烏佳美,馮秋紅,史作民,4,*,劉 順,曹向文,許格希

1 中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護研究所, 國家林業(yè)和草原局森林生態(tài)環(huán)境重點實驗室, 北京 100091 2 四川米亞羅森林生態(tài)系統(tǒng)定位觀測研究站,理縣 623100 3 四川省林業(yè)科學研究院, 成都 610081 4 南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 南京 210037

海拔是限制植物生活型和地理分布的重要因素[1]。隨海拔升高,一些環(huán)境因子(如溫度、CO2和O2分壓、大氣壓強、光照強度等)發(fā)生明顯變化[2—3]。海拔差異所引起的生長環(huán)境的變化驅動著植物生理和形態(tài)適應的多樣化[4],海拔梯度為驗證植物對環(huán)境變化的響應和適應提供了基礎。

葉片非結構性碳水化合物(NSC),包括可溶性糖和淀粉,是植物光合作用的產(chǎn)物,參與植物的生長和代謝[5—6],當光合作用產(chǎn)生的碳供應超過植物生長和維持的需求時,大量的NSC將儲備積累在植物組織中,以支持未來的生長[7—8]。高海拔環(huán)境中較低的溫度致使植物既需要足夠的碳水化合物來維持生長,同時也需要充足的可溶性碳水化合物來提高其在低溫環(huán)境下的生存能力[9],NSC、可溶性糖和淀粉含量的水平可以反映出植物中碳的吸收、利用與損失之間的平衡,以及植物對環(huán)境變化的響應[5, 10]。氮(N)是植物光合作用中的重要元素,大量的葉片氮(高達75%)存在于葉綠體中,其中大部分用于光合系統(tǒng)[11—12]。氮可直接影響葉片以及其他組織中的NSC的濃度[13],以往的研究顯示,葉片氮含量與NSC的固定能力呈正相關關系[14—16],同時NSC/N比值可以作為植物碳氮平衡的衡量指標[17]。分配于光合系統(tǒng)氮比例的增加可以支持植物具有較高的光合速率[18],而分配于其他組分氮比例涉及到細胞內以不同形式存在的氮,或作為其他含氮物質原料,或參與到其他生理過程以提高植物對環(huán)境的適應性[19—20],各個組分間氮分配比例的調節(jié)緊密聯(lián)系著植物的生長、發(fā)育、防御和競爭[18]。在不同的研究對象與生長條件下,植物葉片NSC及可溶性糖和淀粉、氮含量與氮分配對海拔的響應并不一致[21—27],這種差異的潛在驅動因素,仍不是特別清楚[7],對于NSC與氮和氮分配相互關系方面的研究仍然缺乏。

大葉醉魚草(Buddlejadavidii)在川西亞高山林區(qū)分布廣泛,海拔跨度較大,適應能力強,是研究植物對海拔響應與適應的理想物種。通過本研究,試圖回答以下科學問題：1) 隨海拔升高,大葉醉魚草葉片NSC及可溶性糖和淀粉,和氮含量及氮分配的響應如何？2) 大葉醉魚草葉片NSC與氮和氮分配之間有什么樣的關系？3) 大葉醉魚草葉片NSC及可溶性糖和淀粉,和氮含量及氮分配情況在植物適應與響應不同海拔環(huán)境的過程中有什么樣的作用？

1 研究區(qū)域與研究方法

1.1 研究區(qū)域概況

巴郎山位于橫斷山脈東部,青藏高原東南緣的邛崍山東坡,地處臥龍自然保護區(qū)范圍(30°45′—31°25′N,102°52′—103°24′E),是四川盆地向川西高原的過渡地帶,海拔跨度較大,最高5040 m。屬亞熱帶內陸山地氣候,冬寒夏涼、干濕季節(jié)明顯,植物種類豐富。在海拔2700 m地帶,年平均氣溫8.4 ℃,≥ 0 ℃的活動積溫為4000 ℃,年平均降水量861.8 mm,其中生長季5—9月的降水量占全年降水量的68.1%,年平均相對濕度在80%左右。山地棕壤為其主要土壤類型[28—29],土壤有機質含量在2%—8%,土壤呈微酸性反應,pH值6.0—6.5。陽離子交換量每100 g ± 20—40 cmol(+),交換性陽離子以鈣、鎂和鈉為主[30]。

1.2 研究方法

1.2.1樣地選取與樣品采集

2016年7—8月,沿巴郎山選擇5個不同海拔(2200 m、2500 m、3100 m、3400 m和3700 m)的研究地點,每個地點選取7株不被遮擋的生長良好的大葉醉魚草植株,每個植株選擇2—3片新的完全伸展健康的向陽葉片,用于光合參數(shù)的測定。每株取30片鮮葉片,進行掃描(Perfection v700 Photo, Epson, Nagano-ken, Japan),用于估算葉片面積,隨后在105 ℃烘箱中殺青帶回,放入(70±2) ℃的烘箱中烘干至恒量,稱量葉片干重,并進行比葉重(LMA,g/m2)的計算。隨后粉碎并過0.25 mm篩,用于測定葉片NSC含量和氮含量；另取1份鮮葉片用錫紙包裹,存于液氮中帶回,用于葉片細胞壁氮含量和葉綠素含量(Cchl)的測定。

1.2.2光合參數(shù)的測定

在晴天的09：00—15:00使用Licor- 6400便攜式光合作用測定系統(tǒng)(LI-Cor, Lincoln, NE, USA),適配6400- 40熒光葉室對植物葉片進行光響應曲線、CO2響應曲線和葉綠素熒光參數(shù)的測定。測定時使用高枝剪取下樹枝后立即插入裝滿清水的桶中,隨后在水里進行二次剪切,剪掉樹枝底端以防因氣體栓塞而影響植物相關葉片光合參數(shù)。

對葉片進行光響應曲線及CO2響應曲線的測定。測定時將葉室溫度設定為25 ℃,濕度控制在60%—80%。氣體交換測定時首先將參比室CO2濃度設定為大氣CO2濃度,按照由高到低依次為1800、1500、1200、1000、800、600、400、200、150、100、80、50、20、0 μmol m-2s-1的光合光量子通量密度(PPFD)梯度測定葉片光響應曲線,利用獲得的光響應曲線確定光飽和點。在飽和PPFD下,將葉室CO2濃度設定為400 μmol/mol,待系統(tǒng)穩(wěn)定后進行CO2響應曲線測定,將參比室CO2濃度按照400、200、150、100、80、50、400、600、800、1000、1200、1500、1800和2000 μmol/mol進行設定。在飽和PPFD、大氣CO2濃度下,葉片經(jīng)充分光活化后,進行葉綠素熒光參數(shù)測定,設定飽和脈沖光光強> 8000 μmol m-2s-1(0.8s)。

1.2.3葉肉導度、最大羧化速率和最大電子傳遞速率的估算

葉肉導度(gm,molCO2m-2s-1)的估算使用Harley等[31]提出,并由Loreto等[32]改進的J變量法。對葉片最大羧化速率(Vcmax,μmol m-2s-1)和最大電子傳遞速率(Jmax,μmol m-2s-1)的估算使用Sharkey等[33]提供的Microsoft Excel擬合程序。

1.2.4葉片NSC含量的測定

葉片NSC含量為可溶性糖和淀粉含量之和,其中可溶性糖主要對單糖(這里指葡萄糖和果糖)和多糖兩個部分進行了分析,所有含量的單位均為百分比干重。

參照《現(xiàn)代使用儀器分析方法》[34],進行可溶性糖的提取。將約0.5 g干粉樣品與50 mL蒸餾水一起加入錐形瓶中。在蒸汽鍋中煮沸2 h后,將溶液樣品冷卻,然后定容過濾,濾液待上機。將濾液注入裝有Sugar-Pak I柱的Waters 2695高效液相色譜儀(Waters-Millipore,Milford,MA,USA)中,進行葡萄糖、果糖、多糖等可溶性糖的測定。

參照《食品物理化學分析方法》[35],進行淀粉的提取。將約0.1 g干粉樣品加到裝有10 mL蒸餾水的塞管中,并加入1 mL 2∶1的HCL,然后在100℃下水浴8 h。冷卻后,用40%NaOH將pH調至中性,然后定容過濾,濾液待上機。淀粉含量的測定方法與可溶性糖的測定方法相同。

1.2.5葉片氮含量及氮分配比例的測定與計算

用凱氏定氮法測定葉片氮含量(g/kg),采用化學分離法測定細胞壁氮含量(g/kg)[36],采用分光光度計法測定葉綠素含量[37]。葉片氮分配的計算參見Niinemets和Tenhunen[38]：

PP=PR+PB+PL

PP+PCW+Pother=1

式中：PR(g/g)為核酮糖- 1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)氮分配比例,PB(g/g)為生物力能學組分氮分配比例,PL(g/g)為捕光組分氮分配比例。Narea是單位面積氮含量(g/m2)。Vcr為Rubisco比活,Jmc為單位細胞色素f(Cytochrome f)的最大光合電子傳遞速率,在25℃時Vcr為20.78(μmolCO2(g Rubisco)-1s-1),Jmc為155.64(μmol electron (μmol cytochrome f)-1s-1)。Cchl為葉綠素濃度(mmol/m2),CB為捕光組分中葉綠素與氮的比值(mmol Chl (g N)-1),取值可以利用擬合出的CB與LMA的線性公式來進行計算,其相關系數(shù)較高(R2=0.97),可以在多種植物類型中廣泛應用[19]。PP(g/g)為光合系統(tǒng)氮分配比例；PCW(g/g)為細胞壁氮分配比例,是細胞壁氮含量和單位干質量葉片氮含量之商；Pother(g/g)為其他組分氮分配比例。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗不同海拔間NSC、可溶性糖和淀粉含量、氮和氮分配比例的差異,并用Tukey方法進行多重比較,在P<0.05時差異顯著；采用Spearman相關分析NSC及可溶性糖和淀粉含量,和氮分配比例之間的關系。利用Origin 8軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 大葉醉魚草葉片NSC、淀粉和可溶性糖含量隨海拔的變化

隨海拔升高,大葉醉魚草葉片單糖、可溶性糖、淀粉和NSC含量呈增加趨勢,而多糖含量、可溶性糖/淀粉在海拔間無顯著差異(圖1)。單糖在海拔3400 m和3700 m含量較高,而在海拔2200 m和2500 m較低,前者平均是后者的4.5倍。可溶性糖在海拔3700 m含量最高,在海拔2200 m最低,海拔3700 m的可溶性糖含量是2200 m的2.4倍。淀粉在海拔3700 m含量最高,而在海拔2500 m最低,海拔3700 m的淀粉含量是2500 m的1.6倍。NSC含量在海拔3700 m最高,而在海拔2200 m和2500 m最低,前者平均是后者的1.9倍。海拔每升高1000 m大葉醉魚草葉片單糖、可溶性糖、淀粉和NSC含量分別增加6.2、10.9、5.0和15.9 g/100g。

圖1 不同海拔大葉醉魚草葉片單糖、多糖、可溶性糖、淀粉和NSC含量及可溶性糖/淀粉比值Fig.1 The contents of monosaccharide, polysaccharide, soluble sugar, starch and NSC, and soluble sugar/starch ratio of Buddleja davidii leaves at different elevations不同小寫字母代表不同海拔間差異顯著(P<0.05)；圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤差(n=5—7)

2.2 大葉醉魚草葉片氮分配比例隨海拔的變化

不同海拔間PP、PR、PB和PL沒有顯著差異(圖2)。隨海拔升高,葉片PCW呈降低的趨勢,海拔2200 m的PCW最高,而海拔3400 m和3700 m的PCW較低,前者平均為后者的2倍。葉片分配于除光合系統(tǒng)與細胞壁以外的其他組分的氮比例(Pother)隨海拔的升高則呈增加的趨勢,海拔3700 m的Pother最高,海拔2200、2500、3100 m較低,前者平均為后者的2.6倍。此外,沿海拔梯度大葉醉魚草葉片PR和PCW沒有表現(xiàn)出顯著的相關關系(圖3)。

圖2 不同海拔大葉醉魚草葉片氮和氮分配比例Fig.2 Nitrogen concentration and fraction of nitrogen allocations of Buddleja davidii leaves at different elevations不同小寫字母代表不同海拔間差異顯著(P<0.05)；圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤差(n=5—7)

2.3 大葉醉魚草葉片NSC/N比值隨海拔的變化

如圖4所示,隨海拔升高,大葉醉魚草葉片NSC/N比值呈增加的趨勢,海拔3400 m和3700 m顯著高于海拔2200 m和2500 m。

2.4 大葉醉魚草葉片NSC、可溶性糖和淀粉含量與氮分配比例的相關性

如表1所示,大葉醉魚草葉片可溶性糖含量與淀粉含量、NSC和Pother顯著正相關,與PCW顯著負相關。淀粉含量與NSC含量顯著正相關,與PCW顯著負相關。NSC含量與Pother顯著正相關,與PCW顯著負相關。PP和PCW與Pother顯著負相關。

表1 不同海拔大葉醉魚草葉片NSC、可溶性糖、淀粉和氮分配比例的相關系數(shù)

3 討論

3.1 大葉醉魚草葉片NSC、可溶性糖和淀粉含量的海拔響應

大葉醉魚草葉片NSC含量隨海拔升高而增加(圖1),這與Wang等[7]對川滇高山櫟(Quercusaquifolioides)、Wang等[39]對岳樺(Betulaermanii)研究得到了一致的結果,但也有研究得到了不同的變化趨勢[21, 40],這可能是受樹種、研究區(qū)域生境(如溫度、水分)、競爭等因素的影響[5, 13, 21]。對NSC進一步的分析發(fā)現(xiàn)NSC含量沿海拔的變化趨勢與可溶性糖和淀粉含量的變化趨勢一致,可溶性糖/淀粉比值隨海拔沒有顯著的變化趨勢(圖1),且NSC含量、可溶性糖和淀粉含量三者間相互顯著正相關(表1),說明高海拔大葉醉魚草葉片NSC含量的增加是可溶性糖和淀粉含量共同積累的結果,這與以往的一些研究結果一致[41],但研究對象或研究地點的差異使NSC含量累積有不同的決定因素[24, 27]。以往研究認為,葉片碳儲備庫(淀粉含量)的增加是對生長速率降低的被動響應[18],也是植物響應高海拔較惡劣的環(huán)境條件的一種保險措施[42]。相較于非滲透調節(jié)活性物質的淀粉[43],可溶性糖的增加提高了細胞液滲透壓,為植物提供滲透保護以防止凍傷、結冰并抵御低溫[27, 44]。本研究中大葉醉魚草葉片可溶性糖隨海拔顯著升高的變化趨勢與單糖的變化趨勢一致(圖1),說明可溶性糖的變化主要是由單糖含量引起的。單糖通常用作細胞呼吸和其他分子合成的滲透調節(jié)物質和底物,主要參與維持代謝活性和滲透勢,而多糖滲透活性較低,是常見的淀粉成分,允許植物大量累積[6]。

圖3 不同海拔大葉醉魚草葉片Rubisco氮分配比例(PR)和細胞壁氮分配比例(PCW)的關系Fig.3 The fraction of leaf nitrogen allocated to Rubisco (PR) in relation to the fraction of nitrogen allocated to cell wall (PCW) in leaves of Buddleja davidii at different elevations

圖4 不同海拔大葉醉魚草葉片NSC/N比值 Fig.4 NSC to nitrogen ratio of Buddleja davidii leaves at different elevations不同小寫字母代表不同海拔間差異顯著(P<0.05)；圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤差(n=5—7)

葉片NSC含量取決于兩個方面,一是碳供應(光合作用),二是碳消耗(呼吸和生長)[14]。有研究認為高海拔較低的溫度可能對光合作用有較大的限制[45],但也有研究證實低溫對植物光合作用的影響往往滯后于對體內其他生化過程的抑制[43],生長比光合作用對寒冷更敏感[44, 46]。一些研究認為高海拔地區(qū)的植物碳供應是充足的[25, 47],因此在這種前提下,高海拔較高的葉片NSC含量與其他同化需求(如呼吸、生長等)的降低有關[8]。有很多研究證實,低溫下的植物生長會大大降低[46, 48],隨海拔升高的低溫誘導限制了植物光合同化產(chǎn)物轉化為結構性物質[43],致組織形成受限,從而導致充足的碳沒能被生長利用[49],進而引起葉片NSC的累積。

3.2 大葉醉魚草葉片氮分配比例的海拔響應

大葉醉魚草葉片氮含量沒有隨海拔變化發(fā)生顯著的差異(圖2),這與以往的一些研究結果一致[7]。但不同植物物種與研究區(qū)域的差異,會使葉片氮含量隨海拔變化呈現(xiàn)出不一致的變化趨勢[50]。大葉醉魚草葉片分配于各組分的氮比例隨海拔升高表現(xiàn)出了不一致的變化趨勢(圖2)。葉片PP、PR、PB和PL在海拔間差異不顯著,這與以往的研究結果不完全一致[23, 26],因此,植物分配于光合系統(tǒng)中各組分的氮與海拔并沒有一致的變化趨勢,引起這些差異的原因可能是植物物種、生境以及葉經(jīng)濟性狀的不同[51]。隨海拔升高而分別降低和升高的PCW和Pother與以往對糙皮樺(B.utilis)葉片沿海拔梯度氮分配的研究結果一致[28],說明隨海拔升高,大葉醉魚草葉片并沒有通過調高PP來增強資源獲取能力,而是通過調整PCW和Pother來適應變化的生境。

以往的研究認為PR和PCW間的關系代表了葉片分配于細胞壁的氮的變化是否影響分配于光合作用的氮,即是否存在生長和形態(tài)建成之間競爭性的取舍[52—53]。一些研究顯示PR和PCW存在權衡關系[54—55],但同樣也有研究認為PR和PCW間沒有發(fā)生權衡[53, 56]。對于PR和PCW間是否發(fā)生權衡與植物物種、生長階段及生長環(huán)境有很大關系。本研究中,沿海拔梯度大葉醉魚草PR和PCW沒有表現(xiàn)出顯著的負相關關系(圖3),說明隨海拔的變化PR和PCW之間可能并沒有發(fā)生權衡,這也進一步證明大葉醉魚草葉片氮分配對海拔梯度的響應主要在于對PCW和Pother的調整。

3.3 大葉醉魚草葉片非結構性碳水化合物與氮和氮分配比例的相關性

葉片NSC/N比值在很大程度上反映了NSC的產(chǎn)出和利用效率與氮的投入之間的關系[57],隨著海拔的升高,大葉醉魚草葉片NSC/N比值顯著增加(圖4),這與Wang等[7]對川滇高山櫟的研究得到了一致的趨勢,有研究認為NSC/N比值的增加可能意味著每單位氮的投入產(chǎn)出了更多的NSC,即氮的利用效率較高[58]。通過對比大葉醉魚草葉片NSC含量和氮含量隨海拔的變化趨勢,發(fā)現(xiàn)隨海拔升高NSC/N比值的增加主要歸因于隨海拔增加的NSC含量而非海拔間差異不顯著的氮含量,說明氮不是NSC累積的限制因子,即在不同海拔間氮對于大葉醉魚草來說是充足的。雖然葉片光合能力和NSC合成受到氮的重要影響[18],但在葉片氮充足的條件下,大葉醉魚草葉片NSC含量與PP沒有顯著的相關性(表1),即葉片用于光合作用的氮也不是NSC含量在高海拔較高的累積量的直接原因。

葉片非結構性碳水化合物含量反映了可用于抵御外部不利環(huán)境的植物碳水化合物的數(shù)量[6],尤其葉片中可溶性糖的積累對植物來說是一種耐冰凍的機制[44]。而Pother同時也關系到植物生殖、防御、結構以及激素的生產(chǎn)、儲存和再利用等生理過程,Pother的增加可增強植物適應外界環(huán)境的能力[19]。這也解釋了本研究中大葉醉魚草葉片Pother與NSC含量和可溶性糖含量的顯著正相關關系(表1)。結合Pother、NSC含量和可溶性糖含量隨海拔升高所呈現(xiàn)出的一致的升高趨勢(圖1,圖2),說明大葉醉魚草通過支持葉片其他生理過程的活性提高了抵御高海拔較惡劣環(huán)境的能力。

4 結論

高海拔低溫降低了大葉醉魚草的同化需求,限制了葉片光合同化產(chǎn)物轉化為生長所需的結構性物質,使葉片累積了較高的為植株提供保險措施的淀粉含量和提供滲透保護與參與代謝過程的可溶性糖含量。隨海拔升高,大葉醉魚草葉片氮和其中分配于光合系統(tǒng)的氮維持不變,為其在不同海拔提供了穩(wěn)定的資源獲取能力,高海拔增加的分配于其他組分的氮,增強了葉片其他生理過程的活性。隨海拔升高而增加的葉片非結構性碳水化合物含量和分配于其他組分氮比例,與二者相互間緊密的相關性,共同為提高的大葉醉魚草抵御和適應高海拔較惡劣生境的能力提供了支持和保證。