李配婷，范廣宇，藍(lán)雨絲，劉楠楠,

（1.江蘇海洋大學(xué)，江蘇連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院（連云港），江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室，江蘇連云港 222005；3.連云港海關(guān)，江蘇連云港 222042）

右旋糖酐是由腸膜明串珠菌（）和鏈球菌（）等微生物以蔗糖為底物，在右旋糖酐蔗糖酶的作用下合成的-D-吡喃葡聚糖，主要由-1,6 糖苷鍵構(gòu)成，并含有少量的-1,2、-1,3、-1,4 分支。右旋糖酐的分子量范圍分布廣，從5 kDa 到500 kDa。右旋糖酐因分子質(zhì)量（Mw）和分支度不同有不同的應(yīng)用價值，被廣泛用于醫(yī)藥及化工等行業(yè)，但分子量較大的右旋糖酐是蔗糖行業(yè)的主要污染物，會增加蔗汁的粘度，延長結(jié)晶時間，影響目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，給蔗糖行業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，降解右旋糖酐的方法很多，常見的是酸解法和酶解法，酸解法耗能高、污染大，而酶解法反應(yīng)溫和，反應(yīng)速度快，可以與右旋糖酐發(fā)酵同時進(jìn)行。右旋糖酐酶可專一性地水解右旋糖酐中的-1,6 糖苷鍵，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、口腔等各個行業(yè)。在制糖工業(yè)中，右旋糖酐酶可以水解蔗汁中的右旋糖酐，降低蔗汁的粘度，防止儀器堵塞，加快結(jié)晶效率，增加目標(biāo)產(chǎn)品的回收率和質(zhì)量。右旋糖酐酶在降解右旋糖酐的同時生成的主要產(chǎn)物異麥芽低聚糖，能夠促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌的增殖、抑制有害菌的形成，促進(jìn)腸道的蠕動并且異麥芽低聚糖還具有耐酸耐高溫及良好的持水性等功效，已被成功添加到飼料、保健品、乳制品、餅干小食品及烘焙食品中，發(fā)揮其重要功能。

右旋糖酐酶存在于多種微生物中，不同微生物來源的右旋糖酐酶其酶學(xué)性質(zhì)差距較大，酶活容易受外界因素（如溫度、pH 等）的影響，并且隨著保存及反應(yīng)時間的延長而衰減，游離的右旋糖酐酶保存時間短并且不易與目標(biāo)產(chǎn)品分離，這些因素限制右旋糖酐酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用。近年來，國內(nèi)外學(xué)者聚焦于右旋糖酐酶酶學(xué)性質(zhì)的改善，優(yōu)化產(chǎn)酶條件、通過酶分子的改造構(gòu)建工程菌、誘變技術(shù)誘發(fā)突變體、酶固定化技術(shù)等已被實驗驗證在提高右旋糖酐酶產(chǎn)酶量、酶的耐熱性能、酶的穩(wěn)定性等方面有不同程度的作用。文章將對右旋糖酐酶的結(jié)構(gòu)和分類、右旋糖酐酶產(chǎn)酶菌株的篩選、酶學(xué)性質(zhì)改善技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期右旋糖酐酶能夠更好地應(yīng)用于食品工業(yè)中。

1 右旋糖酐酶的分類和結(jié)構(gòu)

根據(jù)催化反應(yīng)類型，可以將右旋糖酐酶分為內(nèi)切型右旋糖酐酶（endodextranase,EC3.2.1.11）和外切型右旋糖酐酶（exodextranase,EC3.2.1.70）。內(nèi)切型右旋糖酐酶隨機(jī)內(nèi)切水解右旋糖酐的-1,6 糖苷鍵，根據(jù)產(chǎn)酶微生物的來源和底物不同，水解產(chǎn)物各有差別，主要是異麥芽糖、異麥芽三糖、葡萄糖和異麥芽寡糖等的混合物。外切型右旋糖酐酶從右旋糖酐鏈的還原端或非還原端一次切掉1～3 個葡萄糖基，分別可以得到葡萄糖、異麥芽糖和異麥芽三糖。根據(jù)氨基酸序列同源性，右旋糖酐酶被列入GH49和GH66 家族，其主要結(jié)構(gòu)之間存在較大差異：GH49家族的右旋糖酐酶（Aodex）主要有結(jié)構(gòu)域N 和催化結(jié)構(gòu)域C（見圖1A），GH66 家族的右旋糖酐酶（SmDex）主要包括催化結(jié)構(gòu)域A、結(jié)構(gòu)域N 和碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域C（見圖1B）。通過定點突變技術(shù)將AoDex 中的五個氨基酸突變?yōu)楦拾彼?，突變體經(jīng)發(fā)酵表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)Q418、D420、E423、D439 四處的氨基酸經(jīng)突變后，右旋糖酐酶幾乎沒有酶活力，最終確定了這四個氨基酸殘基是右旋糖酐酶（AoDex）催化域中的關(guān)鍵氨基酸。GH66 家族的右旋糖酐酶利用葡聚糖作為底物，通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基化作用從葡聚糖合成低聚環(huán)異麥芽糖。用親和標(biāo)記試劑1-乙基-3-[3-（二甲氨基）-丙基]-碳二亞胺（EDC）和-環(huán)氧烷基-葡糖苷（EAG）修飾酶，發(fā)現(xiàn)若Asp189、Asp340、Glu412 被替換，右旋糖酐酶（SmDex）將失去活性。解析右旋糖酐酶的結(jié)構(gòu)對理解該酶反應(yīng)機(jī)制非常重要。目前右旋糖酐酶蛋白的解析手段有X 射線晶體衍射法、核磁共振及冷凍電鏡等技術(shù)，幾種解析手段各有優(yōu)缺點，在后續(xù)研究中，可以結(jié)合多種手段更精確地解析右旋糖酐酶的結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步認(rèn)識右旋糖酐酶的作用機(jī)制從而提高對功能預(yù)測的準(zhǔn)確度及改造效率。與此同時，隨著蛋白質(zhì)模板的增多、序列搜索技術(shù)和比對工具的優(yōu)化以及片段拼接方法的發(fā)展，人工智能得到飛速發(fā)展，構(gòu)建重組氨基酸序列，合成目標(biāo)右旋糖酐酶，可有效提高酶的改造效率，擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域。

圖1 GH49 家族的右旋糖酐酶AoDex（A）和GH66 家族的右旋糖酐酶SmDex（B）的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of the dextranase AoDex（A）of the GH49 family and the dextranase SmDex（B）of the GH66 family

2 右旋糖酐酶生產(chǎn)菌株

隨著右旋糖酐酶及其水解產(chǎn)物的需求不斷增大，對右旋糖酐酶的開發(fā)也隨之增多。右旋糖酐酶的來源非常豐富，真菌、細(xì)菌、酵母等不同微生物來源的右旋糖酐酶在酶學(xué)性質(zhì)等方面呈現(xiàn)出差異，見表1。對不同來源右旋糖酐酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究主要集中在所產(chǎn)右旋糖酐酶的最大產(chǎn)酶量（即最大酶活）、酶的分子量、右旋糖酐酶的最佳反應(yīng)條件（包括最佳作用溫度和pH）、以及右旋糖酐酶的穩(wěn)定性等。不同右旋糖酐酶的酶活差距較大，其中來自sp.NK458菌株所產(chǎn)右旋糖酐酶的酶產(chǎn)量高達(dá)900 U/mL。右旋糖酐酶的分子量主要分布在40～140 kDa 之間，也有例外，其中，分泌的右旋糖酐酶的分子量為26.5±1.5 kDa，KIBGE-IB25所產(chǎn)的右旋糖酐酶的分子量為158 kDa。酶的最適反應(yīng)溫度集中在40～60 ℃，不同的最適作用溫度有不同的工業(yè)應(yīng)用價值，sp GN02菌株所產(chǎn)右旋糖酐酶的最適反應(yīng)溫度為20 ℃，若用于工業(yè)生產(chǎn)，能大大降低能耗；從澳大利亞大自流盆地的熱水中分離出一種革蘭氏陰性產(chǎn)孢嗜熱厭氧菌產(chǎn)右旋糖酐酶的最適反應(yīng)溫度高達(dá)70 ℃，可用于制糖業(yè)的煮糖工藝中降解右旋糖酐。右旋糖酐酶的最適pH 多集中在4.5～7.0 之間，sp.NK458 適合在堿性環(huán)境中反應(yīng)，最適反應(yīng)pH 為9.0，可以根據(jù)作用環(huán)境的酸堿性選擇滿足需要的右旋糖酐酶。另外，右旋糖酐酶的酶活力隨著反應(yīng)時間的延長而衰減，直至失活，因此右旋糖酐酶的不同環(huán)境下穩(wěn)定性也是專家學(xué)者重點關(guān)注的點，LP621菌株所產(chǎn)的右旋糖酐酶在在80 ℃條件下作用2 h時仍能夠保留58%的相對酶活，適合在高溫環(huán)境下作用。

表1 不同微生物來源的右旋糖酐酶及酶學(xué)性質(zhì)Table 1 Dextranase from different microorganisms and their enzymatic properties

3 右旋糖酐酶酶活及酶學(xué)性質(zhì)改進(jìn)技術(shù)

不同來源的右旋糖酐酶被開發(fā)，探索范圍也從陸地微生物向海洋微生物發(fā)展。但大多數(shù)野生菌株右旋糖酐酶產(chǎn)量普遍不高，酶學(xué)性質(zhì)難以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求，需要有效的技術(shù)來提高右旋糖酐酶的產(chǎn)量和改善酶學(xué)性質(zhì)，減緩酶活下降速度，延長右旋糖酐酶保存時間。目前已報道的技術(shù)有：優(yōu)化產(chǎn)酶條件、通過酶分子改造構(gòu)建工程菌、化學(xué)或物理方法創(chuàng)建突變體、酶固定化技術(shù)等。

3.1 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

影響產(chǎn)酶的因素主要有碳源、氮源、溫度、初始pH、裝瓶量、轉(zhuǎn)速等，產(chǎn)酶條件的優(yōu)化技術(shù)主要是在單因素基礎(chǔ)上，通過有效的實驗工具（如正交化試驗、響應(yīng)面技術(shù)等）確定多變量系統(tǒng)的最優(yōu)條件，提高酶產(chǎn)量，進(jìn)而促進(jìn)工業(yè)化生產(chǎn)。麻少瑩等通過正交實試驗設(shè)計，優(yōu)化并確定最佳發(fā)酵條件，優(yōu)化后，菌株酶活力由原來的79.0 U/mL 提高到231.5 U/mL，酶活力提高了193%。楊齊等通過響應(yīng)面法優(yōu)化腐皮鐮刀菌（）產(chǎn)右旋糖酐酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，右旋糖酐酶活力從98 U/mL 提升至228 U/mL，酶活力提升了1.3 倍；黃瑞杰等利用響應(yīng)面法對圓弧青霉（）產(chǎn)右旋糖酐酶的發(fā)酵培養(yǎng)基的裝瓶量、溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速四個因素進(jìn)行優(yōu)化，右旋糖酐酶的酶活力較優(yōu)化前提高了30.10%±0.08%；曹研研等通過響應(yīng)面優(yōu)化技術(shù)對棘孢青霉菌F1001 產(chǎn)右旋糖酐酶的發(fā)酵條件中的蛋白胨和誘導(dǎo)劑右旋糖酐的添加量以及裝瓶量三個因素進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后右旋糖酐酶的酶活力高達(dá)453 U/mL，比優(yōu)化前提高了88%。

3.2 通過酶分子改造構(gòu)建工程菌

右旋糖酐酶存在于多種微生物中，安全問題和生產(chǎn)率一直是工業(yè)應(yīng)用的制約因素。為了解決這些問題，研究人員專注于構(gòu)建工程菌提高右旋糖酐酶產(chǎn)量，進(jìn)一步改善右旋糖酐酶酶學(xué)性質(zhì)并解析水解產(chǎn)物，以滿足食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)的巨大需求。目前已通過克隆成功表達(dá)的宿主有大腸桿菌（）、畢赤酵母（）、釀酒酵母（）等，通過構(gòu)建工程菌成功提高了重組右旋糖酐酶的酶活并且酶學(xué)性質(zhì)得到了改善：如吳敏等通過克隆棘孢青霉右旋糖酐酶基因并在畢赤酵母中表達(dá)，用甲醇誘導(dǎo)并優(yōu)化培養(yǎng)條件后，重組右旋糖酐酶的酶活力高達(dá)240.74 U/mL；董冬雪等通過截短酶蛋白序列N 端和C 端方式改造海洋氧化節(jié)桿菌KQ11 右旋糖酐酶,結(jié)果N 端和C 端截短后突變酶的最適溫度較野生菌均提高了5 ℃，其中N 端截短的突變酶最適pH 由5.5 變?yōu)?.5，并且小分子量水解產(chǎn)物含量較野生菌顯著提高。

3.3 創(chuàng)建突變體

酶的結(jié)構(gòu)決定酶學(xué)性質(zhì)從而影響其功能，大量的研究通過物理誘變?nèi)缱贤饩€（UV）照射技術(shù)、常壓和室溫等離子體（ARTP）等技術(shù)誘發(fā)突變體，提高產(chǎn)酶量并改善酶學(xué)性質(zhì)。Zohra 等通過用UV 照射地衣芽孢（）獲得的最高產(chǎn)酶突變體產(chǎn)酶量是野生菌株的7 倍。Wang 等通過采用ARTP 技術(shù)誘變KQ11 菌株，突變菌株的酶活比野生菌株高出50%。乙基甲基砜（EMS）是一種廣泛使用的化學(xué)誘變劑，已被廣泛用于微生物物種的改造。Yang 等通過ARTP-EMS 聯(lián)用技術(shù)誘變野生型球毛殼菌（），突變菌株第578 位的氨基酸殘基從His 變?yōu)長eu，這種改變使得酶在70 ℃條件具有更好的熱穩(wěn)定性并且酶的最大產(chǎn)量高達(dá)824.73 U/mL，極大地提高了酶的產(chǎn)量及在高溫下的穩(wěn)定性。

3.4 固定化酶

酶活力隨著時間的延長而逐漸衰減，甚至在不利條件（如溫度和pH）下，酶的活力驟減至失活，并且游離態(tài)的右旋糖酐酶重復(fù)利用率低，而將右旋糖酐酶固定在載體上可以促進(jìn)酶催化劑的回收，增加酶在不利條件下（如溫度和pH）的穩(wěn)定性。目前已成功固定右旋糖酐酶的載體有親水性聚乙烯亞胺（PEI）改性磁性氧化石墨烯（GO）復(fù)合材料（FeO@PDA@GOPEI）載體，羥基磷灰石載體等。固定在FeO@PDA@GO-PEI 載體上的右旋糖酐酶在60 ℃保存10 h 后，仍有80%的相對酶活；固定化的酶酶活下降明顯放緩，重復(fù)使用20 次后，仍留有85.78%的相對酶活。本實驗室篩選并純化的右旋糖酐酶固定在本實驗室自己自備的羥基磷灰石載體上，第30 次使用，固定化的右旋糖酐酶酶水解能力保持在70%以上，并且固定化右旋糖酐酶在20 ℃條件下能夠穩(wěn)定保存99 d 以上，顯著延長了酶的保存期限及提高了右旋糖酐酶的重復(fù)使用效率。

4 右旋糖酐酶的應(yīng)用

4.1 生產(chǎn)低聚糖

根據(jù)以往報道，右旋糖酐酶水解右旋糖酐受底物分子量及右旋糖酐酶濃度影響顯著，產(chǎn)物隨底物分子量及酶濃度不同而發(fā)生改變，主要包括低聚合度的右旋糖酐和異麥芽低聚糖，部分產(chǎn)物里面還有葡萄糖。其中酶解產(chǎn)物異麥芽低聚糖因具有改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)機(jī)體代謝等益生元的功效而受到廣泛的關(guān)注，已被成功添加于飲料、乳制品、烘焙食品及動物飼料中。目前，工業(yè)上生產(chǎn)異麥芽低聚糖的方法主要是淀粉經(jīng)液化、糖化、轉(zhuǎn)苷、分離純化得到，此法操作繁瑣，并且產(chǎn)品中功能性糖分占比較低。研究表明用右旋糖酐蔗糖酶的轉(zhuǎn)糖基或用右旋糖酐酶降解葡聚糖能夠得到各種聚合度的葡聚糖，但由于單一的游離的酶制取低聚糖時，很難控制產(chǎn)物的分子量及生成比例，并且酶的重復(fù)利用率低，導(dǎo)致酶的使用成本高，需要更為有效的方法來實現(xiàn)，以促進(jìn)酶在制取功能性低聚糖方面得到更好的應(yīng)用。右旋糖酐酶和右旋糖酐蔗糖酶共固定化技術(shù)在低聚糖的制備過程中具有協(xié)同作用的優(yōu)勢：如Huang 等建立雙酶和受體反應(yīng)體系，通過調(diào)整右旋糖酐酶和右旋糖酐蔗糖酶的酶活比，控制相應(yīng)分子量（Mw）低聚糖（IMO）的生成比例；Bertrand 等通過將右旋糖酐酶固定在環(huán)氧活化的整體對流相互作用介質(zhì)（CIM?）盤上，發(fā)現(xiàn)固定后的右旋糖酐酶酶促降解速度比游離態(tài)的右旋糖酐酶快5 倍，通過調(diào)整固定化酶的數(shù)量、底物濃度和流速定量生產(chǎn)聚合度為8～10 的低聚異麥芽糖。

4.2 蔗糖行業(yè)的應(yīng)用

在蔗糖行業(yè)中，由于微生物的污染，糖液中右旋糖酐的濃度會升高，形成“蔗飯”。高分子右旋糖酐的積累會增加蔗汁粘度、減慢過濾速度、降低蒸發(fā)速率、拉長晶體形狀，影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，帶來非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。右旋糖酐是白砂糖酸性絮凝物的主要成分，右旋糖酐含量過高的糖產(chǎn)品用于飲料中，飲料容易產(chǎn)生絮凝物渾濁，用于糖果或巧克力制作中，容易引起糖果和巧克力成型困難，糖衣開裂等問題。在制糖過程中，做好車間衛(wèi)生管理，使用殺菌劑等在一定程度上可以減少微生物的污染，從而降低右旋糖酐的生成，但對于已生成的右旋糖酐最好的方法就是用右旋糖酐酶降解右旋糖酐，生成小分子的糖類。目前，美國、澳大利亞、泰國、日本等國家的部分糖廠已經(jīng)在生產(chǎn)中添加成熟的商用右旋糖酐酶制劑來提高澄清、蒸發(fā)速率并且提高煮煉回收率等，使制糖生產(chǎn)過程的操作更加順利，工業(yè)應(yīng)用效果明顯，并產(chǎn)生了一定的經(jīng)濟(jì)效益。國內(nèi)也有右旋糖酐酶用于降解蔗汁中右旋糖酐含量從而在部分指標(biāo)得到改善的相關(guān)研究，如賀湘等通過模擬糖廠實際生產(chǎn)流程進(jìn)行發(fā)現(xiàn)在預(yù)灰前，在混合汁中加入10 mg/kg 葡聚糖酶，經(jīng)一系列流程后，葡聚糖含量減少了61.32%，沉降時間減少了13.30%，簡純度提高了0.65%。劉樂等在蔗汁中添加氧化節(jié)桿菌KQ11 右旋糖酐酶，發(fā)現(xiàn)在超聲功率600 W、pH6.5，溫度為50 ℃條件下，0.1 U/mL甘蔗汁的酶劑量可以在15 min 之內(nèi)清除甘蔗汁內(nèi)83%的右旋糖酐并且將甘蔗汁的粘度降低20%。陸海勤等通過在混合汁中添加了細(xì)麗毛殼球菌發(fā)酵生產(chǎn)的右旋糖酐酶降解右旋糖酐，用常規(guī)的亞硫酸法工藝進(jìn)行澄清處理后，發(fā)現(xiàn)過濾速度和沉降速度均得到了提高，淸汁渾濁度和色值均得到了不同程度的降低，并且還在不同工藝位點添加該右旋糖酐酶，右旋糖酐的含量也有不同程度的減少。但是這些研究所用到的右旋糖酐酶有的是從國外購買，有的酶產(chǎn)量不高，離制備成商業(yè)制劑用于工業(yè)生產(chǎn)中還有一定的距離，從國外購買的商業(yè)酶制劑價格昂貴，導(dǎo)致右旋糖酐酶在國內(nèi)糖廠的應(yīng)用暫時沒有得到普及。專家學(xué)者們致力于篩選出產(chǎn)右旋糖酐酶的菌株并運用相關(guān)技術(shù)提高酶活性，改善其在高溫條件下的穩(wěn)定性，為大規(guī)模生產(chǎn)用于制糖工業(yè)的右旋糖酐酶酶制劑打下基礎(chǔ)，如李衛(wèi)娟篩選到一株海洋細(xì)菌KQ11，其在優(yōu)化條件下產(chǎn)右旋糖酐酶的酶活力為4.697 U/mL；顧莉莉通過重組球毛殼菌右旋糖酐酶基因，并在畢赤酵母中異源表達(dá)，重組的右旋糖酐酶酶活力由初始的2.692 U/mL 提高至47.915 U/mL，純化后的酶最適作用溫度高達(dá)60 ℃；黃曾慰等利用重組黃青霉（）右旋糖酐酶基因在畢赤酵母（）中表達(dá)后經(jīng)發(fā)酵罐發(fā)酵，酶活達(dá)到1218 U/mL，雖與商業(yè)酶制劑的30000 U/mL有一定差距，但產(chǎn)酶水平已取得了突破性進(jìn)展，具有大規(guī)模生產(chǎn)的潛力。

5 總結(jié)與展望

右旋糖酐酶及其水解產(chǎn)物的應(yīng)用引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，不同微生物來源的右旋糖酐酶已被成功純化并且通過優(yōu)化產(chǎn)酶條件、改造酶分子構(gòu)建工程菌（克隆技術(shù)）、酶固定化等技術(shù)不同程度地改善了酶活、酶的耐熱性能及酶的穩(wěn)定性等，總結(jié)改進(jìn)方法，發(fā)現(xiàn)固定化技術(shù)及克隆技術(shù)更有應(yīng)用前景，并且部分純化的右旋糖酐酶已通過固定化技術(shù)作為商業(yè)酶制劑被添加于漱口水、牙膏等產(chǎn)品中。但由于固定化技術(shù)和克隆技術(shù)還處于發(fā)展階段，國內(nèi)右旋糖酐酶在制糖行業(yè)的應(yīng)用大多處于實驗室階段，制糖行業(yè)所用右旋糖酐酶酶制劑大多從國外購入，使用成本較高，導(dǎo)致右旋糖酐酶在制糖工業(yè)中的應(yīng)用沒有得到普及，隨著固定化技術(shù)和基因工程技術(shù)發(fā)展的逐漸成熟，右旋糖酐酶在制糖工業(yè)中將會得到更為廣泛的應(yīng)用。