帥天姣 王彤彤 謝 偉 帥 印 樸天華 莊天微

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)屬于糖尿病常見微血管并發(fā)癥。糖尿病患者由于糖代謝障礙，體內(nèi)長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)損害血-視網(wǎng)膜屏障，引起視網(wǎng)膜微血管異常增生，影響視網(wǎng)膜功能，導(dǎo)致患者視力減退甚至失明，嚴(yán)重危害患者的身心健康[1-2]。近年來，糖尿病患病人數(shù)急劇增加，DR的發(fā)病人數(shù)亦隨之增加，帶來的種種不便受到人們的重視[3]。DR的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚無確切結(jié)論，但過度的炎癥反應(yīng)是DR的重要發(fā)病機(jī)制[4]。白細(xì)胞介素(IL)-33/基質(zhì)裂解素2(ST2)信號(hào)通路在糖尿病等多種疾病中介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與糖尿病心血管病變過程[5-6]。目前，DR臨床治療以羥苯磺酸鈣等西藥為主，能夠明顯改善視網(wǎng)膜微循環(huán)，但存在毒副作用、后期效果不明顯等缺點(diǎn)，因而探索中藥制劑防治DR具有重要的臨床價(jià)值[7]。黃芩苷是中藥黃芩中的一種黃酮類有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗過敏及抑凋亡等功效，對(duì)糖尿病并發(fā)癥的靶器官具有保護(hù)作用[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，治療DR[10]。但黃芩苷對(duì)DR中視網(wǎng)膜新生血管生成情況的影響尚未見報(bào)道。本研究將探討黃芩苷調(diào)節(jié)IL-33/ST2通路對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜新生血管生成的影響，以期為改善DR癥狀提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康無眼部疾病的SD大鼠50只，體重210～230(221.58±6.35)g，購(gòu)自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司，許可證號(hào)為SCXK(粵)2020-0055。飼養(yǎng)條件：室內(nèi)濕度40%～50%，溫度23～25 ℃，明暗周期12 h/12 h，定期紫外線照射消毒。大鼠自由進(jìn)食，自由進(jìn)水，自由活動(dòng)。本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2 主要試劑與儀器鏈脲佐菌素(貨號(hào)：K0050)、黃芩苷(貨號(hào)：D0637)均購(gòu)自上海寶曼生物科技有限公司；大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)(貨號(hào)：SEKR-0032)、IL-6(貨號(hào)：SEKR-0005)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(貨號(hào)：SEKR-0009)ELISA試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；大鼠Ang-1(貨號(hào)：xy-E12734)、IL-33(貨號(hào)：xy-A13820)ELISA試劑盒均購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司；兔抗IL-33(貨號(hào)：ab187060)、兔抗ST2(貨號(hào)：ab228543)、兔抗GAPDH(貨號(hào)：ab9485)、羊抗兔二抗(貨號(hào)：ab97051)均購(gòu)自英國(guó)Abcam。MODEL550酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；MG8000化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Thmorgan公司。

1.2 方法

1.2.1 DR大鼠模型制備參照文獻(xiàn)[11]制備DR大鼠模型。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，腹腔注射70 mg·kg-1鏈脲佐菌素溶液，3 d后斷尾測(cè)量血糖，當(dāng)血糖≥16.7 mmol·L-1時(shí)為糖尿病模型建立成功。糖尿病大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，16周后觀察大鼠眼底，有明顯視網(wǎng)膜出血、毛細(xì)血管擴(kuò)張、動(dòng)靜脈異常者視為DR模型制備成功，未制備成功的大鼠予以剔除，并及時(shí)補(bǔ)充。所有大鼠均以右眼為實(shí)驗(yàn)眼。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及實(shí)驗(yàn)給藥將40只造模成功的DR大鼠分為DR模型組和黃芩苷低、中、高劑量組，每組10只。另取同期一直用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)的10只正常大鼠作為對(duì)照組。DR模型組和對(duì)照組大鼠灌胃生理鹽水；黃芩苷低、中、高劑量組大鼠分別給予75 mg·kg-1、150 mg·kg-1、300 mg·kg-1黃芩苷灌胃[10]，均為每天1次，灌胃6周結(jié)束。

1.2.3 FFA檢查大鼠視網(wǎng)膜血管生成情況灌胃結(jié)束后次日，每組各取4只大鼠，右眼滴復(fù)方托吡卡胺滴眼液，待充分散瞳后，給予1 mL·kg-1的100 g ·L-1的熒光素鈉溶液腹腔注射，觀察大鼠右眼熒光素滲漏情況及新生血管生成情況。

1.2.4 ELISA檢測(cè)大鼠血清血管生成相關(guān)因子及炎癥因子水平每組剩余6只大鼠用100 g ·L-1水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血3 mL，冰上靜置2 h后，3000 r·min-1離心5 min，分離血清于無菌Eppendorf管內(nèi)。血清樣本分別用VEGF、Ang-1、IL-6、IL-33、TNF-α ELISA試劑盒進(jìn)行ELISA檢測(cè)，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(D)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的D繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算大鼠血清VEGF、Ang-1、IL-6、IL-33、TNF-α水平。

1.2.5 Western blot檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜組織中IL-33/ST2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況大鼠取血后，頸椎脫臼法處死，完整摘下右眼眼球，剪除角膜，除去虹膜、晶狀體及玻璃體，將視網(wǎng)膜組織勻漿，加入組織裂解液抽提總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取20 μg總蛋白與適量上樣緩沖液混勻，100 ℃沸水浴變性，120 g ·L-1SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g ·L-1脫脂奶粉室溫封閉1 h，不同的目的蛋白條帶放入對(duì)應(yīng)的一抗稀釋液(兔抗IL-33、兔抗ST2、兔抗GAPDH，均12000稀釋)中，4 ℃過夜，用二抗稀釋液(11500稀釋)37 ℃ 孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色顯影，ImageJ軟件分析條帶灰度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜血管生成情況對(duì)照組大鼠右眼視網(wǎng)膜血管分布均勻，熒光素?zé)o滲漏。DR模型組大鼠右眼眼底新生血管增多，熒光素滲漏明顯。相對(duì)于DR模型組，黃芩苷低、中、高劑量組大鼠右眼視網(wǎng)膜新生血管有不同程度減少，熒光素滲漏亦有減少，且黃芩苷高劑量組新生血管、熒光素滲漏面積減少更明顯(圖1)。

圖1 FFA檢查各組大鼠右眼視網(wǎng)膜血管生成情況 A：對(duì)照組;B：DR模型組;C：黃芩苷低劑量組;D：黃芩苷中劑量組;E：黃芩苷高劑量。

2.2 各組大鼠血清血管生成相關(guān)因子水平ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DR模型組大鼠血清VEGF、Ang-1水平均顯著升高(均為P<0.05)。與DR模型組相比，黃芩苷低、中、高劑量組大鼠血清VEGF、Ang-1水平均顯著降低(均為P<0.05)。隨著黃芩苷劑量的升高，大鼠血清VEGF、Ang-1水平均逐漸降低(均為P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血清VEGF、Ang-1水平

2.3 各組大鼠血清炎癥因子水平ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DR模型組大鼠血清IL-6、IL-33、TNF-α水平均顯著升高(均為P<0.05)。與DR模型組相比，黃芩苷低、中、高劑量組大鼠血清IL-6、IL-33、TNF-α水平均顯著降低(均為P<0.05)。隨著黃芩苷劑量的升高，大鼠血清IL-6、IL-33、TNF-α水平均逐漸降低(均為P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠血清IL-6、IL-33、TNF-α水平

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中IL-33/ST2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況Western blot檢測(cè)結(jié)果見圖2和表3。與對(duì)照組相比，DR模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中IL-33、ST2蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(均為P<0.05)。與DR模型組相比，黃芩苷低、中、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜組織中IL-33、ST2蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(均為P<0.05)。隨著黃芩苷劑量的升高，大鼠視網(wǎng)膜組織中IL-33、ST2蛋白相對(duì)表達(dá)量均逐漸降低(均為P<0.05)。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中IL-33、ST2蛋白表達(dá)情況 A：對(duì)照組;B：DR模型組;C：黃芩苷低劑量組;D：黃芩苷中劑量組;E：黃芩苷高劑量。

3 討論

糖尿病發(fā)病率近年來呈現(xiàn)逐年增高趨勢(shì)，對(duì)人類健康威脅僅次于心血管疾病和腫瘤，其對(duì)人類健康的威脅主要在于會(huì)導(dǎo)致全身各器官的微血管發(fā)生病理性改變[12]。DR是視網(wǎng)膜微血管發(fā)生病理性改變的糖尿病并發(fā)癥，視網(wǎng)膜新生血管形成是其病情發(fā)展最重要的一環(huán)，而由于高血糖狀態(tài)下的視網(wǎng)膜新生血管發(fā)育并不完全，容易出血或機(jī)化，可牽拉視網(wǎng)膜產(chǎn)生裂孔或脫離，導(dǎo)致患者視力下降或喪失，是糖尿病患者視力喪失的主要原因之一[11,13-14]。因此，探討DR患者視網(wǎng)膜新生血管生成的機(jī)制，并尋求能安全有效地抑制新生血管生成的治療措施已成為DR研究的重要課題之一。

黃芩苷是傳統(tǒng)中藥黃芩的有效成分之一，是一種黃酮類化合物，因其具有抗炎、抗氧化、抗高血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種藥理活性，可對(duì)生物機(jī)體發(fā)揮保護(hù)作用[15]。郭斌等[16]研究表明，黃芩苷能通過抑制肺部的炎癥反應(yīng)，從而降低急性肺損傷大鼠肺組織的損傷程度。吳軍等[17]研究顯示，黃芩苷可以緩解高血糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡，可能達(dá)到治療糖尿病腎病小鼠的作用。劉珣等[10]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可能是通過抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡對(duì)DR大鼠起治療作用。朱勤偉等[15]研究顯示，黃芩苷能降低血糖、血脂，改善鐵代謝紊亂，保護(hù)糖尿病大鼠血管免受損傷。本研究結(jié)果顯示，大鼠建立DR模型后，眼底新生血管增多，且能觀察到熒光素明顯滲漏，血清血管生成相關(guān)因子VEGF、Ang-1及炎癥因子IL-6、IL-33、TNF-α水平均顯著升高，表明本研究建立的DR大鼠模型已有視網(wǎng)膜新生血管形成及血管出血現(xiàn)象，且體循環(huán)中已有大量血管生成相關(guān)因子、炎癥因子生成。使用黃芩苷治療后，大鼠視網(wǎng)膜新生血管生成減少，熒光素滲漏減少，血清VEGF、Ang-1、IL-6、IL-33、TNF-α水平均降低，且隨著黃芩苷使用劑量的升高，對(duì)DR大鼠的影響逐漸加深，本研究結(jié)果與勤偉等[15]和郭斌等[16]研究結(jié)果一致，表明黃芩苷能減輕DR大鼠體內(nèi)炎癥水平及血管生成因子的生成，減少視網(wǎng)膜新生血管生成及出血。

IL-33屬于IL-1家族成員，在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中起著核心作用。而ST2屬于IL-1受體家族成員，是IL-33的主要受體，兩者結(jié)合可促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生、釋放[18]。有研究顯示，IL-33/ST2信號(hào)通路能通過影響腫瘤干性、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、血管生成等過程，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19-20]。Theodoropoulou等[21]研究顯示，IL-33及其受體ST2在人、鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)，能調(diào)節(jié)組織重塑及眼部血管生成。Miller等[22]研究發(fā)現(xiàn)，IL-33能使炎癥、血管生成和病變?cè)鲋吵掷m(xù)存在，進(jìn)而調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜異位癥病變存活及進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，DR模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中IL-33、ST2蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著升高，血清IL-33水平亦較對(duì)照組顯著升高，提示IL-33/ST2信號(hào)通路參與DR發(fā)病，并推測(cè)IL-33/ST2信號(hào)通路可能參與調(diào)控DR大鼠體內(nèi)炎癥、新生血管生成過程。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)對(duì)IL-33/ST2信號(hào)通路在炎癥、血管生成方面的研究一致[21-22]。進(jìn)一步使用黃芩苷治療后，DR大鼠視網(wǎng)膜組織中IL-33、ST2蛋白表達(dá)水平均顯著降低，且隨著黃芩苷使用劑量的升高而逐漸降低，表明黃芩苷可抑制IL-33/ST2信號(hào)通路激活，減輕DR大鼠體內(nèi)炎癥水平，減少視網(wǎng)膜新生血管生成。

綜上所述，黃芩苷可抑制DR大鼠視網(wǎng)膜組織中IL-33/ST2信號(hào)通路激活，減輕體內(nèi)炎癥水平，減少視網(wǎng)膜新生血管生成，為臨床利用傳統(tǒng)中藥改善DR癥狀提供參考，但黃芩苷是否亦通過其他通路發(fā)揮作用仍有待后續(xù)深入分析。