卜一 張碩 錢旭東 王紅梅 竇志杰
(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北 承德 067000)
糖尿病(DM)導(dǎo)致的代謝紊亂可引起大血管、毛細(xì)血管病變,是腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一;和非DM腦梗死比較,DM腦梗死患者腦組織血管狹窄病變程度更嚴(yán)重,病變支數(shù)更多;DM本身影響側(cè)支循環(huán)的建立,DM患者血糖水平升高是由單核細(xì)胞參與的大血管或毛細(xì)血管的形成能力及重塑能力降低〔1〕。利拉魯肽(LIRA)為胰高血糖素樣肽受體激動(dòng)劑,在DM治療中被廣泛應(yīng)用,可通過葡萄糖依賴性方式促進(jìn)胰島素分泌〔2〕;在正常血糖腦梗死小鼠中有通過促進(jìn)血管新生而促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)的作用〔3〕。胰島素樣生長因子(IGF)結(jié)合蛋白(IGFBP)-3在DM和心血管疾病中的作用越來越受到重視〔4〕,在新生血管形成中也發(fā)揮重要作用〔5〕。應(yīng)芝英等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)IGFBP-3在急性腦梗死患者血清中表達(dá)下降,分析IGFBP-3可能參與急性腦梗死的發(fā)病過程。本文以尼莫地平為陽性對照,對LIRA對DM腦梗死大鼠腦組織IGFBP-3及血管形成的影響進(jìn)行研究,探討LIRA對DM腦梗死的可能作用機(jī)制。
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 清潔級、健康、體重220~260 g、雌雄各半、SD大鼠購自北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所,許可證號:SYXK(京)2015-0005。2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒(美國Bioworld公司),蘇木素、水合氯醛、Trizol(上海碧云天生物技術(shù)公司),兔抗鼠IGFBP-3多克隆抗體、兔抗鼠CD34多克隆抗體、兔抗鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。
1.2分組與建模 將144只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為對照組(C組)、生理鹽水組(S組)、利拉魯肽組(LIRA組)、尼莫地平組(N組),每組36只。S組、N組和LIRA組建立DM腦梗死大鼠模型:將大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素50 mg/kg,然后給予高脂肪食物喂養(yǎng),共14 d,測量大鼠隨機(jī)血糖,連續(xù)7 d空腹血糖(FPG)>16.6 mmol/L為DM模型建立成功;水合氯醛麻醉DM模型大鼠,頸正中偏右側(cè)取豎直切口,暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈,采用經(jīng)典的Longa經(jīng)頸總動(dòng)脈插入尼龍線栓致大腦中動(dòng)脈閉塞法〔7〕建立急性腦梗死模型:在頸總動(dòng)脈分叉處做一小切口,插入尼龍線栓至大腦中動(dòng)脈起始段,插入深度為18~20 mm,2 h后麻醉大鼠,拔退線栓。C組正常飼料飲食;術(shù)中插線深度10 mm,其他步驟同生理鹽水組。
1.3神經(jīng)行為學(xué)評分 術(shù)后24 h,采用Bederson等〔8〕評分方法對各組進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。無神經(jīng)缺損癥狀為0分,對側(cè)前肢不能伸展為1分,行走向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分,行走向?qū)?cè)傾倒為3分,意識受抑制不能行走為4分,死亡為5分。S組、LIRA組和N組神經(jīng)行為學(xué)評分1~3分為建模成功,評分0分、4分及5分者予以剔除,取大鼠按照上述方法建模予以補(bǔ)充。
1.4處理 神經(jīng)行為學(xué)評分結(jié)束后,N組給予二甲雙胍〔27 mg/(kg·d),2次/d〕及尼莫地平〔2.16 mg/(kg·d),2次/d〕灌胃;LIRA組給予二甲雙胍〔27 mg/(kg·d),2次/d〕及LIRA〔0.4 mg/(kg·d),1次/d〕皮下注射〔9〕;C組和S組皮下注射等量生理鹽水。共14 d。治療后再次進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分,方法同上。
1.5取材 治療結(jié)束后,每組取12只大鼠過量麻醉處理,斷頭取腦用于TTC染色;每組取12只大鼠深度麻醉后,經(jīng)心臟灌注生理鹽水,然后灌注多聚甲醛,至大鼠四肢微顫、全身僵硬,取出大腦組織,于多聚甲醛中固定,石蠟包埋、切片呈厚4 μm切片用于免疫組化染色;每組取12只剩余大鼠,深度麻醉后冰上斷頭取腦組織,液氮中保存,用于RT-PCR。
1.6TTC染色 將腦組織冰凍30 min,切成2 mm厚切片,在TTC中孵育15 min(每5 min翻動(dòng)1次),紅色染色為正常腦組織,白色染色為腦梗死組織,TTC染色后放入多聚甲醛中,過夜浸泡,腦梗死面積采用Image J軟件測定,計(jì)算腦梗死體積(腦梗死體積比=患側(cè)腦梗死體積/患側(cè)腦半球體積×100%)。
1.7免疫組化染色測定腦組織缺血皮層區(qū)IGFBP-3、VEGF表達(dá)及CD34+微血管密度 將切片于烤箱中烤2 h,經(jīng)脫蠟、脫水,加入枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù),加入過氧化氫孵育10 min,山羊血清封閉30 min,加入IGFBP-3、VEGF、CD34一抗(稀釋比例:1∶200、1∶200、1∶50)過夜孵育,加入生物素標(biāo)記二抗孵育30 min,C組以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗,加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素染色5 min,加入鹽酸酒精分化2 s,碳酸鋰返藍(lán)30 s,二甲苯透明,中性樹膠封片。圖像采用Image-Pro Plus軟件處理。
1.8Western印跡測定腦組織缺血皮層區(qū)IGFBP-3、VEGF蛋白水平 取缺血皮層區(qū)腦組織,提取總蛋白質(zhì),經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入一抗:兔抗鼠IGFBP-3單克隆抗體和兔抗鼠VEGF單克隆抗體,一抗稀釋比例1∶300,過夜孵育,加入二抗(1∶5 000)孵育2 h,以β-actin為內(nèi)參,蛋白條帶灰度值用Image J圖像分析軟件分析。IGFBP-3、VEGF蛋白水平=IGFBP-3、VEGF蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。
1.9RT-PCR測定腦組織缺血皮層區(qū)IGFBP-3、VEGF mRNA水平 取缺血皮層區(qū)腦組織,勻漿,提取腦組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以GAPDH為內(nèi)參,反應(yīng)條件為:預(yù)反應(yīng):95℃ 30 s;PCR:95℃ 10 s、60℃ 30 s,共42個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt表示IGFBP-3、VEGF mRNA水平。引物序列IGFBP-3上游引物:5′-AGAGCACAGATACCCAGAAC T-3′,下游:5′-GGTGATTCATGTTGTCTTCCAT T-3′;VEGF上游引物:5′-CGGATCAAACCTCACCAA-3′下游:5′-TCTCCGCTCTGAACGAGG-3′;GAPDH上游引物:5′-CTCTAAGGCTGTGGGCAAGGTCAT-3′下游:5′-GAGA-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。
1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。
2.1各組隨機(jī)血糖和神經(jīng)評分比較 C組無神經(jīng)功能缺損,隨機(jī)血糖正常;與C組比較,S組隨機(jī)血糖和神經(jīng)功能評分增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與S組比較,LIRA組和N組隨機(jī)血糖和神經(jīng)功能評分下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),LIRA組和N組隨機(jī)血糖和神經(jīng)功能評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。
表1 各組隨機(jī)血糖和神經(jīng)功能評分比較
2.2各組腦組織TTC染色比較 C組腦組織無白色梗死灶出現(xiàn),S組腦組織有白色梗死灶出現(xiàn),腦梗死體積〔(34.25±4.12)%〕;與S組比較,LIRA組〔(12.35±2.57)%〕和N組〔(11.28±2.74)%〕大鼠腦梗死體積均明顯減少(t=15.623、16.082,P=0.000),LIRA組和N組腦梗死體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。
圖1 各組腦組織TTC染色
2.3各組缺血皮層區(qū)IGFBP-3和VEGF免疫組化染色 C組缺血皮層區(qū)有少量IGFBP-3和VEGF表達(dá),S組缺血皮層區(qū)IGFBP-3和VEGF表達(dá)增強(qiáng),LIRA組和N組缺血皮層區(qū)IGFBP-3和VEGF表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。見圖2和圖3。各組IGFBP-3和VEGF IOD值比較:C組
圖2 各組腦組織IGFBP-3(免疫組化染色,×400)
圖3 各組缺血皮層區(qū)VEGF(免疫組化染色,×400)
表2 各組缺血皮層區(qū)IGFBP-3和VEGF IOD值、微血管密度及腦組織IGFBP-3、VEGF蛋白和mRNA水平比較
2.4各組缺血皮層區(qū)微血管密度比較 各組缺血皮層區(qū)微血管密度比較:C組
圖4 免疫組化測定各組缺血皮層區(qū)中CD34+微血管密度(×200)
2.5各組腦組織IGFBP-3、VEGF蛋白及mRNA水平比較 各組腦組織IGFBP-3、VEGF蛋白及mRNA水平比較:C組
圖5 Western印跡測定各組腦組織IGFBP-3、VEGF蛋白水平
LIRA為胰高血糖素樣肽受體激動(dòng)劑,有降糖作用,可通過抑制胰高血糖素分泌、促進(jìn)胰島素分泌而發(fā)揮降糖作用,在DM治療中被廣泛應(yīng)用〔10〕;LIRA還可通過血腦屏障,胰高血糖素樣肽受體在下丘腦、小腦、海馬組織及神經(jīng)細(xì)胞中均有表達(dá),LIRA可通過激活腦組織中胰高血糖素樣肽受體減輕炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)等,從而對腦組織發(fā)揮保護(hù)作用〔11〕。尼莫地平可有效抑制鈣離子內(nèi)流、抑制血管平滑肌收縮、解除血管痙攣,從而改善腦供血,保護(hù)神經(jīng)元,在腦梗死治療中療效顯著。本研究結(jié)果表明LIRA對DM腦梗死有保護(hù)作用。
LIRA不僅有降血糖和神經(jīng)保護(hù)作用,在血管新生中也發(fā)揮重要作用,如Chen等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)LIRA可促進(jìn)小鼠局灶性腦缺血后的血管生成。腦梗死后引起微循環(huán)缺血,腦缺血還可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和功能失調(diào),造成血管壁病變〔13〕。DM患者的高血糖可引起血管新生能力下降,腦梗死后腦缺血局部血氧供應(yīng)減少也顯著降低血管新生能力〔14〕。因此改善DM腦梗死的血管新生能力有重要意義〔15〕。CD34主要在毛細(xì)血管網(wǎng)中表達(dá),在大血管內(nèi)皮中不表達(dá)CD34,本研究結(jié)果表明LIRA可能通過促進(jìn)腦組織新生血管生成發(fā)揮腦梗死保護(hù)作用。分析LIRA可能通過促進(jìn)DM腦梗死大鼠腦組織血管生成能力減輕腦梗死體積、改善神經(jīng)功能損傷程度。
IGF信號系統(tǒng)在血管生成方面發(fā)揮重要作用,IGFBPs為IGF信號系統(tǒng)的組成部分,與IGF的親和力比較強(qiáng),在IGF系統(tǒng)的生物活性調(diào)控中有重要作用。IGFBP3和血管形成關(guān)系比較密切,在不同疾病中對血管形成的作用不同,在胰腺癌等惡性腫瘤中有抑制血管生成的作用〔16〕;但在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中有促進(jìn)血管生成的作用〔17〕。VEGF具有促進(jìn)血管生成作用〔18,19〕。IGFBP-3和VEGF共同參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程〔20〕,下調(diào)VEGF可抑制IGFBP-3的表達(dá)〔21〕。尼莫地平有促進(jìn)VEGF表達(dá),改善高血壓腦出血患者神經(jīng)功能的作用〔22〕。本研究結(jié)果表明LIRA可能通過促進(jìn)IGFBP3表達(dá)促進(jìn)DM腦梗死大鼠腦組織新生血管生成。
綜上,LIRA對DM腦梗死大鼠有腦保護(hù)作用,其療效與尼莫地平相當(dāng),但LIRA在促進(jìn)腦組織IGFBP3表達(dá)和血管新生能力方面優(yōu)于尼莫地平,LIRA可能通過促進(jìn)腦組織IGFBP3表達(dá)和血管新生能力發(fā)揮對DM腦梗死大鼠的腦保護(hù)作用。