李鑫 王文川 殷建敏 張清格 李保義 馮子峰 岳亞光
(邢臺市人民醫(yī)院 1中西醫(yī)結(jié)合肝病科 ,河北 邢臺 054001;2超聲科;3邢臺市愛爾眩暈耳鳴耳聾研究所;4邢臺市人民醫(yī)院消化內(nèi)科)
非酒精性脂肪肝(NAFLD)是不存在顯著酒精消耗的前提下慢性肝病的一個主要原因,從良性脂肪蓄積、不同程度的肝臟炎癥(肝炎)、進行性纖維化,并最終發(fā)展為肝硬化和終末期肝病甚至肝癌〔1〕,并且常常與胰島素抵抗、向心性肥胖、2型糖尿病和血脂異常密切相關(guān)〔2,3〕。由于這些并發(fā)癥的流行,NAFLD被公認是世界范圍內(nèi)的主要健康問題,并且是西方國家肝臟疾病的主要原因,其患病率高達33%〔4〕。與此同時,在東部國家,NAFLD患病率也在增加,這間接反映了這些地區(qū)肥胖癥和與肥胖相關(guān)疾病的發(fā)生率在不斷上升〔5〕。迄今為止,飲食調(diào)整和增加體育鍛煉的結(jié)合仍然是NAFLD管理的主要方式〔6〕。然而不幸的是,從長期來看,許多患者尤其是老年患者難以改變生活方式。所以探索新的治療老年NAFLD的方法及充分理解現(xiàn)存NAFLD藥物對老年患者的病理機制是當(dāng)下科研界亟待解決的難題。
水飛薊素(silymarin)是從水飛薊植物的干燥種子和果實中提取的化合物,主要成分為黃酮木聚糖,類黃酮(紫杉醇,槲皮素)和多酚〔7〕,可以清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化,是一種天然抗氧化劑〔8〕。silymarin通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng)和隨之而來的細胞毒性,可以保護完整的肝細胞或尚未受到不可逆損傷的細胞,因此被認為具有肝保護作用〔9〕。研究顯示,在大鼠NAFLD形成的過程中伴隨肝細胞增生〔10〕,而細胞無限增生是最終導(dǎo)致癌癥的罪魁禍?zhǔn)?。silymarin早在癌細胞中就表現(xiàn)出抗增殖活性的作用〔11〕,然而尚無研究報道其在NAFLD模型中具有抗增殖活性的作用。因此本研究旨在探究silymarin對老年NAFLD大鼠肝細胞增殖的抑制作用。Janus激酶(JAK)和信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STATs)信號通路對于細胞增殖、凋亡,胚胎發(fā)育,肝臟再生,糖酵解和炎癥反應(yīng),上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及血管生成異常重要〔12〕。STAT3是一種轉(zhuǎn)錄因子,在細胞的生存、增殖和遷移中起著重要作用,因此被認為是抗細胞增殖相關(guān)的治療靶點〔13〕。盡管JAK/STAT信號通路在細胞增殖中發(fā)揮了重要作用,但尚無研究指出silymarin是否通過JAK/STAT信號通路影響NAFLD肝細胞的增殖。本研究擬通過建立老年大鼠NAFLD模型,探討 silymarin對NAFLD大鼠肝細胞增殖的影響及是否引起JAK/STAT信號通路的改變,進一步揭示silymarin治療NAFLD疾病的機制。
1.1大鼠NAFLD模型的制備 45只清潔級老年雄性SD大鼠(7~8個月,680~720 g)。將大鼠隨機分為3組(n=15):對照(control)組、模型(NAFLD)組、silymarin組,分別喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料、高脂飼料(含基礎(chǔ)飼料77%、豬油20%、膽固醇1%、膽鹽2%);從第8周開始,silymarin組在給予高脂飼料的基礎(chǔ)上腹腔注射給藥silymarin 30 mg/kg,1次/d,連續(xù)給藥12 w。試驗結(jié)束時,頸總動脈放血處死大鼠,取血清和肝臟組織,備用。
1.2組織學(xué)分析 取合適大小的肝組織在甲醛溶液中固定48 h,包埋在石蠟中,制成4 μm厚度的石蠟切片。用蘇木素-伊紅(HE)進行染色,光學(xué)顯微鏡觀察肝臟組織病理改變。
1.3血清生化指標(biāo)水平測定 試驗結(jié)束后,大鼠禁食12 h,頸總動脈取血,4 000 r/min離心15 min取上清,通過相應(yīng)的檢測試劑盒按照按說明書操作對大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、三酰甘油(TG)和總膽固醇(TC)水平進行檢測。
1.4肝細胞提取 取肝臟組織,切下適當(dāng)大小的肝組織塊,剪去包膜,用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,剪碎,PBS清洗。加入消化液于4℃冰箱消化組織,次日,加入含有胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化。使用篩網(wǎng)過濾細胞,1 000 r/min 離心5 min,沉淀收集于RPMI1640 培養(yǎng)液(含15%胎牛血清、100 U/L青霉素鈉鹽及100 mg/L硫酸鏈霉素)中培養(yǎng)。
1.5細胞增殖的測定 制備細胞懸液。檢測細胞增殖活力,操作步驟按照CCK-8試劑盒說明書進行。細胞按70%~80%濃度鋪于96孔板,待細胞完全貼壁后,每孔加入CCK8 試劑10 μl,置于細胞培養(yǎng)箱孵育3 h,分別于24、48、72 h 時間點用酶標(biāo)儀檢測其OD450值。
1.6細胞克隆形成實驗 將適量細胞接種在6孔板,在CO2孵箱中孵育2 w,培養(yǎng)至合適濃度之后,用PBS洗滌2次,用0.5%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下計數(shù)形成的細胞菌落數(shù),克隆形成效率=(菌落數(shù)/接種的細胞數(shù))×100%。
1.7qRT-PCR檢測相關(guān)基因mRNA水平變化
1.7.1細胞總RNA的提取 各組大鼠肝細胞于細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)至80%密度后,收集細胞,加入Trizol試劑(Invitrogen)提取細胞總RNA,用NanoDrop ND-2000進行定量,檢測總RNA的質(zhì)量和濃度。
1.7.2逆轉(zhuǎn)錄 向1.5 ml EP管中加入500 ng/μg模板RNA,加入逆轉(zhuǎn)錄酶利用隨機引物合成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為:25℃ 10 min,50℃ 45 min,85℃ 5 min。
1.7.3qRT-PCR qRT-PCR體系共20 μl含cDNA模板1 μl,SYBR-green 10 μl,Primer mix 8 μl,DEPC 水1 μl,利用SYBR Green PCR試劑盒,加入細胞周期蛋白(Cyclin)D1特異性引物定量其mRNA的表達水平,引物序列如下:上游引物:GAPDH:上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′;CyclinD1:上游引物:5′-GCGTACCCTGACACCAATCTC-3′,下游:5′-CTCCTCTTCGCACTTCTGCTC-3′。通過7500-Fast實時PCR系統(tǒng)上機檢測。反應(yīng)條件為:95℃ 5 min,然后在95℃ 10 s和60℃ 30 s進行40個循環(huán)。利用ΔΔCt法進行結(jié)果分析。
1.8Western印跡分析相關(guān)蛋白水平 使用放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液裂解細胞,充分震蕩并刮取細胞,超聲破碎細胞,12 000 r /min、4℃離心10 min后收集上清液,二喹啉甲酸(BCA)法測量蛋白濃度。取30 μg蛋白溶液,加入適量上樣緩沖液,沸水煮沸5 min,進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電泳結(jié)束后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)入聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%的脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗抗體4℃孵育過夜。次日,TBST洗滌之后,使用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的特異性二抗常溫孵育1 h,加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑避光顯影。
1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0和GraphPad Prism7.0軟件進行方差分析、t檢驗。
2.1肝臟組織病理學(xué)檢測結(jié)果 control組肝臟組織正常,肝細胞規(guī)則排列,而NAFLD組肝臟組織出現(xiàn)典型的脂肪變性,肝細胞膨脹,大量脂肪空泡形成,伴有輕度至中度炎癥浸潤。Silymarin組肝臟病變程度較NAFLD組有明顯好轉(zhuǎn)。見圖1。
圖1 各組肝臟組織(HE染色,×40)
2.2各組血清生化指標(biāo)水平比較 NAFLD組血清ALT、AST、TG、TC水平明顯高于control組(P<0.05);與NAFLD組相比,silymarin組上述指標(biāo)明顯降低(P<0.05)。見表1。
表1 各組血清生化指標(biāo)水平比較
2.3肝細胞增殖檢測結(jié)果 與control組相比,NAFLD組48 h后肝細胞增殖活性明顯升高;與NAFLD組相比,silymarin組48 h后肝細胞增殖活性明顯降低(P<0.05)。見表2。與control組相比,NAFLD組肝細胞集落數(shù)目、CyclinD1 mRNA和蛋白水平均顯著增加(P<0.05);與NAFLD組相比,silymarin組細胞集落數(shù)目、CyclinD1 mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)。見表3、圖2、圖3。
表2 各組肝細胞活力檢測結(jié)果
表3 各組細胞集落數(shù)目及CyclinD1 mRNA蛋白表達
圖2 各組細胞克隆形成實驗
圖3 Western印跡檢測各組CyclinD1蛋白
2.4肝細胞JAK/STAT通路水平變化 NAFLD組與control組肝臟組織JAK2、STAT3蛋白表達無明顯變化(P>0.05);NAFLD組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達均明顯高于control組(P<0.05),silymarin能明顯抑制p-JAK2、p-STAT3蛋白水平的升高(P<0.05)。見圖4、表4。
圖4 各組肝細胞JAK2、STAT3蛋白及磷酸化表達
表4 各組肝細胞JAK2、STAT3蛋白及磷酸化表達變化
NAFLD是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)〔14〕,并且正在迅速成為全世界最常見的肝病〔15〕。老年人因為存在肥胖、代謝速率慢、活動少、血脂水平升高等特點,成為NAFLD的高發(fā)人群。中國老年人口每年以3.3%的速度增長〔16〕。
silymarin作為幾乎無毒無害的天然藥物,具有較強的肝臟保護作用,通常被用作治療代謝性肝損傷、肝纖維化等疾病〔17〕。NAFLD有發(fā)展為肝硬化、肝癌的風(fēng)險,NAFLD患者存在肝細胞的增生,而細胞過度增生是導(dǎo)致癌癥的主要原因。JAK2/STAT3信號通路對于細胞增殖發(fā)揮至關(guān)重要的作用〔18,19〕,阻斷JAK2和STAT3磷酸化可減輕肝細胞脂肪變性〔20〕。本研究結(jié)果說明silymarin可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活抑制老年NAFLD大鼠肝細胞的過度增殖,從而達到對NAFLD患者的肝臟保護作用。
綜上,silymarin能夠抑制NAFLD大鼠肝細胞的增殖,從而緩解肝臟損傷。其機制可能是通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活。