糖尿病等人群增加[2]。NAFLD可逐步進展為失代償期肝硬化和肝細胞癌[3]?？寡趸瘧?yīng)激和抗脂質(zhì)沉積可能是應(yīng)對NAFLD病情發(fā)展的思路之一。姜黃素等傳統(tǒng)中藥在阻斷脂質(zhì)沉積和抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)方面表現(xiàn)優(yōu)異[4]。氧化苦參堿(oxymatrine，OMT)是從豆科槐屬植物苦參中提取出的有效生物堿，具有較好的清熱利濕、利尿解毒活性，可有效抑制乙型肝炎病毒復(fù)制，發(fā)揮顯著的抗肝纖維化和抗腫瘤效應(yīng)[5]，對肝功能具有較好的保護作用。本實驗采用高脂飲食構(gòu)建NAFLD大鼠模型，觀察了OMT干預(yù)對肝功能的保護作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 40只清潔級雄性SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量為200～220 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，保持相對溫度為24℃、相對濕度為60%，給予充足的純凈水和常規(guī)飼料。

1.2 NAFLD模型的構(gòu)建 將40只大鼠隨機分為對照組10只、模型組10只、OMT處理組10只和辛伐他汀處理組10只。給予普通飼料飼養(yǎng)對照組大鼠，給予其他3組動物高脂飲食飼料(88%普通飼料/10%豬油/2%膽固醇)喂養(yǎng)16 w，并從第9 w開始分別給予生理鹽水、OMT(蘇州醫(yī)藥有限公司，國藥準字H20100410)60 mg·kg-1、辛伐他汀(廣州南新制藥有限公司，國藥準字H20010748)60 mg·kg-1灌胃處理。在16 w末，所有大鼠禁食12 h，稱體質(zhì)量，給予10%水合氯醛麻醉后經(jīng)腹主動脈取血，取出肝組織后稱質(zhì)量。用眼科剪將肝組織剪碎成約5 mm3大小的組織塊，用無菌生理鹽水沖洗，將組織塊分為2份，其中一份以4%多聚甲醛固定，脫水透明，石蠟包埋、切片，HE染色或伊紅染色，在南京伊若達儀器設(shè)備有限公司提供的Olympus CX43顯微鏡下觀察；另一份肝組織則保存于-80℃冰箱凍存。

1.3 血清檢測 使用深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司提供的BS-280全自動生化分析儀檢測血生化指標；采用ELISA法[6]檢測血清白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、IL-10和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平(上海研生實業(yè)有限公司)。

1.4 肝組織氧化應(yīng)激指標檢測 取肝組織，加入組織裂解液進行勻漿，4℃下高速離心后取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。取20 μg總蛋白加等體積液體稀釋。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平檢測：將待測樣品加入96孔板，設(shè)置對照孔，室溫下孵育20 min，使用上海閃譜生物科技有限公司提供的SuPerMax 3000FA型多功能酶標儀檢測560 nm處的吸光度(OD)值；還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)水平檢測：將待測樣品加入96孔板、搖勻，加入工作液150 μl，25℃下孵育5 min，再加入還原型輔酶Ⅱ 50 μl，共同培養(yǎng)25 min，在酶標儀檢測412 nm處的OD值；丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平檢測：以組織裂解液作為對照，加樣品于離心管，依次加入標準品0.1 ml、待測樣品0.1 ml和工作液0.2 ml，充分搖勻，100℃下孵育15 min，冷卻后高速離心10 min，取上清液置于96孔板，在酶標儀檢測532 nm處OD值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化 對照組大鼠肝組織形態(tài)完整，細胞排列整齊，無空泡及脂質(zhì)沉積；模型組大鼠肝組織形態(tài)不規(guī)正，細胞排列無序，空泡和脂質(zhì)沉積明顯；與模型組比，OMT和辛伐他汀處理組肝組織形態(tài)較為完整，細胞排列較整齊，細胞內(nèi)空泡和脂質(zhì)沉積明顯減少，炎性病變明顯改善(圖1)。

圖1 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化(HE，200×)

2.2 各組大鼠體質(zhì)量和肝質(zhì)量比較 在實驗結(jié)束時，OMT和辛伐他汀處理組大鼠體質(zhì)量和肝質(zhì)量均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量和肝質(zhì)量比較

2.3 各組大鼠肝功能指標比較 OMT和辛伐他汀處理組大鼠血清ALT和AST水平均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠肝功能指標比較

2.4 各組大鼠血脂指標比較 OMT和辛伐他汀處理組大鼠血清TC、TG和LDL水平均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠血脂指標比較

2.5 各組血清細胞因子水平比較 OMT和辛伐他汀處理組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均顯著低于模型組，而血清IL-10水平顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表4)。

表4 各組大鼠血清細胞因子水平比較

2.6 各組大鼠肝組織氧化應(yīng)激指標比較 OMT和辛伐他汀處理組大鼠肝組織SOD和GSH水平顯著高于模型組，而MDA水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表5)。

表5 各組大鼠肝組織氧化應(yīng)激指標比較

3 討論

NAFLD是以肝細胞胞漿中脂肪過度積累為典型特征的臨床高發(fā)疾病，其發(fā)病機制較為復(fù)雜。目前普遍認為，肝脂肪病變、胰島素抵抗、炎癥刺激和氧化應(yīng)激反應(yīng)的過度激活均會導(dǎo)致NAFLD的發(fā)病[7]。傳統(tǒng)中醫(yī)則認為，痰、濕、熱、毒、疲是NAFLD發(fā)病的主要病因，應(yīng)從活血化瘀、疏肝祛濕為本病的治則[8]?？鄥⑹蔷哂星鍩釠鲅B(yǎng)肝祛濕功效的中藥，氧化苦參堿是其主要活性成分，具有較好的抗炎、抗氧化作用[9]。本實驗采用OMT干預(yù)NAFLD大鼠，觀察大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝功能和血脂水平的變化，希望為應(yīng)用OMT干預(yù)NAFLD提供實驗依據(jù)。

經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)建立大鼠NAFLD模型是當(dāng)前主流的建模方法，對于實驗用藥具有較好的指導(dǎo)作用[10]。本研究采用高脂飲食飼料喂養(yǎng)SD大鼠以構(gòu)建NAFLD大鼠模型，再以氧化苦參堿灌胃干預(yù)，結(jié)果顯示，經(jīng)OMT處理后，模型大鼠肝脂肪變性和細胞內(nèi)空泡顯著改善，肝臟內(nèi)炎性反應(yīng)明顯減輕，并有效減輕大鼠體質(zhì)量和肝質(zhì)量。脂質(zhì)沉積和肝臟脂肪變性是NAFLD大鼠的典型特征[11]。氧化苦參堿通過減輕模型大鼠體質(zhì)量，改善因肥胖導(dǎo)致的脂肪病變和脂質(zhì)過量囤積，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和炎性反應(yīng)，避免在持續(xù)炎性環(huán)境和過氧化環(huán)境中由單一脂肪變性進展為NAFLD[12]，減輕模型大鼠肝損傷程度。

本研究結(jié)果顯示，與模型大鼠相比，經(jīng)氧化苦參堿灌胃處理的OMT組大鼠血清ALT和AST水平均顯著低于模型組，血TC、TG和LDL等水平也較模型組降低，表明氧化苦參堿可有效降低NAFLD大鼠血脂水平，改善大鼠肝功能[13，14]。當(dāng)機體存在大量脂質(zhì)堆積時血清TC、TG和LDL水平顯著升高[15]。氧化苦參堿具有祛濕化痰、活血養(yǎng)肝的功效，通過促進模型大鼠肝臟內(nèi)血液循環(huán)，阻止過量脂肪堆積于肝臟部位[16]，抑制脂質(zhì)沉積，從而降低大鼠血脂水平，改善肝功能，發(fā)揮顯著的肝臟保護作用。

在本研究，與模型組相比，OMT處理組大鼠肝組織勻漿促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低，而抗炎因子IL-10水平顯著升高，表明OMT可顯著抑制NAFLD發(fā)病過程中的炎癥反應(yīng)。此外，經(jīng)OMT處理后的大鼠肝組織內(nèi)抗氧化能力指標SOD和GSH水平顯著升高，脂質(zhì)過氧化活性產(chǎn)物MDA水平顯著降低，表明氧化苦參堿可抑制模型大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究結(jié)果提示，氧化苦參堿具有肝臟保護作用，可能是通過抗炎和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)實現(xiàn)的，氧化苦參堿可抑制脂質(zhì)大量積累和脂質(zhì)過氧化過程[17]，避免過量的過氧化產(chǎn)物進入肝臟和血液引起的中性粒細胞激活，從而抑制炎癥反應(yīng)[18]，防止多余的炎性細胞因子合成、分泌和釋放導(dǎo)致的肝臟損傷[19]，不僅抑制了應(yīng)激反應(yīng)，還阻止了炎癥反應(yīng)的激活，從源頭上抑制兩種反應(yīng)互相促進、惡性循環(huán)造成的肝臟損傷[20]，有效降低肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標水平。