李燕萍 蘇菁 劉延彬 林彥濤
(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1耳鼻咽喉頭頸外科,河北 張家口 075000;2呼吸內(nèi)科)
氣道黏液分泌過多是慢性氣道炎性疾病如慢性阻塞性肺疾病(COPD)和哮喘的標(biāo)志,其特征是黏液滯留在氣道,杯狀細(xì)胞增生及黏蛋白質(zhì)量或數(shù)量異常〔1,2〕。氣道黏液分泌過多與疾病的發(fā)病率和預(yù)后密切相關(guān)。PM2.5對人體健康的危害更大,因為直徑越小,進入呼吸道的部位越深。PM2.5可深入到細(xì)支氣管和肺泡,進入人體到肺泡后,直接影響肺的通氣功能,使機體容易處在缺氧狀態(tài)〔3〕。PM2.5污染會導(dǎo)致慢性氣道炎癥,氧化應(yīng)激和黏液過度產(chǎn)生,從而導(dǎo)致小氣道在臨床上受到嚴(yán)重機械阻塞,進而導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的氣道氣流減少和肺功能逐步下降〔4〕。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)6對于誘導(dǎo)黏液中氣道上皮細(xì)胞黏蛋白(MUC)5AC是必要和充分的。STAT6家族蛋白是轉(zhuǎn)錄因子,在細(xì)胞生長和存活中起關(guān)鍵作用,通過磷酸化作用對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)或通過細(xì)胞內(nèi)非受體酪氨酸激酶而被激活〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)STAT6和核因子(NF)-κB表達降低與Derp2 DNA疫苗免疫小鼠的黏液分泌減少有關(guān)〔6〕。黃芩素是一種富含水果和蔬菜的類黃酮,因其有益健康而備受關(guān)注。這些健康影響歸因于多種機制,包括抗氧化劑和抗炎活性,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的修飾及與受體和其他蛋白質(zhì)的相互作用〔7〕。在肺上皮A549細(xì)胞系中,黃芩素以劑量依賴性方式抑制阻塞性肺疾病大鼠氣道TLR4、NF-κB和蛋白表達。本研究擬探討黃芩素對PM2.5致大鼠氣道炎性反應(yīng)及黏液高分泌狀態(tài)的影響。
1.1主要藥物、試劑及儀器 黃芩素(原料藥,純度≥97%,杭州甫洛生物科技有限公司,批號MB7006);地塞米松片(廣東華南藥業(yè)集團有限公司,規(guī)格0.75mg/片,批號20190617);白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-6、MUC5AC、MUC5B酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國R&D Systems公司,批號分別為MN58748、MN63528、MN89745、MN20154、MN00237);Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司,批號分別為FG58748、FS63598);實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒SYBR Premix Ex Taq(寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司,批號DRR041A);裂解緩沖液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所,批號分別為10058-F4、FFP36、S0057);蛋白提取試劑盒(上海吉熒生物技術(shù)有限公司,批號N-63524);STAT6單克隆抗體、NF-κB單克隆抗體、β-肌動蛋白(actin)單克隆抗體(美國Neomarkers公司,批號YJ695875、KU25987M、KS0169);辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗(北京博勝經(jīng)緯科技有限公司,批號SF-1335L);電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(廣州吉賽生物科技有限公司,批號500-163S);超聲霧化器(賽默飛世爾科技中國有限公司,型號ED-96);全自動血球分析儀(日本西斯美康公司,型號XI-2000);全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司,型號Multiskan GO);光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司,型號CX21BIM-SET6);qRT-PCR儀(美國ABI公司,型號Veriti96);凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司,型號ChemiDoc MP)。
1.2實驗動物及分組 SPF級SD大鼠由昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供,雌雄各半,10~12周齡,體重210~260 g,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(云)2019-0005,動物使用許可證號:SYXK(云)2019-0015,動物質(zhì)量合格證號:N0401952。根據(jù)隨機數(shù)表法將大鼠分成對照組、模型組、地塞米松組(0.09 mg/kg)〔8〕、黃芩素低劑量組(100 mg/kg)〔9〕、黃芩素高劑量組(200 mg/kg),每組16只。本研究經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。
1.3PM2.5顆粒物懸液制備 在建筑工地附近,用智能采樣器中的石英纖維濾膜(規(guī)格:30 cm×20 cm)采集空氣中的PM2.5顆粒物,時間為30 d,24 h/d,采集結(jié)束后,將膜對折后侵入超純水,以超聲波低溫振蕩濾紙30 min,紗布過濾洗脫液,5 000 r/min離心5次,15 min/次,用生理鹽水配成80 μg/ml顆粒物懸液,保存于4℃冰箱備用〔10〕。
1.4動物建模及給藥 用超聲霧化器將10 ml PM2.5顆粒物懸液(80 μg/ml)霧化給予模型組,地塞米松組。黃芩素低、高劑量組大鼠吸入毒染(1次/d,1 h/次),染毒時間為4 w,制成慢性氣道炎性反應(yīng)動物模型〔10〕。模型建立成功后,地塞米松組給予0.09 mg/kg地塞米松水溶液灌胃,黃芩素低、高劑量組分別給予100、200 mg/kg黃芩素水溶液灌胃,1次/d,灌胃體積均為10 ml/kg,連續(xù)給藥28 d;對照組及模型組給予相應(yīng)體積(10 ml/kg)生理鹽水。
1.5支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞總數(shù)、主支氣管杯狀細(xì)胞陽性百分?jǐn)?shù)、細(xì)支氣管杯狀細(xì)胞陽性百分?jǐn)?shù)測定 生理鹽水沖洗左肺2次,回收率為80%,并使用全自動血球分析儀測定BALF中白細(xì)胞總數(shù);阿爾辛藍-過碘酸雪夫(AB-PAS)染色觀察支氣管杯狀細(xì)胞和柱狀上皮細(xì)胞,每張AB-PAS染色切片計數(shù)1支主支氣管和5支細(xì)支氣管陽性杯狀細(xì)胞數(shù)和柱狀上皮細(xì)胞總數(shù),計算主支氣管杯狀細(xì)胞陽性百分?jǐn)?shù)、細(xì)支氣管杯狀細(xì)胞陽性百分?jǐn)?shù)。
1.6BALF液中IL-2、IL-6、MUC5AC、MUC5B水平測定 剩余的BALF樣品以15 000 r/min離心10 min,然后除去上清液,并保存在-80℃冰箱內(nèi);全波長酶標(biāo)儀及IL-2、IL-6、MUC5AC、MUC5B ELISA試劑盒測定BALF液中IL-2、IL-6、MUC5AC、MUC5B水平。
1.7氣管組織病理觀察 頸椎脫臼處死大鼠,剝離氣管組織,常規(guī)脫水、脫蠟,行蘇木素-伊紅(HE)染色,制作切片,顯微鏡觀察氣管組織病理變化。
1.8各組氣管組織STAT6、NF-κB mRNA表達水平測定 使用Trizol試劑從氣管組織中分離總RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒從每個樣品的5 μg總RNA中合成第一鏈cDNA。以下引物用于STAT6、NF-κB序列的PCR擴增:STAT6正向:5′-CTTGCGTTCAAGATGTGCCTCAACTTGACTACG-3′;STAT6反向:5′-AAGCAGGTTTGTGCATGGTGGAGTAAGTGATGT-3′。NF-κB正向:5′-TGATGCTGATCAGATGTGCCTCATGACGTAG-3′;NF-κB反向:5′-TGACTGATGAGTGCATGGTCGTAGCTAGCCT-3′。β-actin正向:5′-TGGAGAAAATCTGGCACCAC-3′;反向:5′-GAGGCGTACAGGGATAGCAC-3′。引物由寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司合成。PCR程序如下:94℃預(yù)熱2 min、94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 40 s,總共35個PCR循環(huán)。反應(yīng)體系(20 μl)包括:cDNA模板2 μl、正向和反向引物各1 μl、SYBR Premix Ex Taq 10 μl、ddH2O 6 μl。β-actin為內(nèi)參基因,使用2-ΔΔCt法計算STAT6、NF-κB mRNA相對表達水平。
1.9各組氣管組織STAT6、NF-κB蛋白表達水平測定 使用RIPA緩沖液裂解氣管組織,蛋白提取試劑盒提取總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。將總蛋白(10 μg)通過十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離4 h,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將PVDF膜在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h,并在4℃下與1∶1 000稀釋的STAT6、NF-κB、β-actin一抗孵育過夜,然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗(1∶5 000稀釋)孵育2 h,采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶,并分析STAT6、NF-κB蛋白相對表達水平;β-actin作為內(nèi)參蛋白。
1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。
2.1各組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、主支氣管杯狀細(xì)胞陽性百分?jǐn)?shù)、細(xì)支氣管杯狀細(xì)胞陽性百分?jǐn)?shù)比較 與對照組比較,模型組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、主支氣管杯狀細(xì)胞陽性百分?jǐn)?shù)、細(xì)支氣管杯狀細(xì)胞陽性百分?jǐn)?shù)明顯升高(P<0.05);與模型組比較,地塞米松組。黃芩素低、高劑量組明顯降低,且黃芩素高劑量組明顯低于黃芩素低劑量組(P<0.05);與地塞米松組比較,黃芩素低劑量組明顯升高(P<0.05),黃芩素高劑量組無明顯變化(P>0.05)。見表1。
表1 各組白細(xì)胞總數(shù)、主支氣管杯狀細(xì)胞陽性、細(xì)支氣管杯狀細(xì)胞陽性及BALF中IL-2、IL-6、MUC5AC、MUC5B水平的比較
2.2各組BALF中IL-2、IL-6、MUC5AC、MUC5B水平比較 與對照組比較,模型組BALF中IL-2、IL-6、MUC5AC、MUC5B水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,地塞米松組,黃芩素低、高劑量組明顯降低(P<0.05),且黃芩素高劑量組明顯低于黃芩素低劑量組(P<0.05);與地塞米松組比較,黃芩素低劑量組明顯升高(P<0.05),黃芩素高劑量組無明顯變化(P>0.05)。見表1。
2.3各組氣管組織HE染色比較 對照組氣管組織結(jié)構(gòu)正常;模型組氣道狹窄,氣管充血水腫,鱗狀細(xì)胞增生,炎癥細(xì)胞浸潤明顯,纖毛排列紊亂;地塞米松組、黃芩素高劑量組氣管結(jié)構(gòu)基本正常,氣道上皮細(xì)胞輕微增生,有少量炎癥細(xì)胞浸潤;黃芩素低劑量組管腔狹窄,纖毛排列紊亂。見圖1。
圖1 各組氣管組織(HE染色,×400)
2.4各組氣管組織STAT6、NF-κB mRNA及蛋白表達比較 與對照組比較,模型組氣管組織STAT6、NF-κB mRNA、蛋白表達水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,地塞米松組、黃芩素低、高劑量組明顯降低,且黃芩素高劑量組明顯低于黃芩素低劑量組(P<0.05);與地塞米松組比較,黃芩素低劑量組明顯升高(P<0.05),黃芩素高劑量組無明顯變化(P>0.05)。見表2,圖2。
表2 各組氣管組織STAT6、NF-κB mRNA、蛋白表達比較
1~5:對照組、模型組、地塞米松組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組圖2 Western印跡檢測各組氣管組織STAT6、NF-κB蛋白表達
PM2.5是氣道炎性反應(yīng)及黏液高分泌狀態(tài)發(fā)病機制中的主要病因,會增加氧化應(yīng)激(氧化劑/抗氧化劑失衡)和炎癥〔11〕。國外研究描述了一種大鼠模型系統(tǒng),其長期暴露于PM2.5可以導(dǎo)致慢性氣道疾病的發(fā)生,氧化應(yīng)激加劇,其證據(jù)是一氧化氮(NO)水平升高和谷胱甘肽(GSH)降低;彌漫性肺部炎癥;杯狀細(xì)胞化生及氣道中嗜中性粒細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和未成熟巨噬細(xì)胞的數(shù)量增加。黏膜纖毛系統(tǒng)由分泌黏液的杯狀細(xì)胞和纖毛細(xì)胞組成,并產(chǎn)生一層連續(xù)翻轉(zhuǎn)的保護性黏液層,襯在氣道上皮上〔12〕。杯狀細(xì)胞的分化和黏液的產(chǎn)生受到廣泛控制,黏液分泌過多可能是哮喘惡化的關(guān)鍵原因,且可以通過多種細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑引發(fā)。MUC5AC和MUC5B是進化上保守的基因,編碼與結(jié)構(gòu)相關(guān)的黏蛋白糖蛋白,是氣道黏液中的主要大分子〔13〕。MUC5AC的過量生產(chǎn)也是哮喘的另一個疾病特征〔14,15〕。MUC5AC是氣道高反應(yīng)性(AHR)所需的過敏性炎癥主要效應(yīng)器,抑制MUC5AC可能是治療哮喘的有效方法〔16〕。本研究PM2.5致大鼠氣道炎性反應(yīng)及黏液高分泌狀態(tài)模型建立成功。
黃芩素可能通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)途徑起作用,從而有效抑制IL-1β誘導(dǎo)的人氣道上皮NCI-H292細(xì)胞中MUC5AC基因表達〔17〕。在最近的一項研究〔18〕中,黃芩素處理后,暴露于彈性蛋白酶-脂多糖(LPS)的小鼠與未經(jīng)預(yù)處理的暴露小鼠相比,氧化應(yīng)激、肺部炎癥、杯狀細(xì)胞化生及促炎細(xì)胞因子和MUC5AC的mRNA表達降低。此外,發(fā)現(xiàn)黃芩素治療可防止暴露于彈性蛋白酶/LPS的小鼠發(fā)生氣腫,這種預(yù)防與減少氧化應(yīng)激、肺部炎癥和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性有關(guān)〔18〕。本研究結(jié)果與上述討論一致,同時說明,黃芩素對PM2.5致大鼠氣道炎性反應(yīng)及黏液高分泌狀態(tài)有明顯抑制作用。
STAT6/NF-κB信號傳導(dǎo)在多種細(xì)胞功能中起重要作用,如細(xì)胞遷移和增殖,平滑肌細(xì)胞收縮和基因表達。NF-κB是STAT6的效應(yīng)分子,并參與STAT轉(zhuǎn)錄活性。STAT6是G蛋白耦聯(lián)受體激活非受體酪氨酸激酶(JAK)/STAT信號傳導(dǎo)所必需的。最近研究表明,STAT6信號級聯(lián)導(dǎo)致細(xì)胞毒素壞死因子(CNF)和CNF3中毒誘導(dǎo)的STAT3激活〔19〕。報道還表明,Rho激酶抑制作用減弱了由慢性炎癥引起的氣道反應(yīng)性、炎癥、基質(zhì)重塑和氧化應(yīng)激活化。STAT6激酶抑制劑通過抑制肌球蛋白輕鏈磷酸化和肌動蛋白解聚來調(diào)節(jié)平滑肌松弛〔20〕。STAT6激酶在哮喘的過敏模型中已顯示出增加的STAT6/NF-κB活性。STAT6/NF-κB信號通路對于增加平滑肌的鈣離子(Ca2+)敏感性很重要。NF-κB抑制劑可作為COPD的治療藥物〔21〕。NF-κB調(diào)節(jié)AHR,NF-κB在變應(yīng)原誘導(dǎo)的杯狀細(xì)胞增生中起作用。NF-κB對于調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞炎癥和杯狀細(xì)胞增生很重要。STAT6信號通過血小板P2Y受體控制過敏性小鼠中的白細(xì)胞募集〔22〕。Fasudil是一種選擇性的STAT6激酶抑制劑,可降低用fasudil治療的大鼠心臟組織中NF-κB和STAT6水平〔23〕。Fasudil抑制了過表達銅鋅超氧化物歧化酶1的轉(zhuǎn)基因小鼠中NF-κB活性的升高。本研究結(jié)果說明黃芩素能抑制大鼠氣管組織STAT6、NF-κB mRNA和蛋白的表達,進而抑制STAT6/NF-κB信號通路激活,從而起到抗炎及抗黏液高分泌的作用。
綜上,黃芩素對PM2.5致大鼠氣道炎性反應(yīng)及黏液高分泌狀態(tài)有明顯抑制作用;其機制與黃芩素能抑制大鼠氣管組織STAT6、NF-κB mRNA和蛋白表達,進而抑制STAT6/NF-κB信號通路激活有關(guān)。