范曉陽，賈世艷，司瑞花，鄭博文，劉光珍?

（1.山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原 030012；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619）

穿山龍是薯蕷植物穿龍薯蕷的干燥根莖［1］，味甘、苦，性溫，歸肺、腎和肝經(jīng)。穿山龍中主要活性成分是甾體皂苷類化合物，主要包括纖細薯蕷皂苷、薯蕷皂苷等，此外還有黃酮類和菲醌類化合物，目前已經(jīng)從穿山龍中分離出20多種化合物［2-3］，如薯蕷皂苷、苯甲酸等。穿山龍總皂苷具有保肝、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、降尿酸、抗腫瘤和腎病治療作用等多種生物學(xué)活性［4-9］，且目前已被用作合成治療冠心病的甾體激素和皂苷類藥物的重要工業(yè)原料［10］。目前的研究表明，穿山龍是抗氧化化合物的良好來源。顯示出最高活性的組分可進一步分離出用于治療相關(guān)疾病的新型、經(jīng)濟有效和更安全的活性化合物。

本實驗以穿山龍為材料，對超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度、提取時間、提取溫度、超聲時間為自變量，以總皂苷的提取率為指標，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到穿山龍總皂苷的超聲提取最佳工藝。同時采用非極性的AB-8 大孔吸附樹脂對穿龍山總皂苷進行純化，最后考察了總皂苷純化前后的體外抗氧化活性，為穿山龍的進一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

穿山龍飲片（山西省中醫(yī)藥研究院提供，經(jīng)劉光珍教授鑒定為正品）；薯蕷皂苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：20210526，純度：≥98%）。

高氯酸（分析純，批號：06127635412，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司）；冰醋酸（分析純，批號：20196745198，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司）、香草醛（分析純，批號：06712987156，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司）；維生素C（VC）溶液（批號：060721210618，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

754 型紫外可見分光光度計（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；DACW-4恒溫水浴鍋（廣州中興實驗儀器有限公司）；FW-100 萬能粉碎機（上海比朗儀器制造）；GZX-ME-Ⅱ電熱恒溫干燥箱（上海發(fā)展醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 穿山龍總皂苷的提取工藝流程

穿山龍總皂苷先經(jīng)過粉碎、過篩（40 目），再進行石油醚回流脫脂，干燥備用。脫脂后的穿山龍粉末先經(jīng)過超聲輔助提取，后再進行乙醇回流提取，濃縮液干燥，得到穿山龍總皂苷粗品［11-12］。

1.3.2 總皂苷的含量測定

1.3.2.1 標準溶液的配制

精密稱定薯蕷皂苷對照品4.00 mg，加甲醇溶解定容至25 mL 容量瓶中，超聲15 min，即得濃度為0.16 mg/mL的薯蕷皂苷標準溶液，備用。

1.3.2.2 標準曲線的繪制

取上述配制好的標準溶液，分別精確吸取0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、2.00 mL 于磨口具塞試管中，70 ℃水浴蒸發(fā)溶劑，依次加入新配制的5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，70 ℃水浴充分反應(yīng)20 min，取出，冰水冷卻5 min，加冰醋酸至10 mL，搖勻，靜置20 min，在波長370 nm 處測吸光度值。以薯蕷皂苷的標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為：

Y=23.731X-0.273 3，R2=0.997 6，Y 為吸光度，X 為薯蕷皂苷濃度（mg/mL），線性范圍為0.016～0.320 mg/mL。

1.3.2.3 穿山龍總皂苷的含量測定

取上述提取的總皂苷粗品，用甲醇溶解，配制成濃度為0.16 mg/mL的溶液，吸取1 mL樣品溶液于具塞試管中，用甲醇做對照，根據(jù)“1.3.2.2”項下標準曲線繪制的方法測定吸光度。依據(jù)標準曲線計算出總皂苷濃度，并根據(jù)公式（1）計算出樣品總皂苷的含量［13］。

其中，d為稀釋倍數(shù)，C為根據(jù)標準曲線計算溶液中總皂苷的質(zhì)量濃度（mg/mL），M為稱取的樣品質(zhì)量（mg），V為定容體積（mL）。

1.3.3 穿山龍總皂苷的提取工藝優(yōu)化

1.3.3.1 單因素實驗

取上述預(yù)處理過的穿山龍粉末1.0 g，固定超聲功率800 W，選取乙醇濃度、提取時間、提取溫度、超聲時間4 個因素，改變其中1 項因素，其他因素不變進行單因素實驗。各單因素變量分別是乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%）、提取時間（40、60、80、100、120 min）、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）和超聲時間（10、15、20、25、30 min），提取次數(shù)均為3次。

1.3.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）和超聲時間（D）為考察因素，以總皂苷提取得率為指標，采用響應(yīng)面法，用Design Expert 8.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，進而優(yōu)化穿山龍總皂苷的提取工藝。

1.3.4 穿山龍總皂苷的純化

根據(jù)上述實驗所篩選出的最優(yōu)條件進行提取，將提取到的總皂苷采用正丁醇萃取，正丁醇層減壓過濾濃縮得浸膏，利用非極性的AB-8 大孔吸附樹脂作為吸附介質(zhì)進行純化，總皂苷用水溶解后，上樣，依次用水、70%乙醇洗脫大孔吸附樹脂，收集70%乙醇洗脫液，濃縮，冷凍干燥［14］。

1.3.5 體外抗氧化活性研究

1.3.5.1 DPPH自由基清除實驗

參考文獻［15］中的方法，測定樣品清除DPPH 自由基的能力。首先制備DPPH 溶液，將24 mg 的DPPH溶解在100 mL 的甲醇中。將純化前后的總皂苷分別用甲醇配制成濃度為1、2、3、4、5 mg/mL 的待測液。分別取3 mL 上述各濃度的總皂苷溶液置于不同試管中，再向每只試管中加入0.1 mol/L 的DPPH 溶液3 mL，充分混合后，放置25 min。以無水乙醇作對照，在波長為515 nm 的條件下測得吸光度A測定；以無水乙醇替代3 mL 總皂苷溶液，測量后得吸光度A空白；于試管中充分混合相同體積不同濃度的上述總皂苷溶液與無水乙醇，擱置30 min，以VC 溶液為陽性對照，測得吸光度A對照，計算DPPH清除率。

1.3.5.2 ABTS自由基清除實驗

參考文獻［16］中的方法，用ABTS 評價總皂苷純化前后的抗氧化能力。該檢測方法是基于抗氧化劑清除ABTS 自由基陽離子的能力，導(dǎo)致溶液在405 nm 處的吸光度降低。將7 mmol/L ABTS 自由基溶液與2.45 mmol/L K2S2O8溶液混合，將混合液在室溫下于黑暗中放置12 h，得到含有ABTS自由基陽離子的深色溶液。將得到的ABTS工作液用水稀釋至在405 nm 波長下測得吸光度為0.7 的濃度。將純化前后的總皂苷配制成濃度為1、2、3、4、5 mg/mL的待測液。取0.1 mL樣品溶液與1.9 mL ABTS 工作液混合，常溫避光放置6 min，在波長405 nm 處測定吸光度A測定；用甲醇為空白，測定吸光度A空白；于試管中充分混合相同體積不同濃度的上述總皂苷溶液與無水乙醇，用雙光束分光光度計測定溶液的吸光度，測定時間為6 min。以VC 溶液為陽性對照，測得吸光度A對照，計算ABTS清除率。

2 實驗結(jié)果

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對穿山龍總皂苷得率的影響

在提取時間60 min、超聲時間15 min、提取溫度60 ℃條件下，分別考察乙醇濃度為20%、40%、60%、80%、100%時對總皂苷含量的影響，結(jié)果如圖1A所示。在乙醇濃度為80%時，總皂苷的含量達到最大，因此選擇60%、80%、100%濃度的乙醇作為響應(yīng)面設(shè)計的3個水平。

2.1.2 提取時間對穿山龍總皂苷得率的影響

在乙醇濃度80%、超聲時間15 min、提取溫度60 ℃條件下，分別考察提取時間為40、60、80、100、120 min時對總皂苷含量的影響，結(jié)果如圖1B所示。在提取時間為100 min 時，總皂苷的含量達到最大，因此選擇80、100、120 min的提取時間作為響應(yīng)面設(shè)計的3個水平。

2.1.3 提取溫度對穿山龍總皂苷得率的影響

在乙醇濃度80%、超聲時間15 min、提取時間100 min 條件下，分別考察提取溫度為40、50、60、70、80 ℃時對總皂苷含量的影響，結(jié)果如圖1C所示。在提取溫度為70 ℃時，總皂苷的含量達到最大，因此選擇60、70、80 ℃的提取溫度作為響應(yīng)面設(shè)計的3個水平。

2.1.4 超聲時間對穿山龍總皂苷得率的影響

在乙醇濃度80%、提取時間100 min、提取溫度70 ℃條件下，分別考察超聲時間為10、15、20、25、30 min時對總皂苷含量的影響，結(jié)果如圖1D所示。在超聲時間為25 min時，總皂苷含量達到最大，因此選擇20、25、30 min的超聲時間作為響應(yīng)面設(shè)計的3個水平。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化穿山龍總皂苷的提取工藝

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用Design Expert 8.0 軟件進行實驗設(shè)計，得出在上述4 個條件下所提取的總皂苷得率，通過軟件分析得出最優(yōu)提取工藝條件。見表1、表2。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果

用實驗得到的以薯蕷皂苷標示的總皂苷含量值計算二階多項式的系數(shù)、回歸系數(shù)和P值，以總皂苷的含量為響應(yīng)值（Y），得到總皂苷含量對各影響因素的二次多項式回歸模型。

Y=16.22+0.63×A+0.42×B+0.13×C+0.65×D+0.28×AB-0.23×AC-0.042×AD+0.072×BC-0.22×BD+0.15×CD-3.63×A2-1.45×B2-0.88×C2-1.48×D2

通過方差分析表可以看出，模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1），失擬項差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.132 4 ＞0.05），說明回歸方程的可靠性及顯著性較好。擬合模型R2=0.937 8，預(yù)測模型R2Adj=0.875 7，變異系數(shù)CV=5.37%，說明實驗中所得的結(jié)果與響應(yīng)面軟件預(yù)測值較為接近，實驗所得結(jié)果誤差較小，由此可知該方法擬合度良好，表明用可以該方法來對總皂苷的得率結(jié)果進行預(yù)測和分析，同時也說明了該實驗的穩(wěn)定性較好，見表3。兩兩因素交互作用見圖2?？梢姡饕蛩貙Υ┥烬埧傇碥盏寐实挠绊憺槌晻r間（D）＞乙醇濃度（A）＞提取時間（B）＞提取溫度（C）。

表3 回歸方程的方差分析

利用Design-Expert 8.0 軟件求出回歸模型的最大值，即超聲波輔助提取穿山龍總皂苷的最優(yōu)條件為：乙醇濃度80%、提取時間80 min、提取溫度80 ℃、超聲時間25 min，在此提取條件下，穿山龍總皂苷的含量為16.24%，RSD值為2.92%。見表4。

表4 最佳提取工藝的驗證實驗

2.3 穿山龍總皂苷的純化

將根據(jù)上述最優(yōu)條件提取到的總皂苷進行正丁醇萃取，正丁醇層減壓過濾濃縮得浸膏，利用非極性的AB-8 大孔吸附樹脂作為吸附介質(zhì)進行純化，總皂苷用水溶解后，上樣，依次用水、70%乙醇洗脫大孔吸附樹脂，收集70%乙醇洗脫液，濃縮，冷凍干燥。測定純化后總皂苷的含量，重復(fù)測量3 次，純化后的總皂苷平均含量為50.49%，RSD值2.42%。

2.4 體外抗氧化活性研究

2.4.1 DPPH 自由基清除能力

在相同濃度下，VC 的DPPH 自由基清除能力遠大于純化和未純化的總皂苷，純化的總皂苷大于未純化的總皂苷。未純化的總皂苷、純化后的總皂苷IC50值分別為4.9、3.8 mg/mL。見圖3A。

2.4.2 ABTS自由基清除能力

在相同濃度下，VC 的ABTS 自由基清除能力遠大于純化和未純化的總皂苷，純化的總皂苷大于未純化的總皂苷。未純化的總皂苷、純化后的總皂苷IC50值分別為2.8、2.2 mg/mL。見圖3B。

3 討論

隨著對穿山龍研究的深入，穿山龍總皂苷的最佳提取方法及其眾多的藥理作用受到越來越多的關(guān)注［17-19］。本研究中，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，以獲得最大的總皂苷提取率，研究結(jié)果表明乙醇濃度、提取溫度、超聲時間和提取時間對穿山龍總皂苷的提取率有較大的影響。

乙醇濃度對總皂苷的提取率影響最大，當乙醇濃度從20%增加到80%時，總皂苷的得率逐步上升，當乙醇濃度為80%時，得率達到最高值，根據(jù)相似相溶理論，當溶劑與溶質(zhì)的極性相似時，皂苷更容易從細胞中溶解［20］。提取時間對總皂苷得率也有影響，提取時間在20～100 min 時，總皂苷的得率呈上升趨勢，提取速度變緩，當提取時間增加到100 min 時，總皂苷的得率變化不明顯，可能原因是隨著提取時間的增加，穿山龍中更多的蛋白質(zhì)和多糖溶解在溶劑中，阻礙了皂苷的溶解［21］，因此，為了提高提取效率和節(jié)約能源，選擇提取時間為100 min。在研究提取溫度對總皂苷得率的影響時發(fā)現(xiàn)，隨著溫度上升，總皂苷得率增加，可能原因是高溫使皂苷分子運動加快，有利于穿山龍總皂苷的溶出［22］，高溫還可以使皂苷在溶劑中的溶解度增加［23］，導(dǎo)致得率增加，除此之外，還可能是由于超聲時已經(jīng)破裂的細胞組織在回流提取中通過熱量從基質(zhì)中釋放皂苷［24］，當溫度增加到70 ℃時，總皂苷的得率略有下降，可能是因為溫度升高，導(dǎo)致某些有效成分的分解或促進了皂苷氧化等副反應(yīng)，使總皂苷得率下降。超聲時間也會影響總皂苷的得率，由于超聲通過乙醇溶劑的振幅較大，產(chǎn)率也會增加，可能是因為超聲時間越長，穿山龍粉末的分子間振動就越劇烈，另一方面是由于超聲波刺激了植物細胞壁的破裂，并通過微射流和聲流促進沖洗細胞內(nèi)容物［25］，因此提取率升高，故結(jié)合工藝的成本，選擇最佳的超聲時間為25 min，隨著超聲時間的增加，得率下降，可能原因是超聲增加空化過程中溶劑中的氣泡數(shù)，從而降低超聲能量傳遞到介質(zhì)中的效率［26］，降低了總皂苷得率。

最新研究發(fā)現(xiàn)，有多種中藥植物中含有抗氧化能力很強的化學(xué)物質(zhì)，可以作為合成抗氧化劑的替代品［27］。國外研究報道，各種藥用植物，同種植物的不同部分都有一定的抗氧化性，其中皂苷、黃酮、多糖、酚類化合物都有一定的抗氧化性［28］。在本次抗氧化作用實驗研究中，總皂苷純化前后都可以使自由基脫色，采用DPPH、ABTS清除試劑測定其抗氧化性，穿山龍總皂苷純化后的抗氧化性大于未純化的抗氧化性，然而二者的差別不大，說明總皂苷在進行純化時，棄掉了一部分酚類或者其他的化合物，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的發(fā)生。

4 結(jié)論

本文以穿山龍總皂苷為研究對象，采用單因素與響應(yīng)面相結(jié)合的方式對超聲波輔助提取穿山龍總皂苷的工藝進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，響應(yīng)面分析的二次模型擬合程度較高，影響總皂苷得率的因素主次順序是超聲時間（D）＞乙醇濃度（A）＞提取時間（B）＞提取溫度（C）；提取的最佳工藝為：乙醇濃度80%、提取時間80 min、提取溫度80 ℃、超聲時間25 min，在此條件下，總皂苷的含量為16.24%，實驗數(shù)據(jù)穩(wěn)定?？傇碥战?jīng)過AB-8 大孔吸附樹脂進行純化，純化后的總皂苷含量為50.49%。

本研究分別采用DPPH、ABTS 自由基清除兩種體外抗氧化實驗對總皂苷純化前后的抗氧化活性進行評價。實驗結(jié)果表明，穿山龍總皂苷純化前后對DPPH和ABTS 自由基都有一定的清除能力，但清除能力都較VC 弱；總皂苷純化后比未純化的總皂苷體外抗氧化能力增強；其抗氧化活性隨質(zhì)量濃度的增大呈上升趨勢，穿山龍總皂苷具有抑制自由基生成的作用。