董婧，盧少奇，伍娟麗，王子康，王恒嘉，徐菲

1.北京市環(huán)境保護科學研究院

2.國家城市環(huán)境污染控制工程技術研究中心

3.首都師范大學

河流生態(tài)系統(tǒng)涵蓋飲用水、灌溉用水、景觀用水、養(yǎng)殖用水等與人類生活密切相關的多種功能[1]。然而經(jīng)濟的快速發(fā)展及城市人口的增長，使河流生態(tài)系統(tǒng)遭受到一定的破壞，導致河流生態(tài)環(huán)境退化，敏感物種減少，甚至制約當?shù)亟?jīng)濟的發(fā)展[2]。開展河流生態(tài)系統(tǒng)健康評價體系研究，選取有效的指標和科學的方法對河流生態(tài)系統(tǒng)健康狀況進行準確診斷，進而開展可持續(xù)利用與管理，對于促進河流生態(tài)系統(tǒng)健康發(fā)展具有重大意義[3]。

目前，關于水體生態(tài)系統(tǒng)健康評價的研究已有很多，采用的評價方法也不盡相同。其中，應用較多的方法為生物完整性指數(shù)( index of biotic integrity，IBI)。IBI評價法是基于多種參數(shù)來完成的，通過生物群落組成結構反映生態(tài)系統(tǒng)的健康情況。該方法通過建立環(huán)境因子與生物參數(shù)的定量關系，篩選對環(huán)境因子敏感的生物參數(shù)，基于比較參數(shù)值與系統(tǒng)標準值對生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況進行評價[4]。

美國學者Karr等[4]在1981年基于魚類群落對IBI體系進行了構建，并對河流健康狀況進行了評價。國內(nèi)對IBI的研究相對稍晚，20世紀90年代，王備新[5]以底棲動物構建了IBI體系，對黃山地區(qū)的溪流進行了健康評價。經(jīng)過眾多學者對IBI的應用和研究，目前IBI已廣泛應用于水體生態(tài)系統(tǒng)健康評價中[6]。

生產(chǎn)者、消費者與分解者的存在組成了完整的水體生態(tài)系統(tǒng)。在目前的大多數(shù)研究中，對生產(chǎn)者與消費者的關注度較高，雖然分解者也是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，但其在構建IBI時卻往往被忽略[7]。水體中的分解者主要由微生物構成，同時微生物也是整個生態(tài)系統(tǒng)中數(shù)量最多的物種[8]。微生物處于食物網(wǎng)的基礎營養(yǎng)級，對生態(tài)系統(tǒng)的反應速度往往高于生產(chǎn)者與消費者，因此在生態(tài)系統(tǒng)健康狀況發(fā)生改變時，微生物的指示要早于處于較高營養(yǎng)級的生產(chǎn)者與消費者[9]。另外，隨著污染程度的加深，生產(chǎn)者與消費者的數(shù)量往往會大幅衰減，從而影響了采集樣品的豐富度，導致無法以生產(chǎn)者與消費者作為合適的生物指標。而分解者則不受此影響，在受污染的水體中，以微生物為主體的分解者往往會更加活躍，群落結構也具有相當?shù)呢S富性。因此，以分解者——微生物群落作為主要對象構建IBI指數(shù)體系用于評估水體生態(tài)系統(tǒng)健康是值得關注的重要研究方向[10]。Kondratieff等[11]研究發(fā)現(xiàn)，微生物種群結構會明顯受到人類活動的影響，遠離工業(yè)源和人為源的地區(qū)以自養(yǎng)微生物為主，人類活動和工業(yè)源較多地區(qū)異養(yǎng)微生物顯著增加。Garrido等[12]對比了地下水和污水處理廠二級、三級出水微生物種群結構，結果表明，擬桿菌門、γ-變形桿菌門、硝化螺旋門相對豐度與β-變形菌門相對豐度之比存在顯著差別。因此，微生物可以作為指示生物對河流健康狀況起到指示和預警作用。Lau等[13]應用細菌群落結構指數(shù)（bacterial community index，BCI），成功評價了溪流生態(tài)健康情況。安新麗等[14-17]通過Illumina高通量測序技術，構建了微生物的生物完整性指數(shù)(microbial index of biotic integrity，M-IBI)的指標體系，并將其成功應用于地下水、濕地、城市河流的健康狀況評價中。

中國北方城市多為缺水城市，城市河道大多以城鎮(zhèn)再生水廠出水為補水，不同于自然水補水的河道，以再生水補水的河道往往受人為干擾較大。盡管再生水的常規(guī)水質(zhì)指標與天然水體無明顯差別，但以再生水補水的河道的生態(tài)系統(tǒng)較天然水體補水的河道顯著不同。城市河道受人為干擾較大，其健康狀況通常會成為制約城市發(fā)展的重要因素。因此探求城市河道的生態(tài)健康狀況，并采用準確有效的方法對其進行評價，對城市河道管理具有重要意義。筆者以北京市4條河流為研究對象，設置15個代表性采樣點，分析其微生物群落結構和水環(huán)境理化因子特征，比較微生物群落結構的差異性；以微生物為指示生物，運用M-IBI評價體系對4條河流進行生態(tài)系統(tǒng)健康評價，以期為北京市河流生態(tài)系統(tǒng)健康維護與管理提供支撐，同時為其他地區(qū)河流生態(tài)系統(tǒng)健康評價提供參考。

1 研究區(qū)與研究方法

1.1 研究區(qū)概況與采樣點設置

選取北京市4條具有代表性的城市河道作為研究對象。其中，永定河以自然水體為河道補給水源，經(jīng)門頭溝區(qū)、石景山區(qū)、豐臺區(qū)、房山區(qū)、大興區(qū)，自大興區(qū)崔指揮營村東出市境域。在永定河設置2個采樣點（YDH1、YDH2）。清河、涼水河、大龍河3條城市河道以再生水廠出水作為補給水源，自西向東流經(jīng)人類活動密集的城區(qū)。清河從北京市海淀區(qū)頤和園西北角的安河閘起〔北長河（京密引水渠）與北旱河匯合處〕向東北流，經(jīng)肖家河、朱房村、清河、河北村、立水橋、沈家村、沙子營后，在立水橋以東入溫榆河。在清河設置4個采樣點（QH1、QH2、QH3、QH4）。涼水河流經(jīng)石景山、豐臺、朝陽、大興、通州等區(qū)，于榆林莊閘上游匯入北運河。在涼水河設置5 個采樣點（LSH1、LSH2、LSH3、LSH4、LSH5）。大龍河為北京市境內(nèi)的河流，起自黃村南鐵道口閘，從西北向東南流經(jīng)大興縣的4個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，至白塔村東與小龍河匯合。在大龍河設置4個采樣點（DLH1、DLH2、DLH3、DLH4）。河流采樣點如圖 1所示。

圖 1 4條城市河道采樣點位置Fig.1 Location of 4 urban river sampling points

1.2 樣品采集與分析

1.2.1 樣本采集和水質(zhì)分析

于2020年9月—2021年3月進行樣品的采集。每個點位各采樣3次（冬季有的河道結冰未采樣）。水樣和沉積物樣品的采集與分析參照《水與廢水監(jiān)測分析方法》[18]進行，同時測定化學需氧量（CODCr）、總磷（TP）、石油類、氨氮（NH3-N）、溶解氧（DO）、生化需氧量（BOD5）、總氮（TN）、As、pH等指標。

1.2.2 DNA 抽提和 PCR 擴增

根據(jù)FastDNA? Spin Kit for Soil (MP Biomedicals，美國)說明書進行微生物群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度；使用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和 806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對 16S rRNA 基因V3～V4 可變區(qū)進行PCR擴增，擴增程序如下：95℃ 預變性 3 min，27 個循環(huán)（95 ℃ 變性 30 s，55 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 30 s），然后 72 ℃穩(wěn)定延伸 10 min，最后在 4 ℃ 進行保存（PCR 儀：ABI GeneAmp?9700 型）。PCR 反應體系：5×TransStart FastPfu緩沖液 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL ， 下 游 引 物 （5 μmol/L ）0.8 μL ，TransStart FastPfu DNA 聚合酶 0.4 μL，模板 DNA 10 ng，補足至20 μL。每個樣本3個重復，取平均值。

1.2.3 Illumina Miseq測序

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, 美國)進行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Quantus?Fluorometer (Promega, 美國) 對回收產(chǎn)物進行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫：1)接頭鏈接；2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段；3)利用PCR擴增進行文庫模板的富集；4)磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

使用Fastp（version 0.20.0）軟件對原始測序序列進行質(zhì)控，使用Flash（version 1.2.7）軟件進行拼接：1）過濾序列（reads）尾部質(zhì)量20 bp以下的堿基，設置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量低于20 bp，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后50 bp以下的序列（reads），去除含氮堿基的序列（reads）；2）根據(jù)PE 序列之間的重疊（overlap）關系，將成對序列拼接（merge）成 1 條序列，最小重疊（overlap）長度為 10 bp；3）拼接序列的重疊區(qū)允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；4）根據(jù)序列首尾兩端的標簽序列（barcode）和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方標簽序列（barcode）允許的錯配數(shù)為0，最大引物錯配數(shù)為2。

使用UPARSE（version 7.1）軟件根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier (version 2.2)軟件對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫，設置比對閾值為70%。

1.3 M-IBI 評價體系的構建

1.3.1 參考點與污染點的區(qū)分

基于GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》對水樣TP、石油類、NH3-N、DO、CODCr、BOD5、TN、As、pH這9項因子進行賦分，即達到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ類水質(zhì)標準，分別記為5、4、3、2、1分，未達Ⅴ類水質(zhì)標準，計為0分，對各指標求平均值即可得到該采樣點水質(zhì)總得分。水質(zhì)總得分大于90%分位數(shù)的采樣點為參考點，其他采樣點為受人類影響較大的干擾位點。其中，水質(zhì)總得分小于10%分位數(shù)的采樣點為高度受干擾位點，10%～90%分位數(shù)的采樣點為中度受干擾位點[19]。

1.3.2 備選指標的確定與篩選

選取與微生物群落豐富度、結構、組成和功能相關的參數(shù)作為計算M-IBI的備選指標。其中，與群落組成相關的參數(shù)選擇主要涉及優(yōu)勢種分布及與水質(zhì)變化密切相關的微生物組成；與功能相關的微生物主要包括致病菌、污染物降解菌和參與營養(yǎng)物質(zhì)代謝循環(huán)的菌屬。通過RDA分析篩選關鍵的環(huán)境因子，利用加權平均回歸的方法計算各分類單元的最適值，運算方法參照文獻[1]。通過采用典型相關分析和Spearman相關性分析，明確顯著影響河道微生物群落組成的水質(zhì)指標及其與各類微生物間的相關系數(shù)和顯著性。其中，與關鍵水質(zhì)指標顯著相關的微生物組成可作為備選指標。參照文獻[20-24]對備選指標進行干擾反應、判別能力分析和相關性分析，篩選出用以計算M-IBI的生物參數(shù)指標。其中，判別能力分析對備選指標進行Pearson相關性分析，若2個指標的相關性系數(shù)（R）≥0.70，表明二者所反映的信息重疊性較大，選擇其中之一用于構建MIBI評價體系。

1.3.3 M-IBI的計分及評價標準

采用比值法計算M-IBI。其中，對隨干擾增大而減小的指標，各指標的分值等于指標值除以所有采樣點的95%分位數(shù)；對隨干擾增大而增大的指標，以所有采樣點的5%分位數(shù)為最佳期望值進行計算。計算方法：（最大值－指標值）/（最大值－5%分位數(shù)）。該方法規(guī)定，經(jīng)計算后的分值分布為0～1，若大于1，則記為1。以參考點IBI的95%分位數(shù)作為健康評價的最佳值，低于該值的分布范圍進行五等分，靠近95%分位數(shù)的一等分代表被測樣點處于健康狀態(tài)，隨后依次是亞健康、一般、較差和極差的劃分標準。

2 結果與分析

2.1 關鍵因子的確認

研究區(qū)各采樣點微生物信息通過高通量測序進行分析，共獲得 986 148條序列，選擇Shannon、Simpson、Ace、Chao、Coverage和PD 多樣性指數(shù)進行分析，各采樣點微生物多樣性指數(shù)分析結果如表1所示。Shannon、Simpson和PD指數(shù)反映群落多樣性，Ace和Chao指數(shù)反映群落豐富度，Coverage指數(shù)反映群落覆蓋度。由表1可知，永定河的Shannon、Ace、Chao、Coverage和PD多樣性指數(shù)與清河、涼水河和大龍河存在顯著差異。

各河道采樣點主要水質(zhì)指標測定及得分計算結果如表2所示。15個采樣點的水質(zhì)總得分為3.22～4.22，50%和95%分位數(shù)分別為3.56和4.00。因此，水質(zhì)總得分大于4.00的采樣點（YDH1、YDH2）為低干擾點，即參考點；水質(zhì)總得分為3.56～4.00和小于3.56的采樣點分別為中等（9個）和較高（3個）干擾強度點，均為污染點。

表 1 4條城市河道各采樣點水體微生物多樣性指數(shù)Table 1 Microbial diversity index of water bodies at sampling points of four urban rivers

表 2 4 條城市河道各采樣點主要水質(zhì)參數(shù)及其得分Table 2 Main chemical and physical properties and scores at sampling point of four urban rivers

采用RDA分析微生物群落結構變化與水質(zhì)指標間的關系，結果如圖2所示。由圖2可知，TN、TP、NH3-N、NO3-N和NO2-N與微生物群落分布具有顯著相關關系（P＜0.05）。氮和磷濃度均是影響微生物群落結構的重要因素，不同微生物對氮和磷的耐受程度存在差別。

分析存在顯著相關性的水質(zhì)指標（TN、TP、NH3-N、NO3-N和NO2-N）與微生物群落之間的Spearman相關性，結果如圖3所示。由圖3可知，放線菌門（Actinobacteriota）的相對豐度與TP、NO3-N和NO2-N濃度呈負相關，Patescibateria（新物種）的相對豐度與NH3-N和NO2-N濃度呈負相關，Acidobacteriota的相對豐度與TP、NO2-N濃度呈正相關，綠彎菌門（Chloroflexi）的相對豐度與NO3-N濃度呈正相關，Bacteroidota的相對豐度與NH3-N濃度呈正相關，藍藻門（Cyanobacteria）的相對豐度與NO3-N濃度呈正相關，Proteobacteria的相對豐度與TP濃度呈負相關，與NH3-N濃度呈正相關，厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度與NH3-N濃度呈正相關，脫硫桿菌門（Desulfobacterota）的相對豐度與NH3-N濃度呈正相關。因此，將這些與主要水質(zhì)指標呈顯著相關性的微生物組成納入后續(xù)評價的備選指標中。

圖 2 各采樣點微生物門水平群落結構與環(huán)境因子相關的RDA分析Fig.2 Redundancy analysis (RDA) of microbial community structure and environmental factors

圖 3 微生物門水平組成(相對豐度排名前10)與水質(zhì)指標的Spearman相關性分析結果Fig.3 Spearman correlation analysis between microbial community phylum composition (top10) and water quality index

2.2 備選指標的篩選

選用可以反映河道微生物群落多樣性、結構和功能，同時可反映水質(zhì)變化的相關微生物組成作為河道M-IBI的備選指標，共確立15個備選指標（表3）。

通過對15個備選指標進行判別能力分析，篩選出Shannon指數(shù)、Bacteroidota相對豐度、Chloroflexi相對豐度、Cyanobacteria相對豐度、CODCr耐受屬相對豐度和NH3-N清潔屬相對豐度6個指標進行Pearson相關性分析，結果發(fā)現(xiàn)，6個指標的|R|＜0.75（表4），說明指標之間差異性顯著，并且具有統(tǒng)計學意義。因此，可以將這6個指標用于M-IBI評價體系的計算。

表 3 M-IBI 備選指標描述及對干擾的反應Table 3 Description of candidate metrics for M-IBI and their direction of response to disturbance

表 4 M-IBI指標的Pearson相關性分析結果Table 4 Pearson's correlation analysis results of M-IBI index

2.3 M-IBI指標體系評價及評價結果

將篩選出的指標采用比值法計算各指標分值（表5），確定比值法的M-IBI指標體系評價標準(表6)，進而得出所有采樣點M-IBI評分及健康評價結果(表7)。結果表明：根據(jù)水質(zhì)得分選定的YDH1、YDH2 2個參考點均為健康狀態(tài)；清河有2個采樣點為健康，2個采樣點為亞健康；涼水河有2個采樣點為健康，2個采樣點為亞健康，1個采樣點為一般；大龍河有3個采樣點為亞健康，1個采樣點為一般。評價結果為一般的采樣點處于涼水河和大龍河中段區(qū)域，位于城市地區(qū)，受人為活動干擾較大，盡管其水質(zhì)條件較其他采樣點無本質(zhì)區(qū)別，但生境條件和生態(tài)系統(tǒng)健康水平狀況較其他采樣點略差。

表 5 6個M-IBI指標在各采樣點的分布及其生物指數(shù)計算公式Table 5 Distribution of six M-IBI indexes at all sampling points and formulas for calculating biological index

表 6 基于 M-IBI 指數(shù)的城市河道生態(tài)系統(tǒng)健康評價標準Table 6 Urban river ecosystem health assessment criteria based on M-IBI index

表 7 各采樣點M-IBI評價結果Table 7 M-IBI evaluation results of each sampling point

3 討論

3.1 M-IBI評價結果的可行性

本研究通過Illumina高通量測序計算獲得河道中微生物的信息，使用M-IBI對河道健康狀況進行分析，評價結果基本符合現(xiàn)實河道水體生境狀態(tài)，即以自然水體為補水的城市河道健康程度較高，而以再生水為補水的城市河道大多處于亞健康水平，說明M-IBI可以有效區(qū)分不同河道的生態(tài)健康情況。何晨鳳[24]分別利用微生物和浮游植物評價湖泊生態(tài)系統(tǒng)健康狀況，發(fā)現(xiàn)2種評價結果整體變化趨勢一致，但小范圍內(nèi)存在一定差異，其原因為2種評價方法的采樣點不完全一致，同時由于環(huán)境因子的解釋度較低，需要獲取更多對微生物群落結構產(chǎn)生重要影響的環(huán)境因子信息。朱文婷等[16]利用M-IBI評價蘇州市濕地健康水平，其評價的有效性也綜合考慮了主要環(huán)境因子、土地利用方式及河道類型等的響應，并開展了相應的驗證，說明M-IBI可以反映濕地水生態(tài)系統(tǒng)的狀況。安新麗等[14]應用M-IBI對尾礦庫周邊地下水生態(tài)系統(tǒng)進行評價，評價結果可較好地區(qū)分不同采樣點的水質(zhì)優(yōu)劣狀況。盡管M-IBI已經(jīng)被應用于河流、湖泊、地下水等健康狀況的評估，但由于研究尚不夠完善，相關的環(huán)境因子和微生物候選指標的選擇需要進一步標準化。

3.2 微生物作為指示生物的潛力

城市河道生態(tài)系統(tǒng)與自然水體生態(tài)系統(tǒng)存在顯著區(qū)別，尤其是以再生水為補水的城市河道。盡管大型城鎮(zhèn)再生水廠出水CODCr、NH3-N等指標與自然水體并沒有顯著差異，但河道中微生物種類卻顯著不同，以M-IBI比對城市河道和自然水體，可以綜合評估水質(zhì)和生物對水體生態(tài)系統(tǒng)健康的影響，同時可以篩選出典型污染的耐受種和敏感種，其在水生態(tài)系統(tǒng)中的豐度對水體條件有著良好的指示作用。

通過對CODCr、NH3-N、TP等主要指標耐受種和敏感種的篩選分析發(fā)現(xiàn)，Modulibacteria被評定為NH3-N耐受種，其僅存在于健康狀態(tài)一般的采樣點，而在其余采樣點的相對豐度均為0；Fibrobacterota也被評定為NH3-N耐受種，其在參考點永定河中相對豐度為0，在涼水河和大龍河中沿程相對豐度逐漸增加，在健康狀況為亞健康和一般的采樣點相對豐度較高。這2個細菌門也被報道與黑臭水體中硝酸鹽和NH3-N存在顯著的相關性[25]，因此有可能作為水體變差的指示物種。

4 結論

（1）構建了城市河道生態(tài)系統(tǒng)健康評價的MIBI指標體系，包括Shannon指數(shù)、Bacteroidota相對豐度、Chloroflexi相對豐度、Cyanobacteria相對豐度、CODCr耐受屬相對豐度和NH3-N清潔屬相對豐度6個指標，通過M-IBI指標體系對永定河、清河、大龍河、涼水河生態(tài)系統(tǒng)健康進行評價。結果表明，永定河2個采樣點均為健康狀態(tài)；清河4個采樣點為健康至亞健康；涼水河5個采樣點為健康至一般；大龍河4個采樣點為亞健康至一般，無較差或極差的情況。

（2）永定河以自然水體作為補水，其生態(tài)系統(tǒng)處于健康狀態(tài)；涼水河、清河、大龍河以再生水廠出水作為補水，大多數(shù)采樣點處于亞健康狀態(tài)。

（3）以微生物作為指示生物，應用IBI方法可以較好地評價城市河道生態(tài)系統(tǒng)健康情況，但由于微生物鑒定結果的局限性以及研究的區(qū)域性，其結果的適用性有待進一步調(diào)查和驗證。