劉 萍，柏亞軍，蔣曉虹，夏水利，馬 俊，孫 志，袁世山，姚火春

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；2.勃林格殷格翰動(dòng)物保?。ㄖ袊┯邢薰旧虾７止?，上海 201203）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是對全球養(yǎng)豬業(yè)具有嚴(yán)重影響的重要豬傳染病。該病于80年代末先后在美國和歐洲出現(xiàn)，隨后在世界范圍內(nèi)迅速傳播，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。PRRS于1995年首次在中國出現(xiàn)并被報(bào)道。2006年，我國暴發(fā)了一場由高致病性毒株引起的以高熱、高死亡率為特征的高熱病[2]。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）是引起PRRS的病原體，它的基因組長約為15 kb的單股正鏈RNA。PRRSV基因組有11個(gè)開放閱讀框（open reading frames, ORFs）編碼至少14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和8個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白。病毒基因組從5'端到3'端，依次為5'UTR、非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)ORF1a和ORF1b、結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)ORF2-7、3'UTR及PolyA尾巴。ORF1a和ORF1b約占基因組的三分之二，通過程序性-1核糖體移碼機(jī)制翻譯出2個(gè)多聚蛋白。經(jīng)過一系列蛋白酶水解，這兩個(gè)多聚蛋白可以切割成14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural protein, NSP）。ORF1b下游的基因組區(qū)域編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白，包括ORF2a、ORF2b、ORF3～7以及ORF5a。ORF2～4分別編碼囊膜蛋白GP2、E蛋白、GP3和GP4，ORF5～7分別編碼GP5、ORF5a、M蛋白和N蛋白[3]。PRRSV蛋白往往都具有多種功能，并且病毒的免疫保護(hù)相關(guān)位點(diǎn)和毒力決定位點(diǎn)都分散在基因組各個(gè)蛋白編碼區(qū)中[4]。PRRSV特別容易發(fā)生變異，其基因組的突變率可以達(dá)到4.7～9.8×10-2/位點(diǎn)/年，比普遍的RNA病毒突變率高[5]。

減毒活疫苗免疫接種作為防控PRRS最有效的手段被得到廣泛應(yīng)用，在活疫苗的研制和生產(chǎn)過程中，保持疫苗毒株安全性和免疫原性間的平衡，避免過度致弱是獲得一款合格疫苗的先決條件[6-7]。本研究以HP-PRRSV毒株JX143經(jīng)細(xì)胞傳代的三個(gè)代次病毒（JXM105、JXM125和JXM135）為研究對象，通過3株傳代毒株對其親本毒株JX143免疫保護(hù)效力評價(jià)和全基因組序列分析，解析病毒體外傳代與毒株免疫原性間的關(guān)聯(lián)。本研究首先用4周齡仔豬的免疫接種試驗(yàn)和攻毒保護(hù)試驗(yàn)初步評價(jià)了3株傳代毒株的安全性和免疫效力，為PRRSV傳代致弱毒株的科學(xué)評價(jià)提供參考。隨后在對這3個(gè)毒株進(jìn)行全長基因組測序的基礎(chǔ)上，結(jié)合動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果，探討了JX143毒株在細(xì)胞傳代過程中獲得的基因突變與病毒免疫原性變化的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用豬購自北京某SPF豬場，所有動(dòng)物于試驗(yàn)前7 d進(jìn)場隔離觀察，并進(jìn)行PRRSV抗原、抗體及其他病原篩查，隨后由統(tǒng)計(jì)師完成隨機(jī)分組。所有試驗(yàn)豬均為PRRSV抗原、抗體陰性；主要豬病病原如豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（Porcine circoviru,PCV2）、偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）、流感病毒（Swine influenza virus, SIV）、副豬嗜血桿菌和豬肺炎支原體等抗原陰性。動(dòng)物試驗(yàn)在ABSL2級別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施內(nèi)進(jìn)行，并在公司IACUC小組審核、批準(zhǔn)和監(jiān)督下完成。

1.2 細(xì)胞和病毒 用于病毒分離的細(xì)胞為非洲綠猴腎傳代細(xì)胞MA104。細(xì)胞生長液為含10%胎牛血清（FBS，Invitrogen）的MEM（Sigma），維持液為含2%血清的MEM。攻毒毒株為JX143（GenBank登錄號(hào)：EF488048），2006年從江西發(fā)生高熱病豬場的發(fā)病豬肺臟分離的HP-PRRSV毒株[8]。3株傳代毒株JXM105、JXM125和JXM135為JX143在細(xì)胞上分別傳代105代、125代和135代的病毒，病毒體外傳代過程可參考文獻(xiàn)[10]。

1.3 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本動(dòng)物試驗(yàn)的試驗(yàn)周期為49 d，包括兩個(gè)階段：第一階段為0 d到14 d，為安全性評價(jià)試驗(yàn)；第二階段為28 d（攻毒當(dāng)天）到49 d，為保護(hù)效力評價(jià)試驗(yàn)。如表1所示，65頭4周齡±2 d的仔豬被隨機(jī)分為5組。組1、2和3為傳代毒株接種組，試驗(yàn)開始當(dāng)天分別肌肉注射接種2 mL病毒上清原液；組4為攻毒對照組；組5為陰性對照組。首先觀察14 d進(jìn)行安全性評價(jià)，組1、2、3、5中分別各有5頭豬在試驗(yàn)14 d測體重后安樂死進(jìn)行剖檢和肺臟病變打分。隨后第1～4組中所有剩余豬在試驗(yàn)28 d進(jìn)行攻毒，滴鼻接種105.0TCID50/mL的JX143。試驗(yàn)期間每天測量動(dòng)物的體溫；觀察動(dòng)物行為及精神狀態(tài)進(jìn)行臨床打分。每周采血分離血清一次用于病毒分離和PRRSV抗體檢測。試驗(yàn)期間如發(fā)生動(dòng)物死亡，需對其進(jìn)行病理剖檢，確定死亡原因并進(jìn)行肺臟病變評分，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)過程中的死亡率。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱量體重后安樂死并剖檢剩余動(dòng)物，取肺臟觀察進(jìn)行病變評分。分析攻毒后動(dòng)物的臨床表現(xiàn)、死亡率、體溫變化、日增重、肺臟病變以及病毒血癥情況，評價(jià)傳代毒株對仔豬的保護(hù)效果。試驗(yàn)成立標(biāo)準(zhǔn)：攻毒對照組動(dòng)物死亡率至少達(dá)到40%；陰性對照組動(dòng)物無由PRRSV導(dǎo)致的發(fā)病或死亡，且在整個(gè)試驗(yàn)期間PRRSV抗原和抗體陰性。PRRS發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)：體溫≥41℃至少3 d；攻毒后臨床總評分=1且連續(xù)2 d或≥2 d；肺損傷總評分＞5%。符合以上任意兩條，即可判為PRRS發(fā)病。

表1 試驗(yàn)分組Table1 Groups of animal study

1.4 臨床評分 每天觀察動(dòng)物的臨床表現(xiàn)包括行為（如斜臥、顫抖、嗜睡等）、呼吸狀態(tài)（如不同程度的咳嗽、打噴嚏、腹式呼吸等）、消化（如嘔吐、腹瀉、食欲改變等）以及其他相關(guān)臨床癥狀（如跛足、疝氣、水腫等）。記錄異常臨床癥狀，并對行為、呼吸狀態(tài)和咳嗽三個(gè)方面進(jìn)行評分（參照表2臨床癥狀評分系統(tǒng)）。若試驗(yàn)期間發(fā)生動(dòng)物死亡，則進(jìn)行動(dòng)物剖檢，記錄剖檢結(jié)果，分析可能死亡原因。

表2 臨床癥狀評分系統(tǒng)Table 2 Scoring system of clinical observation

1.5 平均日增重（average daily weight gain, ADWG）計(jì)算 試驗(yàn)前一天對每組動(dòng)物進(jìn)行稱重，攻毒當(dāng)天或者試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對每組動(dòng)物稱重，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)（49 d）或者攻毒當(dāng)天（28 d）動(dòng)物體重減去試驗(yàn)前一天的動(dòng)物體重除以總觀察天數(shù)則為該動(dòng)物在觀察期間平均日增重。對于試驗(yàn)過程中的死亡動(dòng)物，死亡后立即稱重，計(jì)算其ADWG。

1.6 肺臟大體病變觀察及損傷評價(jià) 對死亡動(dòng)物或者觀察期結(jié)束的動(dòng)物進(jìn)行剖檢，小心取出肺臟，對肺臟各葉進(jìn)行觀察，記錄各肺葉病變（主要為肺肉變）程度百分比，參照如下計(jì)算公式進(jìn)行肺損傷總評分（肺評分）[11]：肺損傷總評分=右尖葉%×（0.11）+右心葉%×（0.10）+右隔葉%×（0.34）+左尖葉%×（0.05）+ 左心葉%×（0.06）+左隔葉%×（0.29）+附葉%×（0.05）；肺評分≤5%為正常，5%＜肺評分≤20%為輕度病變，20%＜肺評分≤50%為中度病變，＞50%為重度病變。

1.7 病毒分離 通過測定血清中是否存在PRRSV活病毒，記錄試驗(yàn)過程中動(dòng)物病毒血癥的動(dòng)態(tài)變化。具體操作如下：將200 μL血清加入已長滿MA104細(xì)胞單層的24孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，隨后加入1.0 mL/孔MEM+2% FBS+100 U青鏈霉素雙抗的維持液混合物。放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察細(xì)胞病變（cytopathic effect, CPE）情況。出現(xiàn)CPE表明血清樣品為PRRSV陽性，最后統(tǒng)計(jì)出每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的血清樣品中PRRSV分離陽性率。

1.8 PRRSV抗體檢測 用HerdCheck* PRRS X3抗體檢測ELISA試劑盒檢測血清中PRRSV抗體水平。具體操作參照試劑盒說明書，S/P（樣品與陽性對照比值）≥0.4判為PRRSV抗體陽性，S/P值＜0.4判為PRRSV抗體陰性。

1.9 PRRSV全長基因組測序 對JXM105、JXM125和JXM135以及親本毒JX143-P4進(jìn)行全長測序，序列比對分析細(xì)胞傳代過程中出現(xiàn)的基因組序列變化。QIAgen Viral RNA Mini Kit提取病毒RNA，隨后將基因組分成六段經(jīng)一步法RT-PCR（SuperScript?ⅢOne-Step RT-PCR Platinum?TaqHiFi）進(jìn)行擴(kuò)增（引物見表3，擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件參照試劑盒說明書）。純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并克隆送測序。用Vector NTI軟件拼接測序結(jié)果獲得全長病毒基因組，進(jìn)行序列比對。

表3 PRRSV全長基因組測序引物Table 3 Primers for PRRSV full-length amplification

2 結(jié)果

2.1 攻毒前JXM105、JXM125和JXM135免疫動(dòng)物的各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果 0～14 d所有傳代毒株接種組的豬體溫都在正常范圍內(nèi)，和陰性對照組比無顯著差異（圖1A）。并且所有傳代毒株接種組的豬均無異常臨床表現(xiàn)，各項(xiàng)評分均為0分。如圖1B所示，免疫后14 d內(nèi)，3組傳代毒株接種動(dòng)物的體重增長正常，與陰性對照組比無顯著差異（P＞0.05）。試驗(yàn)第14 d，從3組免疫接種組和陰性對照組中各隨機(jī)挑選5頭豬只進(jìn)行剖檢，取肺臟觀察并評分。如圖1C所示，3組傳代毒株接種組均分別有1頭豬肺臟出現(xiàn)輕度病變（5%＜肺評分≤20%），這3頭動(dòng)物在整個(gè)試驗(yàn)期間并未表現(xiàn)出任何異常臨床癥狀，各免疫組的平均肺評分均＜5%。綜合上述，攻毒前體溫變化、臨床評分、平均日增重和肺臟評分結(jié)果表明，JX143在細(xì)胞上傳代105代后已經(jīng)致弱，所有傳代病毒在4周齡小豬上安全無致病性。

圖1 免疫后0～14 d各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果Fig.1 Results of different indicators during 0-14 d post vaccination

2.2 JXM105、JXM125和JXM135免疫保護(hù)效力評價(jià)結(jié)果 免疫后第28 d，3個(gè)免疫組（每組各剩余10頭動(dòng)物）和攻毒對照組各滴鼻接種2 mL 105.0TCID50/mL含量的JX143，隨后按照試驗(yàn)方案觀察動(dòng)物體溫變化、臨床評分、死亡率等，并在攻毒后第21 d，安樂死所有剩余動(dòng)物并剖檢，進(jìn)行肺臟病變評分。

2.2.1 體溫變化 攻毒前所有豬的體溫都在正常范圍內(nèi)，攻毒對照組從攻毒后第6 d出現(xiàn)高熱，平均體溫開始超過41℃，隨后兩天體溫略微下降，攻毒后第9 d又出現(xiàn)高熱并持續(xù)3 d。JXM105組攻毒后第3 d平均體溫略有升高，之后很快回落至正常水平且在正常范圍內(nèi)波動(dòng)，與陰性對照組無顯著差異。JXM125組攻毒后第3 d平均體溫開始升高，攻毒后第5 d平均體溫超過40℃，且持續(xù)至試驗(yàn)結(jié)束。該組有6頭動(dòng)物體溫出現(xiàn)超過41℃，其中3頭豬體溫高于41℃超過3 d。JXM135組與JXM125組趨勢基本一致，攻毒后第3 d開始平均體溫超過40℃，9頭動(dòng)物都出現(xiàn)體溫超過41℃，其中有2頭動(dòng)物體溫高于41℃超過3 d，陰性對照組在整個(gè)試驗(yàn)期間，平均體溫都在正常范圍（圖2）。因此，對比各組動(dòng)物攻毒后體溫變化，JXM105保護(hù)效力要好于JXM125和JXM135。

圖2 攻毒后體溫變化Fig.2 Rectal temperature curve post challenge

2.2.2 臨床評分和死亡率 攻毒后，JXM105組有兩頭豬攻毒后出現(xiàn)輕度行為異常，主要表現(xiàn)為輕度精神沉郁，其余動(dòng)物臨床表現(xiàn)無異常。未表現(xiàn)出PRRS臨床癥狀，呼吸和咳嗽評分均為0分。JXM125和JXM135組部分動(dòng)物表現(xiàn)出呼吸困難及嚴(yán)重的斜臥。攻毒對照組攻毒后所有動(dòng)物均表現(xiàn)出不同程度的PRRS典型臨床癥狀。攻毒后各組動(dòng)物存活率結(jié)果如圖3所示，攻毒對照組從攻毒后第13 d開始陸續(xù)共有4頭豬死亡，死亡率40%；而3組傳代毒株組和陰性對照組無動(dòng)物死亡（圖3）。

圖3 攻毒后各組臨床評分和存活率Fig.3 Clinical scores and survival rate of groups post challenge

2.2.3 攻毒后平均日增重結(jié)果 攻毒后，除了攻毒對照組出現(xiàn)負(fù)增長，其他免疫組均有體重增長（圖4A）。JXM105的平均日增重略高于其他兩組免疫組，但3組免疫組和空白對照組間無顯著差異。所有免疫組的ADWG均極顯著高于攻毒對照組（P≤0.01）。

2.2.4 肺損傷評價(jià) JXM105組在攻毒后平均肺臟病變評分為3.63%，其中有3頭豬的評分超過5%，表現(xiàn)輕度病變；JXM125組平均肺臟病變評分為6.88%，其中有3頭豬的評分超過5%，1頭豬的評分超過20%；JXM135組攻毒后平均肺臟病變評分為3.35%，其中有2頭豬的評分超過5%。而攻毒對照組的平均肺臟病變評分為56.28%，該組所有動(dòng)物都出現(xiàn)不同程度的肺臟病變。陰性對照組所有豬剖檢后都未發(fā)現(xiàn)肺臟病變（圖4B）。

圖4 攻毒后平均日增重和肺臟病變評分Fig.4 ADWG and lung lesion score of groups post challenge

綜合上述結(jié)果和PRRS發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)，可以得出JXM105組攻毒后無動(dòng)物發(fā)病和死亡；JXM125和JXM135組攻毒后均無動(dòng)物死亡，但是表現(xiàn)出顯著的PRRS臨床癥狀，發(fā)病率均為20%（JXM125組發(fā)病動(dòng)物編號(hào)為#911、#916；JXM135組發(fā)病動(dòng)物編號(hào)為#979、#984）。由此可見，JXM105可以對JX143攻毒提供完全保護(hù)，免疫豬攻毒后無PRRS發(fā)??；而JXM125和JXM135只能提供部分保護(hù)，攻毒后仍有部分豬發(fā)病。

2.3 病毒血癥變化 所有組在免疫當(dāng)天PRRSV抗原均為陰性，且陰性對照組整個(gè)試驗(yàn)期間病毒分離均為陰性。JXM105組免疫后第7 d所有豬血清病毒分離陽性直至第21 d，且攻毒當(dāng)天仍有90%動(dòng)物為病毒分離陽性。攻毒后該組動(dòng)物病毒分離陽性率開始下降，且在試驗(yàn)最后一天病毒血癥消失。JXM125組攻毒后第7 d 90%動(dòng)物血清病毒分離陽性，隨后陽性率緩慢下降，攻毒當(dāng)天70%動(dòng)物病毒分離為陽性。攻毒后趨勢與JXM105組類似。JXM135組免疫后第7 d所有動(dòng)物血清病毒分離陽性，隨后病毒分離陽性率下降，攻毒當(dāng)天陽性率為60%。攻毒后該組血清分離陽性率略有升高（70%），一周后下降至10%。攻毒對照組在攻毒前所有動(dòng)物為病毒分離陰性，攻毒后一周所有動(dòng)物出現(xiàn)病毒血癥，隨后病毒血癥逐漸消退，至試驗(yàn)結(jié)束仍有33.3%（2/6）動(dòng)物有病毒血癥（圖5）?？偟膩碚f，三個(gè)傳代病毒都可以在豬體有效復(fù)制，免疫后都可以降低攻毒后病毒血癥水平和持續(xù)時(shí)間。JXM105在體內(nèi)復(fù)制效率略高于另外兩個(gè)病毒。

圖5 免疫及攻毒后病毒分離陽性率變化Fig.5 Viremia dynamic post vaccination and challenge

2.4 抗體水平變化 所有動(dòng)物在免疫當(dāng)天PRRSV抗體均為陰性，且陰性對照組整個(gè)試驗(yàn)期間PRRSV抗體均為陰性。3組免疫組在免疫后第14 d開始出現(xiàn)抗體轉(zhuǎn)陽，隨后抗體水平緩慢升高，攻毒后各組抗體水平基本維持穩(wěn)定不變。3組免疫組的抗體動(dòng)態(tài)變化趨勢基本一致，各組總體抗體水平表現(xiàn)為JXM105組＞JXM125組＞JXM135組。通過觀察個(gè)體表現(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)，JXM125組和JXM135組中攻毒后表現(xiàn)出明顯PRRS發(fā)病的動(dòng)物抗體轉(zhuǎn)陽都出現(xiàn)較晚（21 d轉(zhuǎn)陽），該現(xiàn)象也提示病毒的免疫原性降低導(dǎo)致其不能在攻毒后對這些動(dòng)物提供完全保護(hù)。攻毒對照組攻毒前所有動(dòng)物均為PRRSV抗體陰性，攻毒后一周所有動(dòng)物抗體轉(zhuǎn)陽，隨后抗體水平顯著升高，在試驗(yàn)最后一天又出現(xiàn)下降（圖6）。由此可見，3個(gè)傳代毒株接種后，均可刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的抗PRRSV N蛋白抗體。與抗原檢測結(jié)果一致，JXM105在動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制效率比另兩個(gè)高代次病毒更高，免疫原性更強(qiáng)可以刺激豬體產(chǎn)生更高水平的抗體。

圖6 免疫及攻毒后抗體動(dòng)態(tài)變化Fig.6 Antibody dynamic post vaccination and challenge

2.5 病毒基因組序列與病毒蛋白序列比對分析 對JX143-P4、JXM105、JXM125和JXM135進(jìn)行全長基因組序列測定，比較病毒的全基因組中各個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸和氨基酸差異，旨在追蹤病毒在細(xì)胞傳代過程中基因組序列的變化規(guī)律，為研究PRRSV細(xì)胞傳代弱化的相關(guān)分子機(jī)制提供參考。與野毒相比，JXM105共含有47處突變，其中有23處導(dǎo)致氨基酸突變（表4），分別位于nsp1、nsp2、nsp4、nsp5、nsp7、nsp9、nsp10、ORF3、ORF4、ORF5a和ORF6，1處位于nsp2的88個(gè)連續(xù)氨基酸缺失，以及位于GP2-246位色氨酸突變?yōu)榻K止密碼子導(dǎo)致GP2截?cái)?1個(gè)氨基酸。而繼續(xù)傳代至JXM125，增加了5處核苷酸突變，其中僅1處氨基酸由絲氨酸突變?yōu)樘扉T冬酰胺位于GP3-133（S133N）。從JXM125繼續(xù)傳代至JXM135，增加了3處核苷酸突變，其中僅有1處為位于nsp7β的氨基酸突變由纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼帷?/p>

表4 JX143傳代病毒與野毒P4代病毒全長序列差異分析Table 4 Sequence analysis of JX143 passaged viruses and parental strain JX143-P4

3 討論

本文通過安全性和免疫保護(hù)試驗(yàn)證明細(xì)胞傳代病毒JXM105對仔豬無致病力，且對同源攻毒提供完全保護(hù)，但是更高代次的毒株JXM125和JXM135只能提供部分保護(hù)。表明隨著體外傳代次數(shù)增多，JXM在豬體上有過度致弱趨勢，導(dǎo)致其免疫保護(hù)效

力降低。對HP-PRRSV毒株JXA1的研究也有類似結(jié)果，JXA1傳代至80代致弱，而至110～170代時(shí)出現(xiàn)過度致弱，不能對同源攻毒提供完全保護(hù)[12]。

為了探尋JX143傳代致弱與免疫原性變化的分子機(jī)制，本研究對傳代病毒的全基因組序列進(jìn)行分析。與此前報(bào)道的JXM100（JX143傳代100次的病毒）基因組序列相比，JXM105的基因組序列存在幾處差異[13]。本研究中的JXM105為此前報(bào)道中JXM80（MARC-145細(xì)胞傳代）在MA104細(xì)胞上繼續(xù)傳代后獲得，雖然MA104和MARC-145同為非洲綠猴腎細(xì)胞，但來源于不同細(xì)胞克隆，傳代細(xì)胞的改變可能是導(dǎo)致兩個(gè)相近代次病毒全基因序列差異的主要原因。有研究表明，JXM105在nsp2中連續(xù)88個(gè)氨基酸缺失與病毒在MARC145和PAM細(xì)胞上的復(fù)制效率相關(guān)[14]。對JXwn06的最新研究也表明，nsp2高變區(qū)與病毒在PAM上的細(xì)胞嗜性相關(guān)[15]。在這88個(gè)氨基酸缺失區(qū)域中存在一處早期研究鑒定出的B細(xì)胞表位（D385ELKDQMEED394）[16]，該表位的缺失對JXM的免疫保護(hù)效力無影響，這可以為未來開發(fā)標(biāo)記疫苗提供一處靶點(diǎn)。重新傳代后JXM毒株的GP2出現(xiàn)了11個(gè)氨基酸截短，表明GP2碳端的11個(gè)氨基酸與病毒復(fù)制無關(guān)。兩株2013年從流產(chǎn)母豬分離的PRRSV毒株Henan-A10和Henan-A11也在GP2的胞內(nèi)區(qū)有10個(gè)氨基酸缺失，隨后在HuN4-F112感染性克隆的研究也證實(shí)了這10個(gè)氨基酸與病毒復(fù)制無關(guān)[17]。由此也可推測，JX143上GP2截短與PRRSV的傳代致弱無關(guān)。

與其他HP-PRRSV毒株（如JXA1和HunN4）傳代致弱的演變分析比較，JX143致弱的演變軌跡大多數(shù)都不一致，僅有幾處位于GP3的突變位點(diǎn)一致（GP3-79、224、225）。但這些毒株傳代后大部分突變均位于非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，這表明PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白在毒力變化中具有重要作用，且PRRSV傳代致弱具有毒株特異性[18-19]。JX143傳代125代后出現(xiàn)過度致弱，序列分析結(jié)果顯示JXM125與JXM105相較僅存在1處氨基酸突變位于GP3（S133N），JXM135與JXM105相較除了GP3處的氨基酸突變外，還有一處位于nsp7β的氨基酸突變V27I，推測GP3處的S133N突變與過度致弱相關(guān)性更強(qiáng)。GP3是一個(gè)重要的PRRSV糖蛋白，已有研究證明GP3與GP2a和GP4形成多聚蛋白與CD163結(jié)合協(xié)助病毒進(jìn)入細(xì)胞[20]。GP3上還存在很多重要的N-糖基化位點(diǎn)與病毒的免疫原性相關(guān)[21]。GP3第133位氨基酸在PRRSV毒株中非常保守，JXM125和JXM135基因組上該位點(diǎn)的絲氨酸突變?yōu)樘扉T冬酰胺，該突變可能可以形成一個(gè)新的N-糖基化位點(diǎn)從而引起高代次病毒的免疫保護(hù)效力下降。JXM125傳代后獲得的突變位點(diǎn)（除GP3-79）與JXA1研究中鑒定出的過度致弱相關(guān)點(diǎn)完全不一致：JXA1中有8處氨基酸突變與過度致弱相關(guān)，分別位于nsp1β、nsp2、nsp3、GP2、E、GP4、GP5和ORF5a；另有10處氨基酸突變可能與過度致弱相關(guān)，分別位于nsp2、GP3、GP4和N蛋白[12]。這也再次表明PRRSV病毒的進(jìn)化具有毒株特異性。除了上述氨基酸突變外，JXM105繼續(xù)傳代至免疫保護(hù)效力降低的JXM125后，JXM125的基因組還存在幾處同義突變。有研究表明大量的同義突變也會(huì)影響病毒的生物學(xué)特征[22]。PRRSV在復(fù)制轉(zhuǎn)錄過程中有特定二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列存在，無意義突變還可以通過影響RNA二級結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)病毒轉(zhuǎn)錄而影響病毒復(fù)[23]。但以上鑒定出的同義突變是否與過度致弱相關(guān)還有待驗(yàn)證。

JX143傳代致弱后全基因組序列和免疫原性變化的數(shù)據(jù)顯示：該毒株傳代至80代以后全基因組序列突變趨于穩(wěn)定，JXM87的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示其在仔豬上具有良好的免疫效力（未發(fā)表數(shù)據(jù)）；JXM87與JXM105之間存在8處位于非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)的核苷酸突變（其中4處導(dǎo)致氨基酸突變，未發(fā)表數(shù)據(jù)），但二者均表現(xiàn)出良好的免疫效力；JXM105與JXM125之間也僅存在5處核苷酸突變（1處導(dǎo)致氨基酸突變），但二者的免疫效力卻存在顯著差異。這表明隨著病毒體外傳代，病毒適應(yīng)細(xì)胞生長的突變會(huì)逐漸累積增加，如果這些突變數(shù)量控制在一定范圍內(nèi)，則對病毒在宿主上的免疫原性無顯著影響；當(dāng)這些突變增加到一定程度時(shí)則會(huì)影響病毒在宿主上的免疫原性。

綜上所述，JX143傳代105次后的病毒對仔豬無致病力，繼續(xù)傳代至P125則出現(xiàn)免疫原性降低導(dǎo)致過度致弱。通過對在仔豬上有不同免疫保護(hù)效力毒株JXM105、JXM125、JXM135的序列比對鑒定出一些與病毒致弱和過度致弱相關(guān)的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的生物學(xué)功能還需要通過反向遺傳學(xué)手段進(jìn)一步驗(yàn)證和解讀。關(guān)于不同PRRSV毒株的體外傳代致弱的研究可以為闡明PRRSV致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。