郭子晨, 陳紅利, 戴雪伶, 霍清, 白海燕, 張靜, 劉倩

（北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院, 北京 100023）

0 引言

益生菌是一類對宿主有益的活性微生物的總稱,當機體攝入足夠量的益生菌時, 這些益生菌可以通過抑制致病菌生長、增殖有益菌、調(diào)節(jié)腸道pH值、維持腸道黏膜屏障完整性等方式來促進機體健康[1-2]。益生菌因其特有的保健功能, 在食品領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用前景, 我國共有38種益生菌可用于食品, 主要包括雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬和乳球菌屬等, 此外還有13種益生菌被批準可用于嬰幼兒食品。

乳雙歧桿菌V9（Bifidobacterium animalis subsp.lactis V9）是從中國蒙古族兒童糞便中分離出的一種乳酸菌, 可以抑制腸道中的志賀氏菌、埃希菌、沙門氏菌以及曲桿菌等有害菌的生長, 從而有效緩解腹瀉癥狀,還可以降低血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平來減輕機體炎癥[3-4]。植物乳桿菌P9（Lactobacillus plantarum P9）是從內(nèi)蒙古自然發(fā)酵酸粥中分離出來的菌株, 研究顯示該菌株對胃腸液和膽汁具有良好的耐受性, 攝入后在腸道仍可以保持活性[5]。干酪乳桿菌Zhang（Lactobacillus casei Zhang）是由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)張和平團隊從馬奶中分離得來, 是我國迄今為止研究較為深入的一個菌株, 研究顯示攝入干酪乳桿菌Zhang后, 腸道中乳酸菌和雙歧桿菌等益生菌豐富度顯著增加, 且乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的含量有所提高[6-8]。

不同益生菌的功效不同, 多種益生菌聯(lián)合使用的效果要優(yōu)于單一菌種, 雙歧桿菌和乳桿菌是目前食品可添加微生物中兩類重要的益生菌, 因此由雙歧桿菌和乳桿菌組成的益生菌復(fù)合制劑已成為功能食品領(lǐng)域的研究熱點[9-11]。目前, 關(guān)于上述3種益生菌雖在調(diào)節(jié)腸道菌群和改善機體健康方面有所研究, 但關(guān)于其聯(lián)合使用鮮有報道, 并且植物乳桿菌P9在改善腸道菌群和促進健康等方面缺少數(shù)據(jù)支持, 還需深入研究。本研究使用乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P9、干酪乳桿菌Zhang組成的益生菌復(fù)合制劑, 探究其在小鼠細胞因子、抗氧化能力、腸道菌群及其代謝產(chǎn)物方面的作用, 以期為益生菌復(fù)合制劑的研發(fā)提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

益生菌復(fù)合制劑（活菌數(shù)為2×1011CFU/g, 乳雙歧桿菌V9占60%, 植物乳桿菌P9占20%, 干酪乳桿菌Zhang占20%）, 北京科拓恒通生物技術(shù)股份有限公司；EMB瓊脂培養(yǎng)基、疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基、LBS瓊脂培養(yǎng)基、BBL瓊脂培養(yǎng)基、TSC瓊脂培養(yǎng)基,北京陸橋技術(shù)股份有限公司；白介素2(IL-2)、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒,武漢華美生物工程有限公司。丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒,南京建成生物科技有限公司；44只雄性BALB/c小鼠, 4周齡, 體重18～20 g, 北京華阜康生物科技股份有限公司, 許可證號：SCXK（京）2019-0008, 飼養(yǎng)條件每天光照12 h, 溫度為20±2℃, 濕度45%～60%。

1.1.2 儀器

Infinite M200 Pro多功能酶標儀, 上海安景；5425R臺式離心機, 德國艾本德；NU-9483E超低溫冰箱, 美國Nuaire；RS220CHUV超純水機, 上海安景；FA2004N電子分析天平, 上海儀天；MS3漩渦震蕩儀, 德國IKA；ZHS-100HC恒溫恒濕培養(yǎng)箱, 上海喆圖；V-1600可見分光光度計, 上海美普達。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥

44只4周齡雄性BALB/c小鼠, 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后, 隨機分為空白對照、低劑量組（2.5×107CFU/kg）、中劑量組（5×107CFU/kg）、高劑量組（1.5×108CFU/kg）, 空白對照組灌胃生理鹽水, 各劑量組灌胃對應(yīng)劑量的益生菌復(fù)合制劑, 共計28 d, 實驗期間每天稱量小鼠攝食和體重, 實驗結(jié)束后所有小鼠摘眼球取血后脫頸處死, 解剖取出心、肝、脾、肺、腎、胸腺, 稱重計算臟器系數(shù), 保留空腸和肝臟放置于超低溫冰箱中。

1.2.2 益生菌復(fù)合制劑對小鼠血清中細胞因子的影響

小鼠摘眼球取血置于1.5 mL離心管中, 4℃, 4 000 rpm離心10 min, 取0.2 mL上清, 檢測IL-2、IL-6、IL-1β、TNF-α水平, 具體操作步驟嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.2.3 益生菌復(fù)合制劑對小鼠空腸和肝臟的抗氧化物質(zhì)的影響

小鼠肝臟和空腸中的MDA、T-SOD、GSH、GSH-Px水平采用比色法進行測定, 具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 腸道菌群計數(shù)

第0 d（灌胃益生菌復(fù)合制劑前）和第28 d, 收集小鼠糞便約0.04 g, 加入稀釋液后振蕩混勻, 按10倍系列稀釋至10-8, 腸桿菌選擇EMB瓊脂培養(yǎng)基, 37℃培養(yǎng)24 h；腸球菌選擇疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷培養(yǎng)基, 37℃培養(yǎng)48 h；乳桿菌選擇LBS瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48 h；雙歧桿菌選擇性BBL瓊脂培養(yǎng)基, 37℃厭氧培養(yǎng)48 h；產(chǎn)氣莢膜梭菌選擇TSC瓊脂培養(yǎng)基, 37℃厭氧培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后計算出每克濕便中的菌落數(shù)（l g CFU/g）。

1.2.5 益生菌復(fù)合制劑對小鼠糞便中短鏈脂肪酸的影響

采用氣相色譜法測定小鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸的含量。參照Han等[12]方法并加以改進, 稱取小鼠糞便約0.2 g, 加入0.25 mL 25%亞磷酸溶液, 旋渦震蕩約10 s, 加入1.25 mL丙酮, 使用勻漿器上下研磨使樣品充分混勻, 靜置2 min, 取0.35 mL上清液, 加入0.65 mL丙酮, 12 000 rpm離心5 min, 取200μL上清液進行氣相色譜分析。分析條件如下：色譜柱選用DB-FFAP毛細管柱；載氣為純度99.99%的氮氣；初始溫度40℃, 按10℃/min升至200℃, 保持3 min, 檢測器溫度為270℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)通過Excel 2019軟件預(yù)處理后, 使用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析, 攝食和體重使用origin 2021軟件進行作圖、臟器系數(shù)、細胞因子、抗氧化數(shù)據(jù)采用單因素ANOVA分析, 腸道菌群計數(shù)采用獨立樣本t檢驗分析, P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異, P＜0.01表示有統(tǒng)計學(xué)差異, P＞0.05表示無統(tǒng)計學(xué)差異, 所有結(jié)果顯示為均值±標準差（±s）。

2 結(jié)果與討論

2.1 益生菌復(fù)合制劑對小鼠體重和攝食的影響

各組小鼠攝食體重情況如圖1所示, 隨著小鼠年齡增長, 攝食和體重呈穩(wěn)定上升趨勢, 但實驗期間各組小鼠間攝食和體重整體無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）, 表明益生菌混合制劑對小鼠的攝食和體重?zé)o影響。

圖1 益生菌復(fù)合制劑對小鼠攝食（a）和體重（b）的影響

2.2 益生菌復(fù)合制劑對小鼠臟器系數(shù)的影響

小鼠各臟器系數(shù)如表1所示, 各組小鼠間的全部臟器系數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異, 表明益生菌復(fù)合制劑對小鼠各臟器無影響。

表1 小鼠各器官臟器系數(shù)(±s,n=11)

表1 小鼠各器官臟器系數(shù)(±s,n=11)

臟器 空白對照組 低劑量組 中劑量組 高劑量組心0.0065±0.00098 0.0073±0.00092 0.0072±0.00099 0.0068±0.00073肝0.048±0.0049 0.045±0.0048 0.045±0.0038 0.045±0.0044脾0.0036±0.00043 0.0034±0.00045 0.0037±0.00063 0.0037±0.00047肺0.0053±0.00077 0.0055±0.00093 0.0060±0.00061 0.0065±0.00090腎0.017±0.0014 0.017±0.0011 0.017±0.0010 0.016±0.0013胸腺 0.0016±0.00019 0.0016±0.00020 0.0019±0.00014 0.0017±0.00030

2.3 益生菌復(fù)合制劑對小鼠血清中細胞因子的影響

細胞因子是一類能在細胞間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽, 正常情況下可以幫助機體清除病原體, 增強免疫力, 然而過多的細胞因子會誘發(fā)炎癥, 形成細胞因子風(fēng)暴, 對組織器官造成損傷[13]。IL-2主要由T細胞或T細胞亞群產(chǎn)生而來, 可誘導(dǎo)B細胞、T細胞、NK細胞增殖分化[14]。IL-6主要由巨噬細胞、T細胞、B細胞以及纖維細胞產(chǎn)生, 當機體受到細菌或病毒侵襲時, 會誘導(dǎo)機體產(chǎn)生大量IL-6以應(yīng)對侵害[15]。IL-1β和TNF-α主要由活化的單核-巨噬細胞產(chǎn)生, 廣泛參與了代謝紊亂、腫瘤以及各類炎癥反應(yīng)[16-18]。正常情況下上述4種細胞因子水平處于較低水平, 若水平過高則表示機體出現(xiàn)炎癥反應(yīng), 可能會對組織或器官造成損害。由圖2可知, 與空白對照組相比, 低劑量組IL-1β水平極顯著降低（P＜0.01）, 中劑量組IL-2水平顯著降低（P＜0.05）且IL-6和IL-1β水平極顯著降低（P＜0.01）, 高劑量組IL-2、IL-6、IL-1β水平極顯著降低（P＜0.01）, TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）, 說明益生菌復(fù)合制劑可以有效地降低了這4種細胞因子的水平, 在抑制炎癥方面有一定的作用。

圖2 益生菌復(fù)合制劑對血清細胞因子的影響

2.4 益生菌復(fù)合制劑對小鼠空腸和肝臟的抗氧化能力的影響

新陳代謝是機體必不可少的生命活動, 在合成和分解過程中往往會產(chǎn)生大量自由基, 使細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激性損傷, 因此機體往往通過產(chǎn)生SOD、GSH、GSH-Px等保護酶來清除有害物質(zhì)[19-21]。MDA是機體膜脂過氧化產(chǎn)物之一, 其水平往往與生物膜受氧化破壞程度呈正相關(guān)[22]。實驗結(jié)果顯示, 在小鼠空腸中, 與空白對照組相比, 低劑量組MDA的水平顯著降低（P＜0.05）, 在中高劑量組中極顯著降低（P＜0.01）；與空白對照組相比, 中劑量組T-SOD的水平顯著提高（P＜0.05）, 高劑量組極顯著提高（P＜0.01）；與空白對照組相比, 高劑量組GSH水平顯著提高（P＜0.05）；與空白對照組相比, 中高劑量組的GSH-Px水平均極顯著提高（P＜0.01）。在肝臟中, 各劑量組與空白對照組相比MDA水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；中高劑量組與空白對照組相比, T-SOD水平極顯著提高（P＜0.01）；與空白對照組相比, 中劑量GSH水平顯著提高（P＜0.05）, 在高劑量組中極顯著提高（P＜0.01）；中高劑量組與空白對照組相比, GSH-Px水平極顯著提高（P＜0.01）。上述結(jié)果說明, 灌胃不同劑量的益生菌復(fù)合制劑后, 在空腸和肝臟中, 3種具有抗氧化功效物質(zhì)的水平均明顯提高, 且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性, 說明該益生菌復(fù)合制劑對提高小鼠抗氧化能力具有一定的作用。

表2 小鼠空腸和肝臟中抗氧化物質(zhì)含量

2.5 菌落計數(shù)

菌落計數(shù)結(jié)果顯示, 灌胃28 d益生菌復(fù)合制劑后, 中劑量組與空白對照組相比, 乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著提高（P＜0.05）；高劑量組與空白對照組相比, 乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量極顯著提高（P＜0.01）。灌胃中劑量益生菌復(fù)合制劑與實驗前相比, 乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著提高（P＜0.05）；灌胃高劑量益生菌復(fù)合制劑與實驗前相比, 乳桿菌數(shù)量極顯著提高（P＜0.01）, 雙歧桿菌數(shù)量顯著提高（P＜0.05）。此外, 各劑量組實驗前后以及與空白對照組相比, 腸桿菌、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量均無明顯變化且未增加（P＞0.05）。已有研究證實, 便秘患者在服用21 d乳雙歧桿菌V9后, 糞便中雙歧桿菌數(shù)量顯著提高, 便秘癥狀得到有效緩解[23]。此外, Zhang等[24]研究發(fā)現(xiàn)通過攝入干酪乳桿菌Zhang可以有效增加人體腸道中乳桿菌和雙歧桿菌等有益菌的數(shù)量, 起到改善腸道功能作用。實驗結(jié)果表明, 小鼠在灌胃益生菌復(fù)合制劑后, 乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量明顯增加, 對調(diào)節(jié)腸道菌群起到重要作用。

圖3 腸道菌群計數(shù)結(jié)果

2.6 益生菌復(fù)合制劑對小鼠糞便中短鏈脂肪酸的影響

短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）是由腸道微生物發(fā)酵膳食纖維時所產(chǎn)生的代謝物, 對于緩解炎癥性腸病、維持腸道黏膜屏障完整性、能量代謝有著重要幫助, 測定機體糞便中的SCFAs的種類和含量對機體腸道微生物和內(nèi)環(huán)境的研究有著重要意義[25]。乙酸、丙酸和丁酸作是腸道中占比最多的SCFAs, 乙酸主要由艾克曼氏菌、擬桿菌、雙歧桿菌、普雷沃氏菌、胃瘤球菌通過乙酰輔酶A或Wood-Ljungdahl途徑產(chǎn)生, 主要用于脂質(zhì)和膽固醇的合成；丙酸主要由擬桿菌和梭狀芽孢桿菌通過琥珀酸途徑和丙烯酸酯途徑產(chǎn)生的, 通過血液循環(huán)進入肝臟來參與脂肪代謝并降低血清中的脂質(zhì)水平；丁酸主要由糞球菌等通過丁酸激酶或乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶途徑產(chǎn)生, 是結(jié)腸上皮細胞的主要能量來源, 對其增殖分化具有重要調(diào)控作用[26-28]。在本研究中, 低、中和高劑量組與空白對照組相比, 乙酸含量極顯著提高（P＜0.01）；高劑量組與空白對照組相比, 丙酸含量極顯著提高（P＜0.01）, 丁酸含量顯著提高（P＜0.05）；各組間異丁酸和異戊酸含量無顯著差異（P＞0.05）。本次實驗結(jié)果顯示, 益生菌復(fù)合制劑的干預(yù)能夠提高小鼠糞便中乙酸、丙酸和丁酸的含量。

圖4 益生菌復(fù)合制劑對SCFAs的影響

3 結(jié)論

本文探究了由乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P9、干酪乳桿菌Zhang組成的益生菌復(fù)合制劑對小鼠血清細胞因子、空腸和肝臟抗氧化能力、腸道微生物和SCFAs的影響。研究發(fā)現(xiàn), 灌胃28 d益生菌復(fù)合制劑可以降低小鼠空腸和肝臟中MDA水平, 提高TSOD、GSH、GSH-Px水平, 降低血清中IL-2、IL-6、IL-1β和TNF-α水平,使腸道中乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量明顯增加, 并提高乙酸、丙酸和丁酸的含量。該益生菌復(fù)合制劑對提高小鼠抗氧化能力、降低細胞因子水平、改善腸道微生態(tài)環(huán)境、促進健康具有一定的有益效果。