范雪梅，何麗冰，曾琴，欒宗檜,，劉如月,，韓長利，曾玖芝，劉偉信,*

卵巢組織冷凍和移植是一種重要的生育力保存方式，但冷凍復(fù)蘇過程中伴隨著大量卵泡損傷及凋亡，限制了其臨床應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)線粒體靶向抗氧化劑SS31(D-Arg-2,6-dimethyltyrosine-Lys-Phe-NH2)是一種小分子可滲透細(xì)胞的肽家族，能夠靶向定位和聚集在活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生的部位——線粒體內(nèi)膜，含量可高達(dá)5 000倍，具有內(nèi)在的抗氧化活性，能減少細(xì)胞凋亡，降低生理及病理條件下ROS水平[1-2]，對于保護(hù)線粒體功能、抗氧化應(yīng)激以及預(yù)防和治療小鼠的缺血再灌注損傷有明顯作用[3-5]。除了抗氧化活性，SS31還具有改善線粒體呼吸和促進(jìn)ATP合成的作用[6]。通過大量的離體器官研究和氧化應(yīng)激相關(guān)疾病模型的研究證實SS31對細(xì)胞的保護(hù)作用顯著，能有效避免細(xì)胞因氧化應(yīng)激反應(yīng)凋亡[7]。目前尚不清楚其對卵巢組織冷凍復(fù)蘇效果的影響。本研究將不同濃度SS31添加于冷凍液和復(fù)蘇液中用于家兔卵巢組織冷凍保存，探討SS31對于卵巢組織冷凍是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑

線粒體靶向抗氧化劑SS31，由上海強耀生物科技公司生產(chǎn)；PBS溶液由美國Gibco公司生產(chǎn)；TUNEL試劑盒由瑞士羅氏公司生產(chǎn)；胰蛋白酶K(proteinase K)由美國Merck Millipore公司生產(chǎn)。

1.2 實驗動物

自成都達(dá)碩實驗動物有限公司購買15只健康成熟雌性家兔，4～5月齡，體重1.8～2.2 kg。普通飼料飼養(yǎng)，自由攝水，光照周期12 h，動物房溫度24℃左右，飼養(yǎng)7 d后開始實驗。

1.3 實驗?zāi)Ｐ椭谱骷胺纸M

切除家兔雙側(cè)卵巢，保留卵巢皮質(zhì)部分，修剪成5×3×1 mm3大小的組織塊，將30個卵巢皮質(zhì)片段，隨機分成6組(n=5)。FRESH組：新鮮卵巢皮質(zhì)片段；CONTROL組：常規(guī)冷凍復(fù)蘇，卵巢冷凍保護(hù)液和復(fù)蘇液中無SS31；5 μM-SS31組、10 μM-SS31組、20 μM-SS31組、40 μM-SS31組：在卵巢冷凍保護(hù)液和復(fù)蘇液中分別加入5、10、20、40 μM SS31。

1.4 卵巢組織冷凍與復(fù)蘇

采用汪翔等[8]報道的玻璃化冷凍方法對卵巢皮質(zhì)片段進(jìn)行冷凍，一周后解凍卵巢組織。復(fù)蘇完成后，一部分經(jīng)固定、石蠟包埋、切片后用于HE染色和TUNEL檢測，一部分經(jīng)3%戊二醛固定制作電鏡標(biāo)本。

1.5 卵巢組織HE檢測

卵巢組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋，切片機3 μm連續(xù)切片，每間隔10張選取一張切片經(jīng)HE染色后，于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行卵巢組織學(xué)檢測。隨機選擇1個視野(非壞死及出血、非特異性染色的邊緣區(qū))，觀察各組卵巢組織結(jié)構(gòu)的改變、卵泡形態(tài)的變化。

1.6 卵泡凋亡檢測

每間隔10張選取一張卵巢組織切片行TUNEL檢測，觀察卵泡DNA損傷情況。光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞核固縮深染、棕黃色或棕褐色的細(xì)胞核、背景呈紫藍(lán)色的為凋亡卵泡。隨機從每個標(biāo)本中取出3張切片，在隨機選取的10個視野內(nèi)對凋亡卵泡進(jìn)行計數(shù)，計算凋亡百分比。TUNEL陽性率=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)(棕色信號)/總細(xì)胞數(shù)(藍(lán)色)×100%，即卵泡凋亡率=卵泡凋亡數(shù)/總卵泡數(shù)×100%。

1.7 卵巢組織電鏡檢測

組織經(jīng)固定、干燥、滲透與包埋、切片、染色等處理后制成電鏡樣本，用JEM-1400PLUS透射電鏡對銅網(wǎng)進(jìn)行圖像采集，每張銅網(wǎng)于15 000、25 000倍下觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SS31對冷凍卵巢的組織學(xué)特性影響

FRESH組(圖1A)各級卵泡未見明顯異常，間質(zhì)細(xì)胞、顆粒細(xì)胞排列規(guī)則、緊密。CONTROL組(圖1B)卵泡皺縮、塌陷，胞核固縮，卵母細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，顆粒細(xì)胞排列紊亂、稀疏，形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊，胞質(zhì)部分溶解，透明帶不規(guī)則，放射冠排列紊亂。5 μM-SS31組、10 μM-SS31組、20 μM-SS31組、40 μM-SS31組中(圖1C～F)隨著添加SS31濃度的升高，冷凍卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)越趨于新鮮卵巢組織，其中40 μM-SS31組卵泡結(jié)構(gòu)相對規(guī)則完整，卵泡數(shù)目較多，與FRESH組結(jié)構(gòu)最為相近。見圖1(彩插1)。

2.2 SS31對冷凍卵巢組織各級卵泡數(shù)量的影響

CONTROL組的原始卵泡、初級卵泡數(shù)目較FRESH組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；20 μM-SS31組、40 μM-SS31組中原始卵泡數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著SS31濃度增加，F(xiàn)RESH組與40 μM-SS31組中初級卵泡數(shù)量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組次級卵泡、竇狀卵泡數(shù)目的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見下頁圖2。

圖2 各組不同時期卵泡個數(shù)的比較

2.3 SS31對冷凍卵巢各級卵泡數(shù)量占比的影響

各組卵巢組織中的原始卵泡占比最高，初級卵泡間占比的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。各組原始卵泡占比、次級卵泡占比、竇狀卵泡占比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 各組卵巢組織中各級卵泡數(shù)量占比的比較

2.4 SS31對冷凍卵巢組織卵泡損傷率的影響

FRESH組卵泡損傷率最低(P<0.05)；隨著SS31濃度的增加，卵泡損傷率降低(P<0.05)。各組卵泡損傷率的比較見圖3。

圖3 各組損傷卵泡占比的比較

2.5 SS31對冷凍卵巢組織卵泡凋亡的影響

TUNEL測定各組卵巢組織中卵母細(xì)胞凋亡情況如下圖(圖4A～F，彩插1)。FRESH組卵泡凋亡率平均百分比最低，CONTROL組最高，隨著SS31濃度增加卵泡凋亡率平均百分比降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 各組卵泡凋亡百分比的比較

2.6 SS31對冷凍卵巢組織超微結(jié)構(gòu)的影響

FRESH組細(xì)胞形態(tài)正常，各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整清晰，可見豐富的細(xì)胞器，其余凍融組見不同程度的細(xì)胞器形態(tài)改變。CONTROL組中線粒體數(shù)量顯著減少，大量線粒體腫脹，甚至呈空泡狀。5 μM-SS31組、10 μM-SS31組、20 μM-SS31組、40 μM-SS31組中，隨著SS31濃度的增長，線粒體腫脹程度減輕，數(shù)量增多，見下頁圖6。

圖6 卵巢組織電鏡觀察

3 討論

卵巢組織冷凍常用的方法有慢速程序化冷凍和玻璃化冷凍。迄今為止，全球通過卵巢組織冷凍和移植技術(shù)出生的嬰兒已超過200例[9]，其中大多數(shù)采用慢速程序化冷凍，通過移植玻璃化冷凍保存的人卵巢組織獲得的活產(chǎn)嬰兒不超過5個[10]。慢速程序化冷凍所需冷凍保護(hù)劑少，細(xì)胞毒性小，但所需設(shè)備昂貴，耗時長，步驟繁瑣，冷凍過程易產(chǎn)生冰晶造成細(xì)胞損傷，因此臨床應(yīng)用受到限制。反之，玻璃化冷凍方法簡便易行，不需要昂貴的儀器設(shè)備，但冷凍過程應(yīng)用高濃度的冷凍保護(hù)劑可能存在潛在的細(xì)胞毒性。因此何種方法更具優(yōu)勢仍有爭議，一些研究認(rèn)為慢速程序化冷凍在保存原始卵泡方面更優(yōu)于玻璃化冷凍[11-12]。但更多的研究認(rèn)為玻璃化冷凍和慢速程序化冷凍之間沒有顯著差異[13-15]，甚至玻璃化冷凍還更優(yōu)于慢速程序化冷凍[16]，能更好地保存卵泡形態(tài)[17-18]。

冷凍保存的卵巢組織在合適的時機經(jīng)解凍復(fù)蘇后移植回女性體內(nèi)，凍融卵巢組織中存活的卵泡數(shù)量對移植后卵巢組織生殖內(nèi)分泌功能的恢復(fù)具有重要影響。卵巢在冷凍復(fù)蘇過程中不可避免地面臨卵泡損傷、細(xì)胞凋亡，如何減少凍融后卵巢組織中卵泡的損傷，提高冷凍保存的有效率成為改進(jìn)生育力保存技術(shù)的關(guān)鍵問題之一。研究認(rèn)為卵泡凋亡的根本原因與線粒體氧化損傷和ROS水平升高有關(guān)[19]。當(dāng)卵泡遭受缺血、缺氧、氧化應(yīng)激時，線粒體釋放大量ROS，細(xì)胞通透性增加，大量凋亡因子釋放，卵泡細(xì)胞損傷凋亡[20]。線粒體靶向抗氧化劑SS31可以靶向定位和聚集于產(chǎn)生ROS的場所——線粒體內(nèi)膜，減少線粒體ROS的產(chǎn)生，減少細(xì)胞凋亡[21]。與其他抗氧化劑不同，SS31可以不依賴膜轉(zhuǎn)運蛋白及受體自由滲透細(xì)胞，穿越線粒體膜，SS31攝取不受線粒體電位的驅(qū)動，甚至可以被去極化的線粒體攝取[22]。由于其抗氧化、抗凋亡特性，SS31在阿爾茨海默氏病[23]、帕金森氏病[24]、動脈粥樣硬化[25]、缺血再灌注損傷[26]、阻塞性腎病[27]等方面的研究均顯示具有積極作用。本實驗研究SS31對于卵巢組織冷凍復(fù)蘇的影響。

本試驗在卵巢組織冷凍復(fù)蘇液中分別添加5 μM SS31、10 μM SS31、20 μM SS31、40 μM SS31。在HE染色中觀察到，隨著添加SS31濃度的升高，卵巢組織學(xué)形態(tài)變化可見一定改善，當(dāng)SS31濃度達(dá)40 μM時差異最顯著。與此同時，本試驗中各組卵巢組織中原始卵泡數(shù)量最多，占比最大，一方面可能與它本身數(shù)量龐大有關(guān)，另一方面由于原始卵泡體積小，代謝低，對于缺血缺氧的耐受力更強，更不易受冷凍復(fù)蘇的影響。各組中次級卵泡和竇卵泡數(shù)目的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能由于卵巢組織冷凍保存時，組織中不同類型的細(xì)胞對降溫和復(fù)蘇速率及冷凍保護(hù)劑的濃度有不同需求，從而導(dǎo)致影響程度不同。盡管對于次級卵泡和竇卵泡數(shù)量的影響并不顯著，但仍然反映了在目前的技術(shù)條件下，冷凍損傷難以避免。而如何避免冷凍損傷，目前還沒有最優(yōu)的玻璃化冷凍方案。下一步還需要通過反復(fù)建立卵巢組織冷凍的模型來進(jìn)一步探討不同冷凍方案的效果。

TUNEL檢測中，新鮮卵巢組織雖未經(jīng)冷凍復(fù)蘇過程，但由于卵巢離體后的缺血缺氧和氧化應(yīng)激損傷，也呈現(xiàn)一定程度的細(xì)胞凋亡。凍融卵巢組織隨著SS31濃度的增加，卵泡損傷率、卵泡凋亡率下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明SS31在卵巢組織冷凍復(fù)蘇過程中可能具有降低卵泡凋亡、提高卵泡存活率的作用。

不同發(fā)育階段的卵泡是由多個細(xì)胞器構(gòu)成，包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等，這些細(xì)胞器具有不同功能，是細(xì)胞代謝和細(xì)胞活力的形態(tài)支柱。其中，線粒體作為一個重要的細(xì)胞器，其完整的形態(tài)是維持功能的前提。研究顯示，SS31可抑制線粒體膜通透性的改變和線粒體膜電位的降低，防止線粒體腫脹[28]。同時，SS31還可以快速干預(yù)老齡小鼠骨骼肌線粒體能量代謝狀態(tài)，增強線粒體功能[29]。基于SS31對其他器官和組織線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改善作用，在本試驗中，我們利用透射電鏡技術(shù)觀察組織超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，不含SS31的CONTROL組中線粒體數(shù)量顯著減少，大量線粒體腫脹，甚至呈空泡狀，隨著SS31濃度的增長，線粒體腫脹程度逐漸減輕，數(shù)量逐漸增多，當(dāng)SS31濃度達(dá)40 μM時這種改善最為明顯。遺憾的是，在本實驗中，對于線粒體功能的改善情況未進(jìn)行測定，需要后續(xù)實驗進(jìn)一步驗證。

本實驗結(jié)果表明SS31可減輕凍融家兔卵巢組織中卵泡的損傷，對于玻璃化冷凍和復(fù)蘇過程具有一定的保護(hù)作用。但本研究還存在一定的局限性，例如SS31的濃度梯度設(shè)置較小，未探究到最佳干預(yù)濃度，我們將在下一步實驗中探究SS31的最佳干預(yù)濃度和其作用機制。