田洪濤 姚永新 隋媛 王其亮

(青島市中醫(yī)醫(yī)院(青島市海慈醫(yī)院) 1神經(jīng)外科，山東 青島 266033； 2健康管理科；3藥劑科)

腦缺血/再灌注是長時間大腦嚴(yán)重缺血或缺氧引起的腦梗死，出現(xiàn)腦水腫和腦細(xì)胞壞死，損傷器官。在臨床上具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重危害中老年患者健康，需要及時采取措施進(jìn)行治療〔1，2〕。瑞舒伐他汀(RS)屬于選擇性還原酶抑制劑，臨床上具有降血脂、抗動脈粥樣硬化，治療腦梗死的作用〔3〕。丹參川芎嗪注射液(DS)為復(fù)方制劑，其組分為鹽酸川芎嗪，對腦阻塞、腦血栓等腦血管疾病具有較好的效果〔4〕。研究表明，RS類藥物聯(lián)合丹參川芎嗪可以治療腦缺血、心血管疾病，還可以降低血壓等。UCP2-SIRT3信號通路是調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激和線粒體動力的一種途徑，已經(jīng)腦缺血/再灌注疾病中發(fā)揮功能〔5〕。本實(shí)驗(yàn)基于UCP2-SIRT3通路探討RS聯(lián)合DS對腦缺血/再灌注損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物 RS購自美國Sigma公司，批號：Y0001719。DS購自貴州拜特制藥有限公司，批號：20210209，規(guī)格：每支5 ml。將DS稀釋成原濃度的15%，配制成100 μmol/L〔1〕。

1.1.2細(xì)胞和試劑 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y系(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；改良培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(FBS，美國Gibco公司)；噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)免疫生物科技有限公司)；JC-1染色液(七海復(fù)泰生物科技公司)；放射免疫沉淀測定(RIPA)緩沖液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)；UCP2單抗、SIRT3單抗、TOMM20單抗、羊抗兔IgG二抗(武漢博士的生物科技有限公司)；Trizol試劑(日本Takara公司)。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建氧糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)模型 SH-SY5Y細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基中(不含F(xiàn)BS和抗生素)，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱條件下，進(jìn)行氧糖剝奪8 h，之后更換為含10% FBS和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，OGD/R模型建立成功。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組 常規(guī)培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞作為Control組。構(gòu)建OGD/R模型的細(xì)胞作為OGD/R組。采用低濃度(2.5 μmol/L)、高濃度(40 μmol/L)的RS處理OGD/R細(xì)胞，再分別添加DS，作為OGD/R+RS-L+DS、OGD/R+RS-H+DS組。將si-NC、si-UCP2轉(zhuǎn)染至OGD/R細(xì)胞中，再用高濃度的RS和DS處理，作為OGD/R+si-NC組、OGD/R+si-NC+RS-L+DS組、OGD/R+si-NC+RS-H+DS組，OGD/R+si-UCP2組、OGD/R+si-UCP2+RS-L+DS組、OGD/R+si-UCP2+RS-H+DS組。

1.2.3MTT檢測細(xì)胞增殖 將細(xì)胞接種于96孔板，每孔添加10 μl MTT溶液，37℃條件下培養(yǎng)4 h，離心后去除上清液，向每孔中添加100 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液。分光光度計(jì)檢測各孔450 nm的吸光度。將吸光度換算成細(xì)胞存活率。

1.2.4ELISA檢測細(xì)胞中IL-6、IL-8、IL-10水平

根據(jù)ELISA試劑盒的說明書檢測細(xì)胞中IL-6、IL-8、IL-10水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照操作流程進(jìn)行。

1.2.5共聚焦法觀察UCP2、SIRT3和TOMM20分子表達(dá)和定位 用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定各組細(xì)胞15 min，觀察細(xì)胞形態(tài)。在細(xì)胞中滴加正常山羊血清，室溫封閉1 h。吸棄血清，加入稀釋的一抗(1：1 000)，4℃孵育過夜；加入稀釋的二抗(1∶2 000)，室溫避光孵育2 h。用4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色8 min，滴加50%甘油，共聚焦熒光拍照。

1.2.6建立UCP2沉默細(xì)胞系 SH-SY5Y細(xì)胞在含10% FBS和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將si-UCP2-673、si-UCP2-853、si-UCP2-1235和陰性對照si-NC分別轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞中，檢測基因和蛋白表達(dá)水平，篩選沉默效果最好的UCP2用于后續(xù)研究。

1.2.7Western印跡檢測細(xì)胞中UCP2蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，應(yīng)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉2 h，室溫孵育一抗稀釋液(UCP2稀釋比1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗滌，孵育二抗稀釋液(稀釋比1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，滴加ECL顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.2.8qRT-PCR檢測細(xì)胞中UCP2 mRNA和PGC1、Drp1、Opa1 mRNA表達(dá) 采用Trizol法提各組細(xì)胞中總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件：25℃ 10 min，37℃ 60 min，95℃ 5 min，4℃保存。反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 2 μl，10×RT緩沖液2 μl，dNTP 0.4 μl，Multiscripe RT 1 μl，10×Random Primer 2 μl，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 1 μl，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環(huán)40次。UCP2：上游引物5′-TAGACGTGGTCAAGACGAGATA-3′，下游5′-AGGGCATGAA CCCTTTGTAG-3′。PGC1：上游引物5′-CCAAACCAACAACTTTATCTCTTCC-3′，下游5′-CACACTTAAGGTGCGTTCAATAGTC-3′；Drp1：上游引物 5′-CACCCGGAGACCTCTCATTC-3′，下游5′-CCCCATTCTTCTGCTTCCAC-3′；Opa1：上游引物5′-GTGCTGCCCGCCTAGAAA-3′，下游5′-TGACAGGCACCCGTACTCAGT-3′； GADPH：上游引物5′-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC-3′，下游5′-CTTGCTCAGTGTCCTTGCTG-3′。以GADPH為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，方差分析。

2 結(jié) 果

2.1RS聯(lián)合DS對腦OGD/R細(xì)胞增殖的影響 與Control組〔(100.00±10.92)%〕相比，OGD/R組細(xì)胞存活率顯著降低〔(41.40±4.33)%，P<0.05〕；與OGD/R組相比，OGD/R+RS-L+DS組、OGD/R+RS-H+DS組細(xì)胞存活率顯著升高〔(78.94±9.11)%、(86.49±7.37)%，P<0.05〕。

2.2RS聯(lián)合DS對腦OGD/R細(xì)胞炎性因子水平的影響 與Control組相比，OGD/R組細(xì)胞IL-6、IL-8、IL-10水平顯著升高(P<0.05)；與OGD/R組相比，OGD/R+RS-L+DS組、OGD/R+RS-H+DS組細(xì)胞IL-6、IL-8、IL-10水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 RS聯(lián)合DS對腦OGD/R細(xì)胞炎性因子水平的影響

2.3建立UCP2沉默細(xì)胞系 與NC組相比，si-NC組UCP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平及濃度無顯著變化(P>0.05)，si-UCP2-673組、si-UCP2-1235組UCP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平及濃度顯著降低(P<0.05)；與NC組、si-NC組比較，si-UCP2-853組UCP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平及濃度極顯著降低(P<0.05)。所以，采取UCP2-853進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表2，圖1。

表2 建立UCP2 沉默細(xì)胞系

1～5：NC組、si-NC組、si-UCP2-673組、si-UCP2-853組、si-UCP2-1235組圖1 各組UCP2蛋白表達(dá)

2.4RS聯(lián)合DS對腦OGD/R細(xì)胞UCP2、SIRT3和TOMM20分子表達(dá)和定位的影響 與Control組相比，OGD/R組細(xì)胞UCP2、SIRT3免疫熒光明顯減弱(P<0.05)；與OGD/R組相比，RS聯(lián)合DS顯著增強(qiáng)細(xì)胞UCP2、SIRT3免疫熒光(P<0.05)。見表3。抑制UCP2表達(dá)前后，各組SIRT3表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。抑制UCP2表達(dá)前，與OGD/R-si-NC組比較，RS聯(lián)合DS顯著升高TOMM20表達(dá)水平(P<0.05)；抑制UCP2后，各組TOMM20表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見表3。

2.5RS聯(lián)合DS對腦OGD/R細(xì)胞PGC1、Drp1、Opa1 mRNA表達(dá)的影響 與Control組相比，OGD/R組PGC1 mRNA表達(dá)水平顯著升高，Drp1、Opa1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與OGD/R組相比，OGD/R+RS-L+DS組、OGD/R+RS-H+DS組PGC1 mRNA表達(dá)水平顯著降低，Drp1、Opa1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與OGD/R組或OGD/R+si-NC組相比，OGD/R+si-UCP2組PGC1 mRNA表達(dá)水平顯著升高，Drp1、Opa1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與OGD/R+RS-L+DS組或OGD/R+si-NC+RS-L+DS組相比，OGD/R+si-UCP2+RS-L+DS組PGC1 mRNA表達(dá)水平顯著升高，Drp1、Opa1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與OGD/R+RS-H+DS組或OGD/R+si-NC+RS-H+DS組相比，OGD/R+si-UCP2+RS-H+DS組PGC1 mRNA表達(dá)水平顯著升高，Drp1、Opa1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 RS聯(lián)合DS對腦OGD/R細(xì)胞UCP2、SIRT3和TOMM20分子表達(dá)熒光強(qiáng)度、PGC1、Drp1、Opa1 mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

腦缺血/再灌注是大腦在長時間缺血缺氧情況下造成的組織不可逆損傷，減弱了增強(qiáng)線粒體功能，降低線粒體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和能量代謝，抑制腦細(xì)胞存活〔7，8〕。RS治療動脈粥樣硬化性腦血管病的臨床效果較好，安全性較高〔9〕。RS可以降低腦梗死患者血脂、炎癥因子水平，臨床價(jià)值顯著，沒有不良反應(yīng)〔10〕。DS是由丹參提取液和鹽酸川芎嗪組成的，DS下調(diào)了急性腦梗死患者血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平，改善了腦環(huán)境〔11〕。DS能有效減輕腦神經(jīng)功能損傷，改善血液流變，治療腦血栓〔12〕。有類似的研究報(bào)道，丹紅注射液聯(lián)合RS治療不穩(wěn)定型心絞痛〔13〕。復(fù)方丹參滴丸聯(lián)合瑞舒伐他汀治療冠心病合并的高脂血癥〔14〕。已經(jīng)有文獻(xiàn)結(jié)果，RS通過UCP2-SIRT3信號調(diào)控降低腦腦缺血/再灌注對神經(jīng)元的損傷，減低OGD/R細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率，阻止OGD/R細(xì)胞膜電位下降〔15〕。RS通過調(diào)控UCP2-SIRT3通路減輕腦缺血/再灌注對神經(jīng)元線粒體的損傷，增加OGD/R細(xì)胞中UCP2、SIRT3分子表達(dá)〔16〕。綜上，RS聯(lián)合DS通過調(diào)控UCP2-SIRT3通路減輕腦缺血/再灌注造成的損傷，為治療該疾病提供理論基礎(chǔ)。