王元元 劉曉鷹 李 卉 羅接紅 陳 暢 王林群 張雪榮 霍文麗 陳雪蓮

(1 湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，武漢，430065； 2 湖北省中醫(yī)院/湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/湖北省中醫(yī)藥研究院，武漢，430061； 3 武漢市兒童福利院，武漢，430061)

兒童血尿涉及多種疾病，其病理改變主要為IgA腎病。研究發(fā)現(xiàn)45.25%病理表現(xiàn)為Ⅲ～Ⅴ級，15%～40%可發(fā)展為終末期腎衰竭[1]。小兒血尿是否需要治療以及何時治療，中西醫(yī)認識各異。西醫(yī)常建議長期隨訪，待出現(xiàn)蛋白尿或腎臟病理改變到一定程度再予以治療[2]。中醫(yī)多數(shù)醫(yī)家認為濕熱傷絡(luò)是其早期病機，主張積極治療，但因無臨床癥狀而單以尿檢為用藥依據(jù)，缺乏中醫(yī)證的微觀指標[3]。如何準確選擇小兒血尿的治療時機，是臨床中、西醫(yī)都不可回避的難題。目前公認腎活檢是腎臟疾病診斷金指標，但因有創(chuàng)且存在并發(fā)癥，受醫(yī)療及患者自身條件限制，而重復(fù)活檢更難被接受。所以臨床亟須一類理想的指標，既敏感精確、無創(chuàng)易采集，又能動態(tài)監(jiān)測腎臟早期病理變化，即使在不做腎活檢前提下，也能提示病情是否進入腎臟病變的進展階段。這樣，臨床醫(yī)師確定對小兒血尿治療的時機時就有了參考。代謝組學(xué)屬于系統(tǒng)生物學(xué)，可使人體生理病理狀態(tài)精確地呈現(xiàn)出來，同時還體現(xiàn)出了動態(tài)性和整體性的特點，其和中醫(yī)整體觀以及辨證觀相吻合[4]。本課題擬運用代謝組學(xué)技術(shù)，動態(tài)監(jiān)測模型大鼠不同時間點的代謝物，并與病情、腎組織病理、細胞因子等指標的變化規(guī)律相應(yīng)對，找出與中醫(yī)血尿“濕熱證”相關(guān)聯(lián)的微觀指征，為下一步把握本病的干預(yù)時間點奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 初篩76只健康雄性SD大鼠，3周齡，體質(zhì)量(90±20)g，購自湖北省預(yù)防科學(xué)院實驗動物中心。喂養(yǎng)大鼠的飼料來自于湖北省實驗動物中心飼料加工廠。在提供無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級別實驗動物研究中心場地的湖北中醫(yī)藥大學(xué)飼養(yǎng)。屏障環(huán)境條件設(shè)置：光照周期為晝夜12 h交替，室溫控制在23～25 ℃，濕度45%～65%，造模期間，需要在人工氣候箱中對溫度和濕度進行調(diào)節(jié)。本研究通過倫理委員會審批。

1.1.2 試劑與儀器 牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)(西格瑪奧德里奇公司，美國，批號：20160730)；脂多糖(西格瑪奧德里奇公司，美國，批號：20160830)；四氯化碳(CCl4)(武漢同興生物科技有限公司，批號：10654251)；二甲苯(國藥集團，批號：10023418)；大鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，批號：20161015)；大鼠核因子κB酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，批號：20161101)。固體核磁共振譜儀(布魯克公司，德國，型號：Bruker AVANCE III 600 MHz)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 76只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，未發(fā)現(xiàn)尿潛血和蛋白。篩除4只，將剩下72只按隨機數(shù)字表法分為對照組和模型組，每組36只，造模方法為結(jié)合課題組前期研究[5-8]和張靜等[9]報道的方法。對照組：普通飲食喂養(yǎng)12周，隔日注入2 mL的酸化水，第6周、第8周用生理鹽水注入尾靜脈及皮下。模型組：連續(xù)喂養(yǎng)高脂及高糖飼料，隔日將0.1%的BSA酸化水(400 mg/kg)給大鼠灌胃，每周注入0.1 mL CCl4和0.3 mL花生油，皮下注射12周。從第4周開始添加人工高溫濕熱環(huán)境。把大鼠置于恒溫恒濕箱中5 d，起始溫度設(shè)置為28～35 ℃，濕度70%～95%，溫度升高1 ℃/d，濕度增加5%/d。5 d后，大鼠回到屏障環(huán)境。第6周需要進行尾靜脈注射，注射1%BSA酸化水(20 mg/kg)，1次/d，共3 d。第6周、第8周分別進行尾靜脈注射脂多糖(0.05 mg/只)，實驗持續(xù)至第12周末。實驗出現(xiàn)：大鼠外觀濕熱證候，尿常規(guī)檢出血尿和(或)蛋白尿，腎組織病理改變與系膜增生性腎炎表現(xiàn)十分相似，利用免疫熒光可觀察到IgA沉積，此時可判斷造模成功[5-9]。

1.2.2 外觀觀察與指標檢測 觀察大鼠的一般情況、每周稱重并采集尿樣，用于尿紅細胞(Urine Red Blood Cell，URBC)、24 h尿蛋白定量(24 h UPro)檢測。第4、6、8、10周每組隨機選取6只大鼠，采集其尿液，12 h內(nèi)不得進食，再稱重，麻醉方法采用腹腔注射10%氫氯醛，心臟采血，血樣用于檢測生化指標總膽固醇、尿素氮以及用于酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)和核因子κB(Nuclear Factor-Kappa B,NF-κB)。

1.2.3 腎組織超微病理檢測 取雙側(cè)腎臟組織，冠狀面切取0.2 mm厚的腎組織于10%甲醛固定做光鏡檢查(PAS染色，×400)；切下一小部分外周腎皮質(zhì)并冷凍，為免疫熒光IgA檢測提供樣本。

1.2.4 代謝組學(xué)分析

1.2.4.1 代謝尿采集方法 每周留取大鼠即時尿液(500 μL～1 mL)，無菌巾鋪于代謝籠下方，用無菌吸管取即時尿，裝入2.5 mL EP管中，-80 ℃冰箱保存。

1.2.4.2 核磁共振氫譜(1H-Nuclear Magnetic Resonance，1H NMR)檢測方法 先對一維(1D)1H NMR譜進行采集，頻率600.13 MHz，溫度25 ℃。取500 μL尿樣加入管a，振蕩搖勻，靜置10 min，離心分離時長10 min，離心半徑97 mm，12 000 r/min，采集上清液450 μL，將這部分液體放入管b中，振蕩搖勻，靜置1 min。取45 μL Buffer加入管b中，振蕩搖勻，離心，取480 μL上清移至5 mm核磁管。借助于NOESYGPPR1D序列采集譜圖。參數(shù)設(shè)置：譜寬：20 ppm，等待時間：2 s，混合時間：100 ms，時間1∶4 μs，90°脈寬：15.2 μs，采樣時間：1.36 s，采樣點數(shù)：32 K，累加自由感應(yīng)衰減Free-induction Decay，F(xiàn)ID)次數(shù)：64次。

1.2.4.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析 將1H NMR的FID信號導(dǎo)入到Chenomx核磁軟件包(V8.1，加拿大)。自動進行傅里葉變換，調(diào)整相位，校正基線。每一個積分值面積都要進行處理，采用歸一化方法，得到每一段的矩陣以及對應(yīng)的積分面積。利用主成分分析法以及正交偏最小二乘法，對不同化學(xué)位移點的差異峰進行識別，得到差異化學(xué)位移點積分段的相對定量結(jié)果。

多元變量統(tǒng)計分析，主成分分析(PCA)為無監(jiān)督識別方法，可以觀察各組樣本的代謝輪廓。得分圖(Score plot)模型組(粉紅)與對照組(淡藍)分開。PCA載荷圖(Loading plot)反映了代謝物對主成分(PC1，PC2…)的貢獻率。正交偏最小二乘分析方法是一種有效的監(jiān)督識別方法。為區(qū)分樣本提供了支持。交叉驗證(CV)在評估模型的質(zhì)量上發(fā)揮了作用，模型的質(zhì)量(R2)和模型的預(yù)測能力(Q2)可以作為模型質(zhì)量的評估標準，排列組合驗證(Permutation Test)在OPLS-DA模型分類效果的評估上發(fā)揮了作用。然后開始1 000次隨機排列組合實驗

血尿濕熱證模型相關(guān)生物標志物，VIP值可以反映出主要的變量，同時也可以反映出這些變量的重要程度。VIP值越高意味著在樣本區(qū)分中付出得越多。在本次實驗過程中，將VIP值大于1的代謝物進行獨立樣本的t檢驗，P<0.05的代謝物被確認為存在潛在可能的生物標志物。

1.2.4.4 富集分析與代謝網(wǎng)絡(luò)圖 把潛在差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst5.0數(shù)據(jù)庫，進行代謝通路的富集分析，再利用京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，http://www.kegg.jp)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 一般情況與生化指標 對照組大鼠精神可、活動自如、食欲可、二便調(diào)；模型組大鼠第4周后出現(xiàn)易疲倦，嗜睡、反應(yīng)遲緩、毛發(fā)濕潤、食欲不振、小便短赤、大便軟爛、消瘦，部分大鼠可見皮下水腫、甚則陰阜潮濕等濕熱癥狀(死亡1只)。與對照組比較，模型組第5周起體質(zhì)量增長速度放緩，第7周起體質(zhì)量增長遲緩(P<0.05)，第11周最為明顯(P<0.01)；第6周出現(xiàn)血尿(P<0.05)，第8周可見蛋白尿(P<0.05)，且持續(xù)至實驗結(jié)束(P<0.01)；血肌酐、三酰甘油和總膽固醇增高(P<0.05)。見圖1。

圖1 2組大鼠體質(zhì)量、生化指標的比較

2.2 腎臟超微病理及免疫熒光 對照組腎組織結(jié)構(gòu)清晰完整，同時，腎小球處于正常狀態(tài)，毛細血管袢開放情況良好，系膜細胞并未出現(xiàn)增殖，細胞外基質(zhì)也未出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，腎小管結(jié)構(gòu)保持完整，間質(zhì)無炎癥細胞浸潤；模型組在第6周的時候，系膜細胞以及系膜基質(zhì)增生開始出現(xiàn)。隨著實驗的開展，到第8周、第10周以及第12周增生愈發(fā)明顯。同時可以觀測到一些腎小球系膜區(qū)開始呈現(xiàn)出分葉狀，并且擴展速度越來越快。可以觀察到毛細血管的管腔變化，其變得越來越狹窄，同時腎小球的上皮細胞也與以往出現(xiàn)了不同的變化，開始不斷腫脹、變性。在腎間質(zhì)中能夠觀察到一些炎癥細胞浸潤，在系膜區(qū)出現(xiàn)了IgA免疫熒光沉積++。見圖2～3。

圖2 2組大鼠不同時間點腎組織比較(PAS染色，×400)

圖3 第12周2組腎組織病理學(xué)比較(免疫熒光染色，×400)

2.3 細胞因子 本實驗?zāi)Ｐ徒MNF-κB第6周升高(P<0.05)，早于TGF-β1第10周升高(P<0.05)。見圖4。

圖4 2組大鼠NF-κB、TGF-β1比較

2.4 代謝輪廓 共找到61種代謝產(chǎn)物。見圖5。

圖5 代謝物歸屬譜圖(0～10.0×10-6)

2.5 多元變量統(tǒng)計分析 2組樣本在Score Plot圖中有分離的傾向。S-Plot圖顯示對應(yīng)于3.02、2.98等化學(xué)位移的代謝物。本模型R2=0.851 0,Q2=0.562 2，說明模型質(zhì)量好且預(yù)測能力強(R2>0.5，Q2>0.5)。實驗結(jié)果顯示R2與Q2的P均小于0.01，無過擬合，意味著這一模型的分類效果符合預(yù)期。見圖6。

圖6 PCA、OPLS-DA得分圖、載荷圖和S-Plot圖、交叉驗證、排列組合驗證(Permutation Test)

2.6 血尿濕熱證模型相關(guān)生物標志物 共篩選出14種差異代謝物。見表1。與對照組比較，模型組總體趨勢表達下調(diào)的物質(zhì)共計10種；總體趨勢表達上調(diào)的物質(zhì)共計4種。見圖7。

圖7 VIP值

表1 IgA腎病幼齡大鼠血尿濕熱證模型相關(guān)生物標志物

2.7 代謝通路分析 涉及19條通路。見表2。將Impact值>0.1的路徑視為潛在的靶標代謝通路，結(jié)合代謝通路拓撲分析氣泡可見三羧酸循環(huán)、乙醛和二元酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化等6條為主要代謝路徑。見圖8。在KEGG網(wǎng)站下載相關(guān)代謝途徑圖，描繪相關(guān)代謝途徑中差異代謝物的代謝網(wǎng)絡(luò)及14種潛在生物標志物隨時間變化的折線圖。見圖9～10。

表2 通路分析結(jié)果

圖8 代謝通路拓撲分析

圖9 相關(guān)代謝途徑中差異代謝物的代謝網(wǎng)絡(luò)

圖10 14種潛在生物標志物時間變化趨勢

2.7.1 三羧酸循環(huán)代謝擾動 檸檬酸、順烏頭、α-酮戊二酸是三羧酸循環(huán)主要參與物質(zhì)，表現(xiàn)為總體濃度呈下降趨勢，以脫離外濕環(huán)境的第5周更明顯(P<0.05或P<0.01)。說明大鼠體內(nèi)三羧酸循環(huán)的能量代謝發(fā)生擾動，這3種物質(zhì)的合成受到影響，與前述外觀改變一致。

生化層面可見第10周起模型組血肌酐顯著升高(P<0.05)，而相對應(yīng)在代謝層面可見尿肌酐第5周起含量降低，該趨勢持續(xù)至第10、11周時模型組較對照組出現(xiàn)明顯降低(P<0.05；P<0.01)。故肌酐改變可反映早期腎功能損傷情況。

2.7.2 腸道微生物紊亂 實驗中模型組馬尿酸總體為下降趨勢，以5、7、12周最為明顯(P<0.05)。且甘氨酸水平降低，表明大鼠濕熱證造模使在肝內(nèi)進行生物轉(zhuǎn)化的過程受到擾動，與生化層面三酰甘油和總膽固醇增高共同提示了肝內(nèi)代謝異常。本實驗中，氧化三甲胺和二甲胺在第5周表達上升，然后回調(diào)，之后又開始緩慢上升。本實驗第5周起苯乙酰甘氨酸增高(P<0.01)后總體呈下降趨勢直至實驗結(jié)束。4-羥基苯乙酸通過苯丙氨酸代謝路徑生成，再經(jīng)酪氨酸代謝可進入三羧酸循環(huán)，從第5周起即增高(P<0.01)，升高趨勢持續(xù)至實驗結(jié)束。

2.7.3 氨基酸代謝擾動 二者模型組與對照組比較發(fā)生擾動(P<0.05或P<0.01)，去除造模因素影響后又回調(diào)，總體趨勢以下行為主，說明體內(nèi)氨基酸代謝發(fā)生紊亂。

2.7.4 糖類代謝擾動 實驗可見模型組大鼠第5周蔗糖和葡萄糖醛酸明顯增高(P<0.01)，之后下降，到第9、10周再次小幅增高，至實驗結(jié)束時較對照組下降。而葡萄糖在第6周開始升高(P<0.01)，第8、10、12周明顯升高(P<0.01)，最終較對照組增高。

3 討論

我科國家級名老中醫(yī)倪珠英教授指出兒童血尿病機表現(xiàn)為“以熱為先，因濕為重”，其發(fā)生與濕熱之間存在著必然聯(lián)系，并且濕熱也是影響其轉(zhuǎn)歸病理一個重要因素[10]。本實驗?zāi)Ｐ徒M在實驗開始即加入高糖高脂飲食，第4周加入高溫高濕環(huán)境，第6、8周給大鼠尾靜脈注射脂多糖和CCl4，該造模方法對大鼠“制造”了體內(nèi)、外濕熱環(huán)境，使其體內(nèi)胃腸受損，體外濕熱叢生。結(jié)合大鼠外觀濕熱證表現(xiàn)，尿檢中發(fā)現(xiàn)了血尿、蛋白尿，高脂血癥、腎功能下降，出現(xiàn)炎癥介質(zhì)啟動、腎臟病理改變、IgA免疫熒光沉積等變化，表明該造模方法成功地建立了病證結(jié)合的IgA腎病幼齡大鼠血尿濕熱證模型。

在細胞因子層面，核因子κB參與多種炎癥介質(zhì)、趨化因子和促纖維化因子的合成、細胞凋亡等過程。一般來說，細胞因子表達水平的變化先于其他炎癥介質(zhì)的激活和釋放[11]。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)直接影響著介導(dǎo)腎小球疾病進展。TGF-β1直接影響介導(dǎo)腎小球疾病進展。TGF-β1過度表達時可以對炎癥反應(yīng)產(chǎn)生一定影響[12]。說明在造模早期即有炎癥因子啟動及表達，與腎臟病理改變相對應(yīng)。

在代謝組層面，共篩選出14種差異代謝物[13]。IgA腎病大鼠的腸道菌群代謝、能量代謝、氨基酸代謝、糖代謝均出現(xiàn)了隨時間變化的代謝擾動，IgA腎病的發(fā)病可能與這些代謝途徑的變化相關(guān)。能量代謝方面，三羧酸循環(huán)是能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)變樞紐[14]。α-酮戊二酸通過精氨酸生物合成精氨酸后再生成胍乙酸，后者與甘氨酸在脒基轉(zhuǎn)移酶作用下合成肌酸，加快肌酐的生成速度。借助于腎小球可將肌酐排出，如果觀察到腎小球病變，表示其濾過功能減退，排泄速率必然小于生成速率[15]。氨基酸代謝方面，腐胺和甘氨酸屬于氨基酸。腐胺主要是由鳥氨酸脫羧形成的[16]。甘氨酸為必需氨基酸非極性脂肪族，臨床上可降低血脂，促進脂肪代謝。糖代謝方面，經(jīng)戊糖、葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化途徑，谷氨酸可轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟侨┧幔笳呓?jīng)淀粉和蔗糖代謝路徑，轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜍斩姿崞咸烟?，再轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟恰；蚰蜍斩姿崞咸烟窃诎肴樘谴x下，轉(zhuǎn)變成尿苷二磷酸半乳糖，之后再進行轉(zhuǎn)變，成為了蔗糖以及葡萄糖，后者再進行分解，得到丙酮酸，受到線粒體氧化脫羧影響，形成了乙酰CoA，而后開始進入三羧酸循環(huán)[14]。糖是機體重要能量來源之一，本實驗大鼠一直給予高糖高脂飲食，葡萄糖醛酸、蔗糖下降，可見糖相關(guān)代謝出現(xiàn)擾動，而葡萄糖的含量增加也說明糖轉(zhuǎn)化為能量進入三羧酸循環(huán)的利用率降低。此外，其中涉及腸道微生物代謝途徑的5種代謝物質(zhì)，其豐度變化表明脂多糖、BSA可能引起大鼠腸道微生態(tài)擾動，致腸道菌群功能失常，而使大鼠濕熱證狀態(tài)持續(xù)至實驗結(jié)束。腸道菌群分解含苯基化合物產(chǎn)生苯甲酸后，再在肝臟線粒體基質(zhì)與甘氨酸生成馬尿酸[17]。馬尿酸主要由腎臟以尿液的形式排出，一部分會經(jīng)過腎小管排泄，另一部分則會經(jīng)過腎小球濾過，其水平異?？梢泽w現(xiàn)出腎小球和腎小管的功能障礙[18]。本實驗中馬尿酸水平降低說明腎臟功能受累。腸道菌群將食物中的膽堿和L-肉堿分解產(chǎn)生甲基胺類代謝物三甲胺，在肝臟經(jīng)過黃素單加氧酶，代謝成氧化三甲胺，再轉(zhuǎn)化為二甲胺隨腎臟排出體外[19]。正常情況下，二者可經(jīng)尿液排出體外。有研究表明血清氧化三甲胺濃度隨著腎功能的降低而顯著增加，正常成人尿液氧化三甲胺與血漿氧化三甲胺之間表現(xiàn)顯著正相關(guān)[20-21]。之后有學(xué)者進行了一項成人隊列研究，該研究結(jié)果顯示尿液氧化三甲胺與肌酐比值在早期慢性腎臟病患者和健康對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.20)[22]。早期慢性腎臟病兒童G2-G3期尿液中DMA和氧化三甲胺的水平低于G1期兒童[23]。在腸道中，苯丙氨酸由厭氧菌先代謝成苯乙酸，后者在肝臟中結(jié)再與甘氨酸結(jié)合生成苯乙酰甘氨酸[24]。有研究發(fā)現(xiàn)小兒特發(fā)性腎病綜合征患兒存在尿4-羥基苯乙酸水平上調(diào)[25]。給結(jié)腸癌模型大鼠喂食含有強抗氧化劑白藜蘆醇食物時，大鼠尿液4-羥基苯乙酸水平下降，這表明了4-羥基苯乙酸水平與氧化應(yīng)激之間的相關(guān)性，而氧化應(yīng)激可能是腎功能神經(jīng)調(diào)節(jié)失衡和以足細胞異常及腎小球結(jié)構(gòu)改變或丟失為特征的組織損傷的致病因素之一[26]。有研究認為，腸道微生物群在產(chǎn)生高水平IgA的小鼠和過度表達B細胞活性因子的轉(zhuǎn)基因小鼠中，其可以對IgA腎病的發(fā)病起到重要支持作用[27]。

本實驗以時間為縱軸，從一般情況、生化、腎組織病理、細胞因子、代謝組學(xué)等多個維度進行橫向?qū)Ρ?。初步發(fā)現(xiàn)模型大鼠代謝通路相應(yīng)代謝物的異常表達時間進程與趨勢，從第5周起即有代謝組學(xué)層面的改變，均早于其他各維度異常改變的時間節(jié)點，且各層面的內(nèi)涵并非畛域分明，而是緊密關(guān)聯(lián)，相互交集。為下一步明確血尿濕熱證幼齡大鼠的干預(yù)時間節(jié)點奠定了實驗基礎(chǔ)。然而，將代謝組學(xué)用于預(yù)測血尿濕熱證模型的病變程度及治療節(jié)點，尚需更多實驗研究的論證。