秦志偉，葉 博,2，劉 玲,

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽 110000；2.遼寧現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程中心，遼寧沈陽 110000）

肉及肉制品能夠提供多種營養(yǎng)物質(zhì)，是人們?nèi)粘ｏ嬍持械闹匾M成部分。人們每天食用100 g肉制品就能滿足每日推薦量（RDA）50%的鐵、鋅、硒、維生素B、維生素B和100%的維生素A。其中的必需氨基酸、高品質(zhì)蛋白質(zhì)、鋅、鐵、硒和?；撬?、肉堿、肌酸等生物活性物質(zhì)，對人體健康十分有益。但是，熱加工肉制品時容易產(chǎn)生一些有毒有害的物質(zhì)，比如相關(guān)研究表明，我國肉制品傳統(tǒng)加工方式燒烤、油炸、煎炸和醬鹵中，高溫加工產(chǎn)生大量致癌物丙烯酰胺（AA）、亞硝胺（NAs）和雜環(huán)胺（HAAs）等。它們通過食物攝入人體后，會通過胃腸道迅速吸收，并通過血液循環(huán)系統(tǒng)在肝臟、腎臟、胸腺和心臟等器官聚集，對人類健康造成不利影響。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將部分HAAs 和NAs 歸類為2B 類人體致癌物，而IQ 和AA 被列為2A 類人體致癌物。

近年來，文獻(xiàn)報道了一些使用GC、GC-MS、LC、GC-MS、LC-UVD和 LC-MS/MS分析胺類物質(zhì)的方法，其中采用GC-MS 進(jìn)行AA和HAAs 的測定方法通常需要繁瑣的衍生化處理。LC-MS 和LC-MS/MS 是目前最常用的方法，因為這些方法無需衍生化處理即可對復(fù)雜基質(zhì)中的某種胺類物質(zhì)進(jìn)行分離和測定。然而，目前缺乏對熱加工肉制品中主要胺類物質(zhì)統(tǒng)一快速準(zhǔn)確的分析方法。因此，本研究目標(biāo)建立一種穩(wěn)定且靈敏的方法用于熱加工肉制品中AA、NAs 和HAAs 等20 種胺類物質(zhì)的痕量分析。該方法采用簡單、快速的乙腈鹽析均相萃取，通過LC-MS/MS 進(jìn)行測定，可應(yīng)用于燒烤、油炸和煎烤等不同肉制品中AA、NAs 和HAAs 的分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮屠宰的豬肉里脊、牛肉里脊、雞胸肉和羊后腿肉 購自沈陽市二臺子清真牛羊屠宰廠（沈陽市綠洲生豬屠宰場和沈陽華美畜禽有限公司）；雜環(huán)胺類：2-氨基-1,6-二甲基咪唑并吡啶（DMIP）、2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并[4,5-f]喹噁啉（IQx）、2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并喹啉（IQ）、2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹惡啉（MeIQx）、2-氨基-3,7,8-三甲基-3H-咪唑并[4,5-f]喹噁啉（7,8-DiMeIQx）、2-氨基-3,4,8-三甲基-3H-咪唑[4,5-f]喹喔啉（4,8-DiMeIQx）、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（Norharman）、哈爾滿堿（Harman）、3-氨基-1-甲基-5H-吡啶[4,3-b]吲哚（TRP-P-2）、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-b]吡啶（PHIP）、3-氨基-1,4-二甲基-5h-吡啶[4,3-b]吲哚乙酸（Trp-P-1）、2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-15N3（AaC）、2-氨基-3,4-二甲基-3H-咪唑并喹啉（MeIQ）、內(nèi)標(biāo)：Nroharman-d7、4,7,8-TriMeIQx（純度為99%）Toronto Research Chemicals 公司；丙烯酰胺：AA，純度為99% 阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；亞硝胺類：N-亞硝基二苯胺（N-nitrosodiphenylamine，NDPHA）、N-亞硝基二丙胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亞硝基二丁胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA）、N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、N-亞硝基吡咯烷（Nnitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亞硝基嗎 啉（Nnitrosomorpholine，NMOR），純度為99% 麥克林化學(xué)試劑有限公司；正己烷、乙腈、甲醇 色譜純，上海Sigma 公司；PSA、HC-C凈化劑 上海安譜實(shí)驗科技有限公司；整個實(shí)驗使用Milli-Q 凈水系統(tǒng)生產(chǎn)的超純水。

CR21N（立式）高速冷凍離心機(jī) 日本日立株式會社；Lab Dancer 渦旋混勻器 德國IKA 公司；Waters 超高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源（ESI）及Masslynx V4.1 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）美國Waters 公司；FSH-2A 高速均質(zhì)機(jī) 上?？得魴z驗設(shè)備有限公司；Milli-Q 超純水機(jī) 美國Millipore 公司；MP-2002 型分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；ACQUITY UPLC BEH C柱 上海沃特世科技有限公司；Extend C柱和EclipsePlus C柱 中國安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 500 μg/mL 的單個AA、NAs、HAAs 及內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)母液用乙腈配制。通過乙腈稀釋母液獲得混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液、混合內(nèi)標(biāo)儲備溶液（5.0 mg/L）和標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/L）。使用前，將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用流動相（1 mmol/L 乙酸銨0.06%甲酸/乙腈，95/5，v/v）稀釋成濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、100.0 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，所有混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液都含有20 μg/L 的4,7,8-TriMeIQx和Norharman-d7。

1.2.2 樣品的制備 原料肉洗凈，修整，去除表面可見的脂肪和筋膜組織。原料肉切成（5.0 cm×3.0 cm×0.3 cm）立方體，將約1 kg 的木炭放在烤爐上，將50 mL汽油倒在煤炭上生火，在烤爐上方放上平底鍋，在230 °C 以不同時間（3、5 和7 min）煎制。未處理的肉樣作為對照組。肉樣處理后均已達(dá)到可食用熟度。且在整個處理過程中未添加香辛料和食品添加劑等佐料。肉品處理后冷卻，切成小顆粒（0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm），真空包裝在尼龍塑料袋中，-80 °C下儲存。

1.2.3 樣品的處理 取2 g 均勻肉樣加入50 mL 離心管中，分次加入5 mL 正己烷渦旋除脂。將4 μL的混合內(nèi)標(biāo)儲備溶液和4 μL 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液依次加入離心管。加入4 mL 氫氧化鈉溶液（1 mmol/L）和6 mL 的乙腈均質(zhì)，渦旋分散并超聲。加入2 g NaCl和2 g NaSO至離心管，渦旋。以4000 r/min 離心3 min，收集上清液，4 mL 的乙腈重提，合并上清液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到0.5 mL，用流動相（1 mmol/L 乙酸銨0.06%甲酸/乙腈，95/5，v/v）稀釋到1 mL，渦旋2 min，溶液轉(zhuǎn)移至裝有50 mg PSA 的2 mL 離心管中，以12000 r/min 離心3 min，上清液過0.22 μm 的濾膜，待分析。

1.2.4 檢測儀器條件 AA、NAs 和HAAs 的色譜分離在安捷倫Eclipse C柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）上進(jìn)行，柱溫為30 °C。流動相由溶劑A（1 mmol/L乙酸銨0.06%甲酸）和溶劑B（乙腈）組成。流速為0.2 mL/min，采用以下線性梯度洗脫程序：0～0.2 min，5% B；0.2～3.0 min，5%～40% B；3.0～7.0 min，40%～100% B；7.0～8.0 min，100% B；8.0～9.0 min，100%～5% B；9.0～12.0 min，5% B。進(jìn)樣量為3 μL。

ESI 以正模式進(jìn)行，優(yōu)化工作參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓：0.8 kV；錐孔電壓：30 V；離子源溫度：100 °C；脫溶劑氣溫度：650 °C；脫溶劑氣（N）流量：1000 L/h；錐孔氣（N）流量：3 L/h；MS/MS 分析采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。目標(biāo)分析物和兩種內(nèi)標(biāo)的保留時間、最佳碰撞能量和MRM 離子對等信息如表1 所示。

表1 AA、NAs、HAAs 的質(zhì)譜條件Table 1 MS conditions of AA,NAs and HAAs

1.2.5 樣品中胺類物質(zhì)的定性和定量分析 利用色譜圖中對應(yīng)的保留時間和MRM 離子對對被檢胺類物質(zhì)進(jìn)行定性。用陰性樣品的基質(zhì)提取液和純?nèi)軇┡渲葡嗤瑵舛鹊幕|(zhì)匹配校準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述檢測條件檢測，AA 和NAs 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度x（ng/mL）為橫坐標(biāo)，各組分的峰面積y 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法對其濃度進(jìn)行定量。HAAs以標(biāo)準(zhǔn)品濃度x（ng/mL）為橫坐標(biāo)，各組分的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用內(nèi)標(biāo)法對其濃度進(jìn)行定量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3 次，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；20 種胺類物質(zhì)的色譜圖采用Masslynx V4.1軟件進(jìn)行分析；其他數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2019進(jìn)行處理，并使用Origin 2018 軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的優(yōu)化

流動相中添加適當(dāng)?shù)囊宜徜@可有效改善AA、NAs 和HAAs 的峰形，在ESI模式下乙酸銨的添加與胺類物質(zhì)的電離抑制呈正相關(guān)，因此會影響其響應(yīng)強(qiáng)度。分別以0.5～20 mmol/L 五種乙酸銨緩沖溶液為流動相考察對胺類物質(zhì)響應(yīng)強(qiáng)度的影響。圖1 為20～0.5 mmol/L 的乙酸銨添加量下20 種胺類物質(zhì)的色譜圖。從圖中紅圈標(biāo)注部分可看出隨著乙酸銨添加量的減少部分胺類物質(zhì)的響應(yīng)強(qiáng)度增加。但是，當(dāng)乙酸銨添加量降到0.5 mmol/L 時，峰形有明顯的拖尾現(xiàn)象，且20 種胺類物質(zhì)的整體響應(yīng)強(qiáng)度低于乙酸銨添加量為1 mmol/L 的強(qiáng)度，因此選擇1 mmol/L 乙酸銨作為最后乙酸銨的添加量。

圖1 流動相中不同乙酸銨添加條件下20 種胺類物質(zhì)的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 20 amines under different ammonium acetate addition conditions in mobile phase

在ESI模式下，流動相中少量的甲酸、乙酸會提高化合物的電離效率并有助于其色譜分離，本文以1 mmol/L 的乙酸銨為流動相分析加入0.04%、0.06%、0.1%和0.2%甲酸對20 種胺類物的分離效果。結(jié)果表明（圖略）隨著甲酸濃度從0.04%增加到0.2%，胺類化合物迅速解離成離子形式，在C柱上的保留不斷減弱，部分目標(biāo)物出現(xiàn)保留時間縮短、色譜峰重疊和拖尾等現(xiàn)象。當(dāng)甲酸添加量為0.04%、0.1%和0.2%時，MeIQx 和IQx、NPYR 和IQ、TRP-P-1和AaC、MeIQ 和DMIP 的色譜峰重疊，只有當(dāng)甲酸添加量為0.06%時MeIQx、IQx、NPYR、DMIP、TRP-P-1、AaC 的色譜峰可以有效分離，因此選擇0.06%的甲酸加入乙酸銨中。在優(yōu)化的UHPLCMS/MS 條件下，20 種胺類物標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖和提取離子流圖如圖2 和圖3 所示。

圖2 流動相為1 mmol/L 乙酸銨0.06%甲酸條件下20 種胺類物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of a mixed standard solution of 20 amines with the mobile phase 1 mmol/L ammonium acetate and 0.06% formic acid

圖3 流動相為1mmol/L 乙酸銨0.06%甲酸條件下20 種胺類物質(zhì)提取離子流圖Fig.3 Ion flow diagram of 20 kinds of amines extracted with the mobile phase 1 mmol/L ammonium acetate and 0.06% formic acid

2.2 胺類物質(zhì)提取條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑選擇 不同化合物間極性差異較大，極性強(qiáng)度范圍很廣，熱加工肉制品基質(zhì)復(fù)雜，且富含油脂。因此，為了同時提取復(fù)雜基質(zhì)體系中的目標(biāo)化合物，非常需要探究提取溶劑適宜性。因此本研究以空白肉樣為基質(zhì)樣品，分析90%乙腈水、乙腈、含0.1%甲酸的乙腈和乙腈/1 mmol/L 的NaOH 溶液（6/4，v/v）對20 種胺類物質(zhì)回收率的影響。如圖4 所示，以90%乙腈水、乙腈、含0.1%甲酸的乙腈為提取劑時，部分極性雜環(huán)胺和亞硝胺類的回收率低于60%，甚至NDBA 和NMOR 的回收率低于40%，在同時提取胺類物質(zhì)時提取效率不穩(wěn)定。當(dāng)以乙腈/NaOH 溶液（6/4，v/v）為提取劑時，回收率穩(wěn)定在69.46%～103.13%之間，具有良好的穩(wěn)定性。

圖4 20 種胺類物質(zhì)在不同提取劑中的回收率Fig.4 Extraction recoveries of 20 amines in different extractants

2.2.2 純化條件的優(yōu)化 PSA 和HC-C是在QuECh-ERS 技術(shù)中常用的吸附劑。本研究以不同用量的PSA（20、30、40 和50 mg）以及30 mg PSA+30 mg HC-C分析對胺類物質(zhì)回收率的影響。如圖5 所示，隨著PSA 用量的增加，胺類物質(zhì)的回收率先降低后增加。當(dāng)PSA 的用量增至50 mg，回收率相對較好。當(dāng)以30 mg PSA+30 mg HC-C作為吸附劑時，DMIP、IQX、IQ 和MeIQ 的吸附率均低于60%，其余胺類物質(zhì)的回收率降低。總體而言，使用50 mg 的PSA 作為吸附劑時可以獲得良好的提取和純化效果。

圖5 20 種胺類物質(zhì)在不同吸附劑中的回收率Fig.5 Extraction recoveries of 20 amines in different adsorbents

2.3 方法驗證

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng)（ME）由空白樣品（B）和純?nèi)軇ˋ）的斜率之比計算（ME=B/A）。通常，ME＜0.8 表示基質(zhì)抑制，而ME＞1.2 表示基質(zhì)增強(qiáng)?；|(zhì)效應(yīng)結(jié)果如表2所示，DMIP、IQ 和TRP-P-2、NPYR 和NDPHA 的ME 均在0.41～0.79 之間，說明它們具有嚴(yán)重的基質(zhì)抑制作用；IQx、NDPA 和NDBA 的ME 范圍為0.80～0.83，具有輕微的基質(zhì)抑制作用，可以忽略不計；其余目標(biāo)化合物的ME 介于0.93～1.23 之間，基本沒有基質(zhì)效應(yīng)。因此，為了進(jìn)一步校準(zhǔn)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用基質(zhì)校準(zhǔn)曲線對目標(biāo)化合物進(jìn)行定量。

胺類物質(zhì)的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)如表2 所示，溶劑校準(zhǔn)曲線在其相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)呈線性，所有研究的AA、NAs 和HAAs 的測定系數(shù)均大于0.991。檢測限（LOD）和定量限（LOQ）分別以產(chǎn)生信噪比的濃度（S/N）為3 和10 表示。20 種胺類物質(zhì)的LOD 和LOQ 范圍分別為0.01～1.6 ng/g 和0.03～4.8 ng/g，可以滿足實(shí)際樣品的定量檢測。

表2 20 種目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Standard curves,detection limits,quantification limits and matrix effects of 20 target compounds

2.3.2 回收率和精密度測試 通過3 個不同濃度（1×、5×和10×LOQ）下添加6 個重復(fù)樣品來估算回收率。準(zhǔn)確度表示為測量濃度和加標(biāo)濃度之間的差異。精密度表示為相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，%）。從表3 和表4 可見，日內(nèi)回收率在66.3%～116.5%之間，3 個加標(biāo)水平下回收率的平均值在70.2%～110.1%范圍內(nèi)。日內(nèi)精密度在0.78%～9.0%之間，3 個加標(biāo)水平精密度的平均值在3.8%～7.3%范圍內(nèi)。5×LOQ 加標(biāo)水平計算的日間精度范圍為3.4%～9.4%。結(jié)果表明這種特定類型脂肪基質(zhì)的樣品制備方法具有良好的可重復(fù)性，方法回收率高，準(zhǔn)確度和精密度良好。整個方法具有良好的穩(wěn)定性，可用于實(shí)際樣品的檢測。

表3 20 種胺類物質(zhì)的加標(biāo)回收率Table 3 Standard recovery rates of 20 amines

表4 20 種胺類物質(zhì)的精密度Table 4 Precisions of 20 amines

2.4 煎烤產(chǎn)品的檢測分析

采用本研究建立的方法測定3、5、7 min 下煎烤的四種肉制品，共檢測出9 種胺類物質(zhì)，見表5，包括AA，三種亞硝胺（NDPHA、NDBA 和NPIP），三種極性雜環(huán)胺（4,8-DiMeIQx、7,8-DiMeIQx 和PHIP）和兩種非極性雜環(huán)胺（Norharman 和Harman），其他的胺類物質(zhì)未檢出。在相同的加熱時間下，不同肉制品之間形成的胺類物質(zhì)含量差異顯著（＜0.05）。這三個溫度的設(shè)定，考慮分別界定煎烤模式下的微熟、熟和焦熟三種狀態(tài)，但是由于四種肉的成熟條件有一定差異，又難以通過區(qū)別加熱來衡量，因此在保證全部熟制條件下統(tǒng)一為如上三個時間。

表5 煎烤3、5、7 min 四種肉品中胺類物質(zhì)的含量Table 5 Amines contents in four types of meat products at grilling for 3,5,and 7 minutes

目前，國內(nèi)未出臺肉制品中AA、NAs 和HAAs的限量標(biāo)準(zhǔn)，但從表5 可見，隨著煎烤時間的延長，每種肉制品中胺類物質(zhì)含量均呈逐漸增加趨勢。因此，在日常的煎烤肉制品過程中，在保證肉成熟的情況下避免煎烤時間過長，避免對人體健康造成危害。

3 結(jié)論

本文通過對色譜柱、流動相、鹽析條件、提取劑、吸附劑等進(jìn)行優(yōu)化，建立了QuEChERS 技術(shù)結(jié)合UHPLC-MS/MS 同時檢測分析肉制品中三種胺類物含量的方法。方法的線性范圍在0.991～0.999之間，檢測限和定量限分別在0.01～1.6 ng/g 和0.03～4.8 ng/g，日內(nèi)平均回收率介于70.2%～110.1%之間。利用該方法測定煎烤肉品中胺類物質(zhì)含量在0.03～31.26 ng/g。該方法實(shí)現(xiàn)了對三種胺成分的同時檢測，改善了傳統(tǒng)方法時間長、復(fù)雜、消耗溶劑量大的不足，能夠?qū)净|(zhì)原料（如豬肉、牛肉等）進(jìn)行有效的胺類成分檢測，適用于快速分析肉制品中的胺類成分。