王書君，譚慧瓊，袁 杰

(1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院老年醫(yī)學科，海南 ?？?570102；2.中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院心血管內科，北京 100037；3.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院心內科，新疆 烏魯木齊 830001)

急性心肌梗死是全球范圍內常見的心血管疾病，及時開通梗死相關動脈，恢復缺血心肌的供血，是挽救垂死心肌及防止梗死范圍再次擴大的關鍵。但有研究發(fā)現，心肌缺血一段時間后恢復血流灌注會加重心肌結構和功能的損傷，導致心功能下降和惡性心律失常，這一過程稱為心肌缺血再灌注(myocardial ischemia-reperfusion，MI/R)損傷[1-2]。目前，MI/R損傷仍是治療心肌缺血所面臨的主要難題。因此，如何在早期恢復冠脈血流的基礎上減少甚至消除MI/R損傷的發(fā)生具有重要的臨床意義。

熱休克蛋白A12B(heat shock protein A12B，HSPA12B)于2003年從動脈粥樣硬化病變中克隆出來，歸類為熱休克蛋白70(HSP70)家族的一員，包含非典型的ATPase結構域[3]。與HSP70家族其他成員的普遍性表達不同，HSPA12B在內皮細胞中特異性表達，能夠抵御多種有害因素。已有研究表明，HSPA12B能夠在心肌梗死和腦缺血后發(fā)揮對組織器官的保護作用[4-5]，還能夠改善膿毒癥引起的心臟功能障礙[6]，但相關的作用機制尚未明確。

為進一步確定HSPA12B在MI/R損傷中的具體作用及機制，本研究通過構建MI/R大鼠模型并給予含HSPA12B的慢病毒液預先處理，觀察HSPA12B對MI/R心肌組織損傷及心肌組織內環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)表達的影響，并檢測線粒體自噬途徑的變化情況，旨在揭示HSPA12B調控MI/R損傷的作用機制，為MI/R損傷的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康SD大鼠，雄性，4周齡，體質量(200±20)g，購自海南藥物研究所有限責任公司，飼養(yǎng)于無特定病原體屏障環(huán)境中，溫度(23±2)℃，相對濕度(50±5)%，12 h/12 h明暗周期交替，實驗期間自由飲水、攝食。本實驗獲得中國科學院阜外醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(K20211021208)。

1.2 主要試劑

空白慢病毒載體pLVX-NC和含HSPA12B慢病毒載體pLVX-HSPA12B的合成和包裝均由上海吉瑪制藥技術有限公司完成。血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK-MB)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)特異性ELISA試劑盒購自上?；鄯f生物公司，HE染色試劑盒購自北京索萊寶生物公司，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翌圣生物公司，免疫組織化學染色試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，DAB顯色液、RIPA裂解液、考馬斯亮藍試劑盒和ECL發(fā)光試劑液購自上海碧云天生物研究所，兔抗人COX-2多克隆、兔抗人微管相關蛋白1輕鏈3β(microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta，LC3β)多克隆、兔抗人Parkin多克隆、兔抗人PINK1多克隆及兔抗鼠GAPDH多克隆等抗體均購自英國Abcam公司。其他試劑均為國產分析純。

1.3 分組與處理

將40只SD大鼠按照隨機數字表法分為4組，每組10只。假手術組大鼠僅暴露心臟，不進行MI/R處理；模型組大鼠心肌內注射0.9%氯化鈉注射液20 μL，7 d后構建MI/R模型；pLVX-NC組大鼠心肌內注射20 μL pLVX-NC慢病毒液，7 d后構建MI/R模型；pLVX-HSPA12B組大鼠心肌內注射20 μL pLVX-HSPA12B慢病毒液，7 d后構建MI/R模型。注射操作如下：將大鼠消毒后麻醉，仰臥位固定，氣管插管并連接動物呼吸器進行機械通氣；在大鼠左胸第4和第5肋骨之間剪開皮膚，使心臟完全暴露，采用微量注射器分4點在各組大鼠心肌中注射相應液體，留置注射針2 min，閉合胸腔，肌內注射1.5 mL/kg硫酸慶大霉素抗感染，每日1次，持續(xù)3 d。

1.4 動物造模

參考文獻[7]方法構建MI/R大鼠模型。將大鼠消毒后，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，然后固定在動物實驗臺上，氣管插管并連接動物呼吸器進行機械通氣。在大鼠左胸第4和第5肋骨間剪開皮膚，使心臟完全暴露，用絲線在冠狀動脈左前降支下約2 mm處進行結扎，以阻塞左冠狀動脈前降支，心電圖觀察ST段抬高0.1 mV左右，持續(xù)結扎40 min進行缺血處理，之后釋放結扎絲線，再灌注120 min，待ST段下降到缺血時的0.05 mV，即成功構建大鼠MI/R模型。隨后立即閉合胸腔，縫合切口，消毒，肌內注射1.5 mL/kg硫酸慶大霉素抗感染，每日1次，持續(xù)3 d。

1.5 ELISA檢測心肌損傷指標

處理結束后，各組大鼠經尾靜脈采血2 mL，室溫靜置2 h，4 ℃低溫以4 000 r/min離心20 min，制備血清。將樣品加入各反應孔，使用大鼠特異性ELISA試劑盒測定各組大鼠血清CK-MB和LDH含量。

1.6 HE染色觀察心肌組織病理學改變

采血后處死各組大鼠，無菌環(huán)境下解剖取各組大鼠心肌組織，清洗干凈，在4%多聚甲醛中固定，然后經梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，制備厚度約為5 μm的切片。將切片脫蠟水化，蘇木素染色10 min，流水沖洗多余染液，1%酒精—鹽酸分化，水洗，反藍，伊紅染色1 min，再次經梯度酒精脫水，二甲苯透明，隨后中性樹膠封固，光學顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織病理學變化，并攝取圖片。

1.7 TUNEL染色檢測細胞凋亡情況

取制備的各組大鼠心肌組織切片，以梯度酒精脫水，二甲苯透明，PBS清洗，加入20 μg蛋白酶K溶液，室溫水解15 min，蒸餾水清洗；加入含2%過氧化氫的PBS，室溫反應5 min，PBS清洗，棄掉組織周圍多余染液，滴加TdT試劑液，置于濕盒中37 ℃孵育60 min；終止反應后，PBS清洗，使用新鮮配制的DAB溶液室溫顯色5 min，脫水透明，隨后中性樹膠封固，光學顯微鏡下隨機選擇5個200倍鏡視野進行觀察。陽性細胞呈褐色，計數視野下200個細胞與其中的陽性細胞數，計算各組大鼠心肌組織內TUNEL染色陽性細胞率。

1.8 免疫組織化學染色檢測心肌組織中COX-2、LC3β表達

各組大鼠心肌組織切片以二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，檸檬酸鈉修復抗原，0.3%過氧化氫液室溫孵育10 min，PBS浸泡清洗，再以10%山羊血清進行封閉。結束后，分別滴加兔抗人COX-2(1∶100)、LC3β(1∶200)多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日，棄掉原液，PBS清洗，滴加對應的二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h后采用DAB溶液室溫顯色，沖洗干凈，隨后蘇木精復染，脫水透明，中性樹膠封固，光學顯微鏡觀察組織內著色情況。陽性染色為胞質或胞核呈棕色至深褐色，隨機選擇5個視野，利用Image J軟件進行分析，計算各組大鼠心肌組織內COX-2、LC3β陽性表達率。

1.9 Western blot檢測相關蛋白的表達

將各組大鼠心肌組織在無菌環(huán)境下剪碎，加入液氮研磨，添加適量RIPA裂解液，置于冰上裂解，以提取組織總蛋白，考馬斯亮藍法測定。取各組蛋白樣品，98 ℃水浴加熱，并制備10%SDS-PAGE，取等量的蛋白樣品進行上樣后，經電泳分離蛋白，80 V恒壓電泳20 min，110 V再電泳60 min，恒壓100 V處理90 min，將分離的蛋白轉至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應一抗工作液，4 ℃孵育過夜。次日，棄掉原液，TBST洗膜后加入相應的二抗，室溫孵育2 h，TBST再次洗膜，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，以GAPDH作為內參蛋白，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Parkin及PINK1蛋白的相對表達水平。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠血清心肌損傷標志物水平

與假手術組比較，模型組大鼠血清CK-MB和LDH的含量均明顯升高(P<0.05)；與模型組和pLVX-NC組比較，pLVX-HSPA12B組大鼠血清CK-MB和LDH的含量均明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清心肌損傷指標水平比較

2.2 各組大鼠心肌組織病理變化

假手術組大鼠心肌組織結構正常，組織內細胞排列較為整齊，心肌纖維緊密，無明顯的腫脹及紊亂現象；模型組和pLVX-NC組大鼠心肌纖維腫脹變大，出現斷裂，并伴大量炎性細胞浸潤；與模型組和pLVX-NC組比較，pLVX-HSPA12B組大鼠心肌組織病理損傷現象得到緩解，心肌纖維斷裂現象減少，心肌細胞排列較為整齊(圖1)。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學形態(tài)(HE染色×100)

2.3 各組大鼠心肌組織細胞凋亡情況

TUNEL染色結果顯示，模型組大鼠心肌組織內TUNEL陽性細胞率較假手術組明顯升高(P<0.05)，表明凋亡細胞增加；pLVX-HSPA12B組大鼠心肌組織內TUNEL陽性細胞率較模型組和pLVX-NC組明顯下降(P<0.05)，表明凋亡細胞減少(圖2)。

a：TUNEL染色(×200)；b：TUNEL染色陽性細胞率 *：與假手術組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與pLVX-NC組比較，P<0.05

2.4 各組大鼠心肌組織COX-2表達

與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織內染色加深，COX-2陽性表達率明顯升高(P<0.05)；與模型組和pLVX-NC組比較，pLVX-HSPA12B組大鼠心肌組織內染色明顯變淺，COX-2陽性表達率明顯降低(P<0.05)，見圖3。

a：免疫組織化學染色(×100)；b：COX-2陽性表達率 *：與假手術組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與pLVX-NC組比較，P<0.05

2.5 各組大鼠心肌細胞線粒體自噬水平

與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織內染色較少，且顏色變淺，LC3β陽性表達率明顯下降(P<0.05)；而相較于模型組和pLVX-NC組，pLVX-HSPA12B組大鼠心肌組織內染色加深，LC3β陽性表達率明顯上升(P<0.05)，見圖4。

a：免疫組織化學染色(×100)；b：LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值；c:Parkin蛋白相對表達；d：PINK1蛋白相對表達 *：與假手術組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與pLVX-NC組比較，P<0.05

2.6 各組大鼠心肌組織自噬相關蛋白表達

與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織內LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降(P<0.05)，Parkin、PINK1蛋白的表達水平明顯下調(P<0.05)；與模型組和pLVX-NC組比較，pLVX-HSPA12B組大鼠心肌組織內LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上升(P<0.05)，Parkin、PINK1蛋白的表達水平明顯上調(P<0.05)，見圖5。

a：各蛋白條帶；b：LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值；c:Parkin蛋白相對表達水平；d:PINK1蛋白相對表達水平 *：與假手術組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與pLVX-NC組比較，P<0.05

3 討論

MI/R誘導的心肌細胞死亡是導致冠心病患者死亡的主要病理因素之一。MI/R會引發(fā)一系列復雜的炎癥反應及嚴重的組織損傷和心律失常，阻止心臟收縮功能恢復，并導致缺血組織中細胞死亡[2,8]。目前，MI/R引發(fā)的一系列復雜性損傷已成為全球范圍內致殘和致死的主要因素，也是心血管疾病患者死亡的主要原因[9]。而且沒有切實可行的解決方案能夠徹底避免MI/R損傷，迫切需要制定出針對治療MI/R損傷的新策略。因此，本研究通過使用含HSPA12B的慢病毒液預先處理大鼠后構建MI/R模型，了解其對MI/R損傷的潛在作用機制，以期為MI/R的治療策略提供參考。

HSPA12B作為內皮細胞中特異性表達的熱休克蛋白，參與內皮細胞的增殖和遷移，能夠促進血管生成，現已證明HSPA12B在一些疾病中發(fā)揮重要的治療作用。Zhao等[10]研究表明，HSPA12B過表達可通過eNOS依賴性機制促進缺血性中風慢性期小鼠的神經功能恢復并提高其存活率；Zhang等[6]研究發(fā)現，HSPA12B可通過調節(jié)靶向黏附分子的miR-126表達來預防敗血癥誘導的嚴重心肌病，從而減少心肌中免疫細胞的積累；Thirunavukkarasu等[11]的研究指出，HSPA12B基因療法可以改善后肢缺血小鼠的運動功能，促進新生血管形成，并減少組織纖維化。本研究結果顯示，與模型組和pLVX-NC組比較，在經HSPA12B預處理的MI/R大鼠模型中，血清中損傷標志物CK-MB和LDH的含量均下降，心肌組織損傷現象明顯減輕，進一步說明了HSPA12B對MI/R損傷具有良好的緩解作用。

COX是前列腺素生物合成的限速酶，其有COX-1和COX-2兩種異構體。COX-1在許多組織中表達，主要在組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用；相比之下，COX-2作為一種誘導性酶，是各種炎癥過程的中心環(huán)節(jié)，負責在炎癥和傷口愈合部位產生前列腺素[12]。COX-2在炎癥血管中表達上調，并在動脈粥樣硬化、動脈瘤和動脈球囊損傷中對病程發(fā)展起到促進作用[13]。另外，Yin等[14]通過將主動脈血管內皮細胞暴露在PM2.5環(huán)境中后發(fā)現，COX-2的表達水平明顯上調，而在暴露于PM2.5環(huán)境前用特定COX-2抑制劑處理血管內皮細胞后，不僅完全阻止了細胞凋亡，而且還減輕了炎癥反應。越來越多的研究表明，COX-2與心肌梗死疾病的進展有關，Abbate等[15]研究表明，COX-2在心肌梗死患者的心肌細胞中高表達，并與細胞凋亡呈正相關；賈丹等[16]指出，抑制COX-2活性能夠降低體外缺氧/復氧實驗模擬的MI/R中促炎因子的轉錄，并對H9C2心肌細胞具有保護作用。鑒于此，本研究通過檢測各組MI/R大鼠心肌組織內COX-2表達發(fā)現，與模型組和pLVX-NC組比較，經HSPA12B預處理的MI/R大鼠心肌組織內COX-2陽性表達率明顯降低。由此推測，HSPA12B可能通過介導COX-2在MI/R損傷中發(fā)揮作用。

終末分化心肌細胞的死亡是各種心臟疾病發(fā)生的主要原因，包括心力衰竭、心肌梗死及MI/R損傷。在心臟病發(fā)病過程中，細胞凋亡和壞死都能夠導致心肌細胞死亡，而心肌細胞死亡是MI/R損傷中心臟功能衰竭的核心特征[17]。心肌細胞死亡是不可逆的，并伴細胞膜電位的快速喪失，從而導致細胞腫脹、破裂、溶解及后續(xù)炎癥的發(fā)生。線粒體自噬指細胞降解自身線粒體的過程，該途徑可以清除MI/R損傷下心臟中功能失調的線粒體，以減輕病理損傷[18]。研究表明，心肌細胞中線粒體自噬的機制是由胞質E3泛素連接酶Parkin和線粒體膜激酶PTEN誘導的推定激酶PINK1介導，PINK1在線粒體中選擇性穩(wěn)定，其內膜上的電位降低，并將Parkin募集到線粒體以激活其E3泛素連接酶活性，導致線粒體自噬并通過自噬機制去除受損的線粒體[19]。此外，Parkin非依賴性線粒體自噬途徑由Bcl-2、BNIP3或BNIP3L介導，這些受體激活后可直接與LC3β結合，促進缺氧條件下的線粒體自噬發(fā)生。本研究經檢測發(fā)現，與模型組和pLVX-NC組比較，經HSPA12B預處理的MI/R大鼠模型心肌組織內LC3β陽性表達率上升，Parkin、PINK1蛋白的表達水平明顯上調，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也升高。由此推測，HSPA12B作用下增加了MI/R大鼠心肌細胞線粒體自噬，從而發(fā)揮對心臟組織的保護作用。

綜上，大鼠MI/R損傷會導致COX-2表達升高，線粒體自噬功能降低，心肌組織損傷，而HSPA12B能夠抑制COX-2表達，并增加線粒體自噬，從而逆轉MI/R損傷。本研究從線粒體自噬入手，為探究以HSPA12B為靶點改善MI/R損傷提供了實驗依據。