程龍飛，劉榮昌，陳紅梅，萬春和，傅光華，施少華，傅秋玲，黃 瑜

（福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心 福建省禽病防治重點實驗室，福州 350013）

鴨疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer, RA）是革蘭氏陰性的小桿菌，主要侵害70日齡以下的各品種鴨和鵝，引起的病變主要表現(xiàn)為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎等，俗稱傳染性漿膜炎[1]。該病呈世界性分布，嚴重影響水禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。藥物在該病的預防和治療方面發(fā)揮了重要作用，但隨著鴨疫里默氏菌耐藥菌株的不斷增多、多重耐藥菌株的出現(xiàn)[2]、耐藥機制的不斷變遷等，藥物的應用受到了很大的限制。傳染性漿膜炎滅活疫苗已商品化，當疫苗株的血清型與流行菌株的血清型相同時，滅活疫苗可以提供有效的保護，而鴨疫里默氏菌有超過21種的血清型，一旦流行菌株的血清型改變，則免疫效果大打折扣。因此有必要研發(fā)傳染性漿膜炎的新型防治方法。

噬菌體是細菌的病毒，可以作為生物控制劑，殺滅懸浮或生物膜中的細菌[3]。噬菌體在殺死其宿主菌的同時，不損傷宿主細胞、不影響宿主體內(nèi)的大多數(shù)其他細菌，因為這一優(yōu)點，噬菌體治療法正在被越來越多的人關(guān)注和接受[4]。本研究以鴨疫里默氏菌RAf63為指示菌，從健康鴨糞中分離鑒定了鴨疫里默氏菌敏感的噬菌體RAP15，經(jīng)形態(tài)學觀察，結(jié)合分子特征，認為其應歸屬于I群尾病毒目長尾病毒科成員[5]；測定了噬菌體RAP44的生物學特性，結(jié)果表明，該噬菌體潛伏期短，裂解量大，可以作為生物防治鴨疫里默氏菌病的候選噬菌體株[6]；以皮下注射的方法將鴨疫里默氏菌人工感染櫻桃谷鴨，同時皮下注射噬菌體，觀察5 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5株噬菌體處理組均可使鴨的死亡數(shù)量減少，說明噬菌體對鴨疫里默氏菌病有一定的治療效果[7]。據(jù)報道，噬菌體和抗生素具有協(xié)同作用[8]，受此啟發(fā)，本研究從體內(nèi)和體外兩個方面探討氨芐青霉素與噬菌體的協(xié)同作用，為抗生素與噬菌體聯(lián)合應用用于防治傳染性漿膜炎奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及試驗動物 胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar, TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth, TSB）購自Dfico公司；96孔細胞培養(yǎng)板購自Thermo公司；100 mg/mL氨芐青霉素購自全式金公司；氨芐西林鈉可溶性粉購自成都市坤宏動物藥業(yè)有限公司；10日齡番鴨購自莆田溫氏家禽有限公司。

1.2 菌毒株及培養(yǎng)方法 血清1型鴨疫里默氏菌RAf63，鴨疫里默氏菌噬菌體RAP8、RAP15、RAP33、RAP38、RAP49、RAP50、RAP57、RAP62（均是以鴨疫里默氏菌RAf63為指示菌，從健康鴨糞中分離并純化），由福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所禽病研究室保存。菌株凍干粉劃線培養(yǎng)于TSA平板，37℃燭罐中培養(yǎng)20 h，挑單菌落接種于TSB，37℃振蕩培養(yǎng)16 h。噬菌體采用雙層平板法培養(yǎng)，挑噬斑純化、計數(shù)[5]。每株噬菌體的效價均調(diào)整至1×1010PFU/mL。

1.3 AMP對RAf63最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration, MIC）的測定 采用微量稀釋法。用TSB將AMP稀釋至4096 μg/mL，在96孔細胞培養(yǎng)板上，以TSB將AMP作倍比稀釋，共11孔，每孔終體積100 μL，第12孔為單純的TSB為對照，每孔加10倍稀釋的RAf63菌液100 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，測定每孔的OD490值。做3個重復，取平均值判定MIC值。

1.4 AMP與RAP15合用對RAf63的生長抑制試驗 參考文獻[9]的方法適當改進，96孔細胞培養(yǎng)板上，第1孔加100 μL TSB稀釋的AMP 128 μg/mL，后面每孔加100 μL TSB稀釋的AMP 64 μg/mL，第1孔加RAP15 100 μL，混勻后倍比稀釋至11孔，第12孔為不加噬菌體的對照，每孔加10倍稀釋的RAf63菌液100 μL，即AMP終濃度均為32 μg/mL，噬菌體濃度不同。同樣的方法，設(shè)置AMP終濃度分別為16、8 μg/mL和0 μg/mL的試驗組和對照組。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，測定每孔的OD490值。每個試驗組做3個重復，取平均值進行分析。

1.5 AMP對RAP15噬菌斑形成的影響試驗 參考文獻[9]的方法適當改進，鋪雙層平板，下層為TSA，上層為含RAf63和RAP15（約100個PFU）的0.7%瓊脂[5]，使整個平板中AMP的終濃度分別為32、16、8、0 μg/mL，每組做3個重復，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。觀察噬菌斑的形態(tài)及大小，計算每組噬菌斑的平均數(shù)。

1.6 AMP對RAP15增殖的影響試驗 參考文獻[9]的方法適當改進，取RAP15（8×108PFU）和RAf63（3.2×1010CFU），加入TSB中，總體積為80 mL，平均分為4份，設(shè)定為4個試驗組，加入AMP使其終濃度分別為32、16、8、0 μg/mL，37℃振蕩培養(yǎng)10 h。每組加氯仿1 mL，上下振蕩，靜置5 min，取上層液體進行噬菌體計數(shù)。

1.7 AMP對噬菌體噬菌譜的影響試驗 鋪雙層平板，下層為TSA，上層為含RAf63的0.7%瓊脂[5]，使整個平板中AMP的終濃度分別為32、16、8、0 μg/mL，待瓊脂凝固后，將噬菌體分別滴加在不同平板上（50 μL/板），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，觀察加樣點是否出現(xiàn)噬菌斑，出現(xiàn)噬菌斑判斷為具有裂解能力，否則判斷為不能裂解。

1.8 AMP與RAP15對RAf63人工感染番鴨的治療試驗 60只10日齡番鴨，隔離飼養(yǎng)2 d后進行動物試驗。每只左腿皮下注射0.5 mL RAf63菌液（細菌的含量為1×108CFU/mL），然后隨機分為5組。試驗1組、2組和3組，立即右腿皮下注射0.5 mL噬菌體RAP15（噬菌體的含量為2×109PFU/ mL），試驗2組在每天的飲水中加入氨芐西林鈉可溶性粉300 mg/L，試驗3組和4組在每天的飲水中加入氨芐西林鈉可溶性粉600 mg/L（廠家推薦用量），對照組不注射噬菌體也不添加藥物。隔離飼養(yǎng)，觀察7 d，統(tǒng)計鴨的死亡數(shù)并計算死亡率。

2 結(jié)果

2.1 AMP對RAf63的MIC 培養(yǎng)基中含有不同濃度AMP時，由細菌的生長情況可知，AMP濃度較高時，OD值始終處于較低的水平，當AMP濃度為32 μg/mL及以下時，OD值迅速上升。OD值越高，說明細菌的生長越好，將能夠完全抑制細菌生長的AMP最低濃度即64 μg/mL判定為對RAf63的MIC（圖1）。根據(jù)中國食品藥品檢定研究院制定的《抗菌藥物藥敏試驗判斷標準》判定，RAf63對AMP耐藥。

圖1 含不同濃度AMP培養(yǎng)液的（OD490值）Fig.1 OD490 value of culture medium containing AMP of different concentrations

2.2 AMP與RAP15合用對RAf63生長的影響 不同濃度AMP與不同效價的噬菌體RAP15合用，對RAf63生長的影響詳見圖2。從中可以看出，當AMP濃度為8 μg/mL及以下時，噬菌體RAP15稀釋至2-8，培養(yǎng)液的OD值即開始快速上升，即不能抑制RAf63的生長；當AMP濃度為16 μg/mL和32μg/mL時，RAP15稀釋至2-10，培養(yǎng)液的OD值才開始快速上升。說明當培養(yǎng)液中含有16 μg/mL或32 μg/mL的AMP時，更少的RAP15就可以抑制RAf63的生長，也就是說，AMP和RAP15聯(lián)合，可以將RAP15對RAf63生長的抑制作用提高4倍。

圖2 含不同濃度AMP和噬菌體培養(yǎng)液的OD490值Fig.2 OD490 value of culture medium containing AMP and phage of different concentrations

2.3 AMP對RAP15噬菌斑形成的影響 不同濃度AMP時，雙層平板觀察到的RAP15噬菌斑的形態(tài)、大小、數(shù)量均沒有明顯差別。

2.4 AMP對RAP15增殖的影響 培養(yǎng)液中含有不同濃度AMP，培養(yǎng)后各試驗組子代噬菌體計數(shù)。結(jié)果可知，培養(yǎng)液中AMP濃度達到16 μg/mL和32 μg/mL時，子代噬菌體的數(shù)量明顯增加，增加的幅度分別為12.2%和22.0%，AMP濃度為8 μg/mL時，對子代噬菌體的數(shù)量幾乎沒有影響（表1）。

表1 添加不同濃度AMP培養(yǎng)后子代噬菌體的計數(shù)結(jié)果Table 1 Count results of progeny phage under different concentration AMP

2.5 AMP對噬菌體裂解能力的影響 由AMP不同濃度時，各噬菌體對細菌RAf63的裂解性可知，AMP不能影響RAP15、RAP33、RAP49和RAP57對RAf63的裂解特性，當AMP濃度為16 μg/mL及以上時，RAP8、RAP38和RAP62即表現(xiàn)對RAf63裂解能力，當AMP濃度為32 μg/mL時，RAP50表現(xiàn)出對RAf63裂解能力（表2）。說明亞MIC濃度的AMP提高了部分噬菌體的裂解能力，拓寬了這些噬菌體的噬菌譜。

表2 不同濃度AMP時各噬菌體對RAf63的裂解能力Table 2 Lysis abilities to RAf63 of phage strains under different concentration AMP

2.6 AMP和噬菌體聯(lián)合應用對鴨疫里默氏菌攻菌的治療效果 攻擊鴨疫里默氏菌RAf63后，采取不同治療措施的各試驗組，死亡數(shù)量不同。兩個聯(lián)合治療組的死亡率，比單一噬菌體治療組或單一AMP治療組都低。推薦劑量的AMP與噬菌體聯(lián)合應用比一半劑量AMP與噬菌體的聯(lián)合應用效果更好一點（表3）。說明噬菌體和AMP或半劑量的AMP合用，均能提升對人工感染鴨疫里默氏菌的治療作用。

表3 人工感染RAf63后各試驗組的治療效果Table 3 Therapeutic effect of each experimental group after artificial infection of RAf63

3 討論

用噬菌體治療細菌感染早在20世紀初就已取得過可喜的成果，由于大多數(shù)噬菌體的噬菌譜過于狹窄，使得其應用受到了很大的局限，后來隨著抗生素的迅速發(fā)展，噬菌體的研究工作幾乎處于停滯狀態(tài)?？股乜梢砸种苹驓绮≡岣邉游锏纳a(chǎn)性能，但其副作用也越來越顯現(xiàn)，其應用也受到了越來越多的限制?？上驳氖?，抗生素的亞最小抑菌濃度已被證明能提高噬菌體的活性，被稱為“噬菌體-抗生素協(xié)同作用”[10-11]。其可能的機理有兩個方面，一方面是因為抗生素作用后，細菌形態(tài)發(fā)生了改變，如內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類藥物可以使伯克霍爾德菌拉伸呈絲狀，暴露出更多的噬菌體結(jié)合受體，有利于更多噬菌體的吸附，從而導致噬菌體產(chǎn)量的增加并加速細胞的裂解；四環(huán)素則使細菌成簇聚集，增加了噬菌體橫向穿過相鄰細菌并感染的機會，從而加速其裂解作用[12]。另一方面，噬菌體可以破壞細菌生物膜[13]，使得抗生素更好地發(fā)揮作用?？股嘏c噬菌體的合用，不僅能提高治療效果，還能減少抗生素的使用，具有很好的應用前景。

并不是所有的噬菌體和所有的抗生素都具有協(xié)同作用，不同的噬菌體只與部分抗生素具有協(xié)同作用，β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、多粘菌素類和四環(huán)素類抗生素被研究較多，其中，β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類抗生素與噬菌體的協(xié)同作用經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)[14]。氨芐青霉素已被證實，能與糞腸球菌噬菌體[15]和大腸桿菌噬菌體[11]產(chǎn)生協(xié)同作用。氨芐青霉素耐酸，內(nèi)服或肌肉注射均易吸收，既可抗革蘭氏陽性菌，又可抗革蘭氏陰性菌。氨芐青霉素在動物養(yǎng)殖中廣泛應用，但目前尚未見報道其是否與鴨疫里默氏桿菌噬菌體也具有協(xié)同作用。本研究針對這一未知領(lǐng)域開展試驗，首先在體外培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，亞MIC濃度的氨芐青霉素能使噬菌體RAP15對RAf63生長的抑制作用提高4倍，能使子代噬菌體的數(shù)量明顯增加，說明在體外條件下，氨芐青霉素與RAP15具有協(xié)同作用。美中不足的是，本研究沒有觀察到亞MIC濃度的氨芐青霉素對噬菌斑大小和數(shù)量的影響，推測可能與RAP15形成的噬菌斑太小（直徑小于1 mm）、不易計量有關(guān)，也可能與噬菌體本身的特點有關(guān)。另外，亞MIC濃度的氨芐青霉素可以使部分原先不能裂解RAf63的噬菌體獲得裂解RAf63的能力，說明低于常規(guī)劑量的抗菌素和噬菌體的合用，可以拓寬噬菌體的噬菌譜，這一點很有意義，為噬菌體臨床應用范圍的拓寬提供了理論基礎(chǔ)。其次，本研究進行了體內(nèi)試驗，將鴨疫里默氏菌RAf63人工感染番鴨，然后進行治療試驗。注射噬菌體RAP15的試驗組，死亡率比對照組降低，注射噬菌體結(jié)合飼喂氨芐青霉素的試驗組，死亡率更低，說明噬菌體RAP15和氨芐青霉素具有協(xié)同作用。本研究還對氨芐青霉素的用量進行了初步的探討，發(fā)現(xiàn)氨芐青霉素減半后與噬菌體合用，比單一噬菌體治療組的效果好，但比常規(guī)劑量組略差。綜上所述，本研究從體內(nèi)和體外兩個方面均證明，氨芐青霉素和噬菌體具有協(xié)同作用，為今后傳染性漿膜炎的預防和治療提供了可能的新方案，在保證預防和治療效果的情況下，也可能減少抗菌藥物的使用，減少藥物殘留和環(huán)境壓力，具有潛在的重要意義。